水稻卷叶基因URL1及应用的制作方法

本发明涉及生物技术和植物遗传育种领域，具体地说，涉及水稻卷叶基因url1及应用。
背景技术：
：中国是世界上最大的水稻产区，同时也是水稻消费大国。与此同时，我国正面临着人口逐渐增长与可耕种面积逐年下降的严峻局面。解决食物短缺问题的唯一办法，是提升单位面积作物的产量。保证高质量的群体是提高水稻产量的前提条件之一，培育合适的单株株型是改善群体质量的有效方法。水稻叶片的表型特征，比如大小与形态，是植物株型的重要组成部分。合适的叶片形态有利于水稻产量的提升，适度卷曲的叶型(v型叶)就是其中之一。叶片的适度卷曲增加水稻群体的透光率与叶片对光的截获能力，促进干物质的积累与有效的气体交换，缓解叶片的光照辐射，在干旱条件下能降低蒸腾速率。水稻大叶脉或小叶脉中的维管束组织、角质层及上表皮的泡状细胞是导致叶片发生卷曲的主要细胞类型。泡状细胞位于单子叶植物(除了沼生目)叶片近轴面维管束之间，是特化的表皮细胞。研究表明当泡状细胞失水时，细胞总体积减小，细胞膨压降低，可造成叶片的卷曲；相反，一旦水分胁迫缓解，泡状细胞即恢复到正常状态，叶片再次展平。水稻株型改良是提高水稻群体光合效率和水稻总产量的有效途径之一。水稻叶片卷曲有利于塑造理想株型，目前已经克隆到一些调控水稻卷叶的基因，然而卷叶基因发掘的数量和质量还远远不能满足作物分子育种的需求。因此有必要发掘新基因，对影响水稻卷叶的基因和作用机制进行深入研究，从而为定向调控水稻叶型提供新的技术途径。技术实现要素：本发明的目的是提供水稻卷叶基因url1及应用。从而为优化水稻株型提供新的技术手段。为了实现本发明目的，本发明人对ems(甲磺酸乙酯)诱变的粳稻品种日本晴进行了研究，得到叶片卷曲突变体url1(upperwardrolledleaf1)，该突变表型是由一对半显性基因控制的。url1突变体中，基因url1的3’utr全长为732bp(seqidno:4)，其中第679个碱基(n)发生了突变(c突变成了t)。该基因的纯合突变体主要表型为叶片向内卷曲，卷曲指数在0.53～0.67之间；杂合突变体为半显性，卷曲指数在0.44-0.48之间；叶片直立指数增加，使群体更加通风透光。另外，突变体两维管束之间泡状细胞的个数与表面积均低于野生型。url1基因在叶片与根中表达量较高。第一方面，本发明提供水稻卷叶基因url1，其核苷酸序列为：i)seqidno:1所示的核苷酸序列；或ii)seqidno:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与seqidno:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。其中，ii)～iv)的核苷酸序列中，在与i)的核苷酸序列第3749位等同位置处的碱基为t。基因url1的cds序列如seqidno:3所示，其所编码蛋白的氨基酸序列如seqidno:2所示；应当注意的是，seqidno:2所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列也属于本发明的保护范围。例如，在非活性区段的碱基改变、缺失，均不会影响蛋白的功能。第二方面，本发明提供含有所述基因url1的生物材料，所述生物材料为表达盒、表达载体、克隆载体、工程菌或非可再生的植物部分。携带有所述目的基因的表达载体可通过使用ti质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(weissbach，1998，methodforplantmolecularbiologyviii，academypress，newyork，第411-463页；geiserson和corey，1998，plantmolecularbiology，2ndedition)。进一步地，本发明提供含有所述基因url1的表达载体，所述表达载体可以是将url1基因克隆进真核表达载体获得的，例如所述真核表达载体可以为pcambia1305.1。本发明还提供含有上述表达载体的宿主。可选的所述宿主为水稻。第三方面，本发明提供所述基因url1或含有所述基因的生物材料在调控植物叶型中的应用。本发明中，所述植物为单子叶植物，优选水稻。第四方面，本发明提供所述基因url1或含有所述基因的生物材料在制备转基因植物中的应用。第五方面，本发明提供所述基因url1或含有所述基因的生物材料在植物育种中的应用。所述育种的目的为调控植物叶型。第六方面，本发明提供所述基因url1或含有所述基因url1的表达载体在水稻株型改良中的应用。所述应用包括将含有url1基因的质粒转染水稻细胞从而培育获得转基因植株。所述水稻株型改良包括通过调控水稻泡状细胞发育进而控制水稻叶型。第七方面，本发明提供一种提高植物叶片卷曲程度的方法，所述方法包括：1)使植物包含所述基因url1；或2)使植物过表达所述基因url1。所述方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。第八方面，本发明提供一种鉴定植物的方法，其中所述植物是包含所述基因url1的水稻，或包含上述生物材料的水稻，或者由上述方法获得的水稻，其包括如下步骤：测定所述植物是否包含所述基因url1。第九方面，本发明提供与水稻卷叶性状相关的snp标记，所述snp标记位于如seqidno:1所示的水稻卷叶基因url1上，其中snp位点为3749bp处碱基，也即，基因url1的3’utr(seqidno:4)第679位碱基。该处碱基为c或t。该处碱基为t的水稻叶片卷曲程度高于该处碱基为c的水稻叶片卷曲程度。第十方面，本发明提供所述与水稻卷叶性状相关的snp标记在水稻分子标记辅助育种中的应用。借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：(一)本发明首次提供水稻卷叶基因url1，url1基因具有通过调控水稻泡状细胞发育进而影响叶型的功能，因此该基因具有对常规水稻和杂交水稻株型进行定向设计的潜力。(二)通过观察url1突变体的表型，发现url1基因突变后会直接影响泡状细胞的发育，进而使叶片卷曲。url1过量表达载体转化野生型水稻日本晴，发现转基因植株表现出与突变体相似的卷叶表型，因而url1基因可以直接调控泡状细胞发育而被应用于水稻叶型的控制，以提高水稻生产力。附图说明图1为本发明实施例1中url1突变体与野生型日本晴的叶片表型与单株产量数据。其中，a：植株；b：叶片；c：叶片横切(wt:平展，f1:半卷，url1:卷曲)，bars＝15cm(a),5cm(b)，1mm(c)；d：穗型，bar＝5cm；e：叶片卷曲指数；f：叶片直立指数；g：穗长；h：每穗粒数；i：结实率。图2为本发明实施例2中url1突变体与野生型日本晴叶片中泡状细胞表型。其中，a-b：野生型及突变体叶片近轴面近大脉泡状细胞；c-d：野生型及突变体叶片近轴面近小脉泡状细胞(lv：大脉，sv：小脉，bc：泡状细胞)，bars＝50μm(a-d)。e-g：野生型水稻叶片横切面泡状细胞；h-j：url1突变体叶片横切面泡状细胞(ad：近轴面，ab：远轴面)，bars＝100μm(e和h)，50μm(f-g,i-j)；k-l：野生型与url1叶片泡状细胞数目与面积，**p<0.01。图3为本发明实施例2中url1突变体与野生型日本晴叶片中叶绿素含量的测定。其中，url1突变体中叶绿素a、叶绿素b与类胡萝卜素含量均略高于野生型日本晴，*p<0.05。图4为本发明实施例3中url1基因定位与结构图。其中，a：url1的图位克隆、url1基因结构与突变位点，(黑色框代表编码区，白色框代表3’utr，直线代表内含子)；b：url1在野生型、f1及突变体中表达量，*p<0.05；c：url1蛋白结构。图5为本发明实施例4中载体pcambia1305.1::gus(表达载体purl1：：gus)的结构示意图。图6为本发明实施例4中url1基因在水稻各组织中表达模式分析。其中，a：url1在不同植物组织中表达量；b-l：利用gus染色观察url1在不同组织中表达情况，bars＝2.5mm(b-e),1mm(f,gandi),5mm(h)。图7为本发明实施例5中载体pcambia1305.1(载体pcambia1305.1::url1)的结构示意图。图8为本发明实施例5中purl1::gurl1转化野生型日本晴后表型与url1突变体一致。其中，a与b：野生型，突变体以及两个以野生型日本晴为背景的过表达转基因株系(purl1::gurl1)叶片表型，bars＝0.4cm；c-d：转基因植株叶片卷曲指数及url1基因表达量检测，lri，叶片卷曲指数，**p<0.01。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。以下实施例中使用的水稻(oryzasativa)品种日本晴，水稻卷叶突变体url1均来自中国农业科学院作物科学研究所李学勇课题组。实施例1突变体的获得与表型分析对ems化学诱变的粳稻品种日本晴进行筛选，获得卷叶突变体url1(upperwardrolledleaf1)。突变体url1表型主要表现在叶片卷曲(图1a-c)，在成熟期(大田)测量突变体的卷曲度(leafrollingindexvalues,lris)，发现不同突变体植株叶片卷曲指数在0.53～0.67之间(图1e)；而野生型日本晴的叶片在生长发育过程中，lris几乎接近为0，从始至终都表现为平展。通过测量url1突变体叶片直立指数(leaferectionindexvalues,leis)，发现url1(95.5％to99.3％)叶片的直立指数比野生型(91.81％to94.40％)高(图1f)。本发明还比较了野生型和突变体的穗部性状(图1d)，包括穗长(wt:20.46cm；url1：21.18cm)、每穗粒数(wt:139.11个；url1:139.22个)、有效结实率(wt:94.14％；url1:93.16％)(图1g-i)，结果显示两者没有显著差异，说明在url1突变体中，叶片卷曲不影响水稻的穗部性状和育性，不会对最终产量造成负面效应。实施例2突变体细胞学表型分析利用甲苯胺蓝(toluidineblueo)对50天的成熟叶片上表皮进行染色。如图所示(图2a-d)，泡状细胞被染成了紫色，url1叶片的泡状细胞大小与数目均低于野生型。利用石蜡切片观察url1突变体叶片内部的细胞学变化。如图所示(图2e-j)，水稻叶片泡状细胞位于叶片上表皮的维管束之间，通过测量石蜡切片中泡状细胞个数与面积发现，突变体位于大侧脉与小侧脉两维管束之间的泡状细胞个数与表面积均比野生型小(图2k-l)。url1叶片的泡状细胞除了数量和面积均低于野生型外，叶片的其他细胞类型与结构并没有发现明显差异。url1叶片内卷是由泡状细胞的数量和面积同时降低造成的。通过测定url1突变体与野生型日本晴叶片中叶绿素(叶绿素a、叶绿素b与类胡萝卜素)含量发现，url1突变体中叶绿素各成分含量均略高于野生型日本晴，其中类胡萝卜素及叶绿素a+b含量在突变体与野生型中的差异达显著水平(图3)。实施例3水稻url1基因的获得经过多代自交，确认url1纯合突变体能稳定遗传，url1与籼稻dular杂交，f1代表现半卷表型，f2代发生性状分离。分离比为1:2:1，符合孟德尔遗传规律。因此，url1突变表型是由一对半显性基因控制。以url1与dullar杂交后f2分离群体作为定位群体，在f2突变单株中选取l0株提取dna，构建混池，发现在第6染色体上的两个标记m1与m6之间，表现出连锁，通过连锁分析，明确目标基因与两个标记均连锁。用m1与m6继续扩增f2代中卷叶突变体，分别筛选出11株交换个体，其中没有重复单株，初步证明目的基因位于两标记之间。继续开发标记，在m3与m4分别只有2株交换个体，表明该基因位于m3与m4之间，范围为53kb(图4a)。根据水稻基因组注释系统网站(theinstituteforgenomicresearch；http://rice.plantbiology.msu.edu/)搜索该区间内的基因，发现共有2个开放阅读框。其中一个候选的注释基因编码某功能未知的蛋白，另一个基因os06g10600编码一个转录因子(hd-zipiv基因家族的一员)。通过对野生型和突变体水稻中这两个基因进行测序比对发现，在os06g10600终止密码子后的第679个碱基发生了突变(c突变成了t)。将os06g10600命名为url1(upwardrolledleaf1)，为了研究突变位点是否在url1的3’utr区域，利用3’race技术扩增url1基因的3’utr，获得了url1基因的3’utr全长，发现其全长为732bp，因此确定该突变位点(url1终止密码子后的第679个碱基)位于url1的3’utr区域。最终，url1作为候选基因，进入后续功能验证与分析。为了解url1在野生型与url1突变体中表达差异，rt-pcr荧光定量被用来测定url1表达量。结果显示,在url1中url1的表达量明显高于其在野生型中表达量(图4b)。利用网站预测的基因序列，分别在基因起始密码子和终止密码子处设计正反向引物，克隆得到url1基因，通过测序发现url1cds全长2133bp(seqidno:3)，含有10个外显子，编码710个氨基酸(图4c)。所用引物序列如表1所示。表1url1正向引物(5′→3′)反向引物(5′→3′)m1caccttttgtctaatcaaatcagttttctttggtgctgaaagtatgtaagam2gcaaccacgaagaactgtagccattcgcacgactctagacm3ggttcttccagtaaggtgataaagacactcctcagatgcgm4cgtatgcacgccatatcctaacacgaccttggcaacaaacm5tcagatcccccagactgaaatatcagactactccctccgtm6gcacagttcgacaagagcaacctccgtttcacagtgtaagubiquitin(qrt)gacggacgcaccctggcgaactactgctgccaattaccatataccacgacurl1(qrt)ttcgtccgcgacgagaacactgtcgatcggcgagtacacc实施例4水稻url1基因表达模式为测试url1基因在水稻不同组织的表达水平，本试验采用real-timepcr的方法检测水稻不同组织的基因表达水平。其结果表明，url1在幼叶、成熟叶、叶鞘、茎、根、穗、颖片和种子中都能检测到表达，其中在根、叶鞘、幼叶中表达较高，在老叶和种子中相对较低(图6a)。为了进一步验证real-timepcr检测结果，构建purl1：：gus表达载体(载体pcambia1305.1::gus，图5)，转化野生型日本晴。转基因水稻gus染色结果与real-timepcr检测结果基本一致，在幼叶中表达量最高，随着叶片的成熟，最后几乎不表达(图6b-d)。另外，url1在叶鞘、根、茎、颖片中都有明显的表达(图6e-i)。所用引物序列如表2所示。表2实施例5purl1::gurl1载体转化水稻由qrt-pcr结果可知，url1突变体中url1基因表达量上升。为了进一步确认url1的突变表型确实是由于url1表达量上升导致，从url1中克隆得到突变的url1全长gdna核苷酸序列(包含2000bp启动子与1000bp3’utr区，其中包含突变位点)，利用该片段构建过表达载体purl1::gurl1。通过农杆菌介导法将载体purl1::gurl1(载体pcambia1305.1::url1，图7)导入野生型日本晴遗传背景诱导的愈伤组织中，测量t0代转基因植株卷曲指数后发现，其中2个株系植株叶片表现为与url1突变体叶片类似的卷叶(图8a-c)。利用qrt-pcr进一步验证t0代转基因植株表达水平，结果表明，url1的表达量在这些表现为卷叶的转基因植株中与在突变体中基本一致(图8d)。所用引物序列如表3所示。表3虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>中国农业科学院作物科学研究所<120>水稻卷叶基因url1及应用<130>khp181115438.2<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>3802<212>dna<213>水稻(oryzasativa)<400>1atggatttcggcgacgaacccgagggctccgacagccagcgccgccgcaagcgctaccac60cgccacacgcctcgccagattcagcagctcgaggcgtacgcgttttctctattttttttt120ctgctgttgttcttctatgtgttgttggctttcgtccgccatggcggcggcgccatggat180ggagggatgaaatggtgcgtgtgtttgtttcccgtgttgtgcaggatgttcaaggagtgc240ccccacccggacgagaaccagcgggcgcagcttagccgggagctcgggttggagccgagg300cagatcaagttctggttccagaatcgccggacccagatgaaggtaaattacaaggagaat360tccgattggttttcttgattgatcgatcgatcgccatggattccggcgtgcgtgcttgct420tccttccgttcgtttcttgcggggaggatgatgatatccatggtgtggggtttgctgttt480gcaggcgcagcacgagcgggcggacaactgcttcctccgcgccgagaacgacaagatccg540gtgcgagaacatcgccatccgcgaggccctcaagaacgtcatctgccccacctgcggcgg600ccctcccgtcggcgaggactacttcgacgagcagaagcttcgcatggagaacgcccgcct660caaggaagaggtaatgccccgcctccgccgccgccgccgccgccgtcgacgacgcggttt720gctttgctttgttgatgtttctgatgatgtgttttgttgcggtgttcgtccggcgaacgt780gcgagcagctggaccgcgtgtcgaacctgacgtcgaagtatctcggccggccgttcacgc840agctgccgccggcgacgccgccgatgacggtgtcgtcgctggacctgtccgtgggcggga900tgggcgggccgtcgctggacctggacctcctcagcggtggctcgtcggggatcccgttcc960agctgccggcgcccgtgtccgacatggagcggcccatgatggccgagatggccacgcgcg1020ccatggacgagctgatccgcctcgcgcaggccggcgaccacatctggtccaagagccccg1080gcggcggcgtgtccggcggcgacgcccgcgagaccctcaacgtcgacacctacgacagca1140tcttctccaagcccggcggctcgtaccgcgcccccagcatcaacgtcgaggggtcccgcg1200agtccggcctcgtgctcatgagcgccgtcgccctcgccgacgtgttcatggacacggtaa1260tcaagctgttcgacgccacaaccattctccattttgctcatttgattgattggttcatcg1320ccatcgcagaacaagtggatggagttcttcccaagcatcgtgtccaaagctcacaccatt1380gatgtgctcgtgaatggcatgggagggagaagcgagtccttgattctggtaaacccacat1440tgccattgccattgccattgcatcaatcgagcaaattcttttgtgagttttttccatttt1500gatcttgtgatgtttgtgttgtgggtgtagatgtacgaggagctgcacatcatgacgccg1560gccgtcccgacccgggaggtgaacttcgtccgctactgccggcagatcgagcaggggcta1620tgggccatcgccgacgtctccgtcgacctgcagcgcgacgcccacttcggcgcgccgccg1680ccgcgctcccgccggctcccttcggggtgcctcatcgctgacatggccaatggctactcc1740aaggtatacgcgatggacaatgtgccgcacgcaatggtgttttggtttcggctcgctgac1800gacgtcgcgcacgctcgcgtacgcgcaggtgacctgggtcgaacacatggaggtggagga1860gaagagcccgatcaacgtgctgtaccgtgacctcgtgctgagcggcgccgcgttcggggc1920gcaccgctggctcgccgcgctccagcgcgcgtgcgagcgctacgcctccctcgtcgcgct1980cggcgtcccgcaccacatcgccggtggtatgcacccgtcgagcgctcgacatcacagtcg2040tcgttgcgtttttctctcgccatgacactgacattgtccgggctcgccatggttgggcac2100gcagtgacgccggaggggaagaggagcatgatgaagctgtcgcagcggatggtgaacagc2160ttctgctcgagcctgggggcgtcgcagatgcaccagtggacgacgctgtcgggctccaac2220gaggtgagcgtccgcgtcaccatgcaccggagcacggaccccggccagcccaacggcgtc2280gtcctcagcgccgccacctccatctggctccccgtcccctgcgaccacgtcttcgccttc2340gtccgcgacgagaacacccgctcccaggtcagccatccactctctccgccattgatatcg2400ctcactcactcactgtgcccgccattgctgctgctgcagtgggacgtcctgtcgcacggc2460aatcaagtccaggaagtgtcgcgcatccccaacggctcaaacccggggaactgcatctcg2520ctgctaagagtaattagccctaattaaccctctccatgatcgcatctccaaaccttaaac2580ctcgaaatgccatgctgcggcgagtttaatgcgattacgtcgttaatggcgtcgtctcga2640tctgcagggcttgaatgcgagccagaacagcatgctgatactgcaggagagctgcacgga2700cgcgtcggggtcgctggtggtgtactcgccgatcgacatcccggcggcgaacgtc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