新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒多重荧光定量PCR检测引物、试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及一种病毒检测技术，具体涉及一种用于鉴定新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒的荧光定量pcr检测引物、探针组合物及检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术：

星状病毒属于星状病毒科(astroviridae)星状病毒属(astrovirus)，根据宿主不同分为两个属：哺乳动物星状病毒属(mamastrovirus)和禽类星状病毒属(avastrovirus)。禽星状病毒属现有3个属(avastrovirus1-3)，包括鸭星状病毒(duckastrovirus)、鸟肾炎病毒(aviannephritisastrovirus)、火鸡星状病毒(turkeyastrovirus)等，火鸡星状病毒是其代表种。星状病毒是单股正链、无囊膜的小rna病毒，其基因组长度大约6.8kb，，从5′端至3′端共包含4部分：1个85个核苷酸的5′端非编码区、3个开放阅读框(openreadingframes,orfs)(orf1a、orf1b、orf2)、1个80个核苷酸的3′端非编码区、1个30个核苷酸的多聚腺苷酸尾巴。2017年以来，我国山东、江苏、河南、广东及安徽等地的雏鹅群中陆续出现以内脏出现尿酸盐沉积和关节痛风为主要症状的传染性疾病，该病主要发生于20日龄以内的雏鹅，死亡率高达30％～50％。给我国的养鹅业造成巨大的经济损失。经病原学鉴定，引起雏鹅出现痛风症状的病原为新型星状病毒。

鹅副黏病毒病的病原为鹅黏病毒(gooseparamyxovirus，gpmv)，属副黏病毒科副黏病毒属。病毒广泛存在于病鹅的内脏器官内(脾脏、肝脏、肠管等)。在电子显微镜下观察，病毒颗粒大小不一(平均直径为120纳米)，形态不正，表面有密集纤突结构，病毒内部由囊膜包裹着螺旋对称核衣壳。分离的毒株接种10日龄发育鸡胚后能迅速繁殖，鸡胚在接种后2～3天死亡。鹅黏病毒能凝集鸡的红细胞，人工感染鸡可引起死亡。根据流行特点、临床症状和病理变化，可以作出初步诊断。确诊则需要进行病原诊断。

鹅细小病毒(gooseparvovirus，gpv)是小鹅瘟的病原体。自1965年以来，许多国家曾报道了鹅细小病毒(gpv)病。小鹅瘟的临床特征主要以败血性病变表现为主，根据病程的长短分为最急性、急性和亚急性三种类型。该病具有传播速度快、发病率和死亡率较高的特点。目前，小鹅瘟病的流行爆发还很难控制，一旦发生流行小鹅瘟这种传染病，会给养鹅业造成巨大的经济损失。

随着分子生物技术的快速发展，针对病原微生物的核酸建立很多检测方法，这包括pcr检测技术、核酸探针杂交技术、环介导等温扩增技术(lamp)等。其中pcr技术是分子生物学重要研究手段之一，该方法省时，简便，经济实用，大大提高了临床样品的检测效率。在单重pcr的基础上，建立了多种新型的pcr技术，如多重pcr技术、实时荧光定量pcr技术、多重荧光定量pcr技术、反转录pcr技术等。其中，实时荧光定量pcr被公认为pcr诊断技术的一次质的飞跃。荧光定量pcr技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对pcr产物进行标记跟踪，实时监控反应过程。随着pcr反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，结合相应的软件分析，可以得到荧光扩增曲线，计算待测样品初始模板的量。目前没有使用多重荧光定量pcr方法来同时检测新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒的记载。

技术实现要素：

为了解决以上现有技术中未有使用多重荧光定量pcr方法来同时检测新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒的记载，本发明以新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒三种病毒为研究对象，建立了多重荧光pcr检测方法。

本发明提供了一种新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒多重荧光定量pcr检测引物对及特异性探针。

本发明还提供了一种新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒多重荧光定量pcr检测试剂盒。该试剂盒具有高度的特异性与专一性，并且扩增效率高，灵敏度高，准确率高，重现性好，检测周期短，且能实时检测dna扩增反应，具有很高的可行性与应用前景。

本发明的另一个目的是提供上述检测引物对及特异性探针或检测试剂盒的应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：一种用于鉴定新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒的荧光pcr检测试剂盒，它包括新型鹅星状病毒特异引物对与探针、鹅副黏病毒特异引物对与探针、鹅细小病毒特异引物对与探针，其中：

新型鹅星状病毒的特异检测引物对及特异性探针为：

goast-qf：5’-acggactggacgcgttatga-3’；

goast-qr：5’-tggccacttggatttccctt-3’；

goast-probe：5’-fam-cctctcttctggcggatacg-mgb-3’；

鹅副黏病毒的特异检测引物对及特异性探针为：

gpmv-qf：5’-tggtatcatatcgcaaaatt-3’；

gpmv-qr：5’-cattgcacgaatgtctatct-3’；

gpmv-probe：5’-fam-tggagaagctgtatccctga-mgb-3’；

鹅细小病毒的特异检测引物对及特异性探针为：

gpv-qf：5’-gcaagactgtaacgaatgaa-3’；

gpv-qr：5’-ctccaagaacatccagatct-3’；

gpv-probe：5’-fam-aaacactactacagctccta-mgb-3’。

含有上述新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒多重荧光定量pcr检测引物对及特异性探针的用于同时检测新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒的检测试剂盒。

所述的新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒多重荧光定量pcr检测引物对及特异性探针所述的检测试剂盒在检测水禽新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒和鹅细小病毒的单一感染或混合感染中的应用。

所述的应用，优选提取待检测样品组织中的病毒dna和rna，将所述rna反转录为cdna，利用所述新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒多重荧光定量pcr检测引物对及特异性探针对所述病毒dna和cdna进行扩增。

进一步的，本发明的荧光定量pcr检测试剂盒，其中各引物终浓度为0.1～0.5μm，各探针终浓度为0.05～0.25μm。

进一步的，本发明的荧光定量pcr检测试剂盒，它还包括：2×taqmanmastermix、dna模板和双蒸水。

进一步优选的，上述的荧光定量pcr检测试剂盒，其16μlpcr扩增体系为：2×taqmanmastermix，各引物终浓度为0.1～0.5μm，各探针终浓度为0.05～0.25μm，0.5～50ng/μl的dna模板2μl，双蒸水补足16μl，其配制方法如表1所示。

表1pcr反应扩增体系

进一步的，上述的荧光定量pcr检测试剂盒还包括新型鹅星状病毒阳性对照品、鹅副黏病毒阳性对照品、鹅细小病毒阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。

本发明还提供了一种用于鉴别新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒和鹅细小病毒的检测方法，具体步骤如下：

1、提取待检样品的模板rna或dna；

2、pcr扩增

使用上述的荧光定量pcr检测试剂盒进行pcr扩增，扩增程序：95℃，2min；94℃，10s；59℃，10s，在此收集荧光信号；72℃，40s，40个循环，设立阳性对照、阴性对照及空白对照。实时荧光定量pcr反应体系由16μl的反应体系组成，反应在abi7500荧光定量pcr仪上进行，每个样品做三次平行实验。反应中的ct值数据的采集采用校正的阈值设定，选用绝对定量的实验方法进行实时荧光定量pcr反应，软件自动生成标准曲线，根据输入的标准品的拷贝数自动计算其他样品的拷贝数。

本发明的有益效果：

本发明建立的多重荧光定量pcr特异检测引物对及特异性探针可准确检测水禽新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒的单一或混合感染，具有高度的特异性与专一性，并且扩增效率高，灵敏度高，准确率高，重现性好，检测周期短，能在1.5小时内完成检测，具有很高的可行性与应用前景，为病原微生物鉴定和降低养殖经济损失提供科学可靠的方法，在病毒鉴别领域具有重要优势。

附图说明

图1为新型鹅星状病毒的扩增曲线图；

图2为新型鹅星状病毒分别为200ng、20ng、2ng、0.2ng、0.02ng、0.002ng、0.0002ng、0.00002ng时的灵敏度扩增曲线图，从图中可以看出，其最低检出限为0.00002ng；

图3为鹅副黏病毒的扩增曲线图；

图4为鹅副黏病毒分别为200ng、20ng、2ng、0.2ng、0.02ng、0.002ng、0.0002ng、0.00002ng时的灵敏度扩增曲线图，从图中可以看出，其最低检出限为0.00002ng；

图5为鹅细小病毒的扩增曲线图；

图6为鹅细小病毒分别为200ng、20ng、2ng、0.2ng、0.02ng、0.002ng、0.0002ng、0.00002ng时的灵敏度扩增曲线图，从图中可以看出，其最低检出限为0.00002ng。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，以下说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

本发明中所用的实验材料、试剂与仪器：

1、实验材料：鹅副黏病毒(gpmv)、本发明中所检测的新型鹅星状病毒(goast)、鹅细小病毒(gpv)、鹅流感病毒、鹅坦布苏病毒、鹅星状病毒gsfj2017株、鹅星状病毒castv-8株。

2、主要试剂离心柱型病毒dna/rna提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；hiscriptcdna第一链合成试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；引物与探针由abi公司的primerexpresssoftwarev2.0设计，由华大基因公司合成。

3、所用仪器：abi7500荧光定量pcr仪为abi公司产品，pcr仪为bio-rad公司产品，5424d型高速离心机为eppendorf公司产品。

实施例1

1.1引物设计与合成

序列参照genebank数据库中各目的基因的序列，设计3组能扩增3种鹅病原的特异性引物及探针，引物及探针由abi公司的primerexpresssoftwarev2.0设计，由华大基因公司合成，置-20℃保存备用。

3组引物及探针的核苷酸序列如下表2所示：

表2引物及探针的核苷酸序列

1.2病毒核酸提取和cdna合成

利用easypureviraldna/rnakit(离心柱型病毒dna/rna提取试剂盒)分别提取三种病毒dna/rna，用hiscriptcdna第一链合成试剂盒对三种病毒rna进行反转录：采用40μl体系，于ep管中依次加入rna模板16μl、随机引物2μl、2×rtmix20μl、hiscriptenzymemix2μl，总体积共40μl，置于pcr仪中进行cdna合成，以25℃5min、50℃45min、85℃5min、4℃5min的程序进行一个循环，cdna合成后-20℃保存备用。

1.3荧光定量pcr反应条件的优化

反应体系见表3。

表3rt-pcr反应扩增体系(16μl)

1.4荧光定量pcr扩增条件为：95℃2min；94℃10s，59℃，10s，72℃40s，40个循环。

1.5试剂盒的特异性试验

应用该试剂盒进行特异性试验，分别以新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒、鹅流感病毒(h5亚型、h7亚型、h9亚型)、鹅坦布苏病毒、鹅星状病毒gsfj2017株、和鹅星状病毒castv-8株为模板，使用该试剂盒，采用优化的pcr反应条件进行荧光定量pcr，结果发现，只有新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒和鹅细小病毒能够有效扩增，见附图1、3、5，鹅流感病毒、鹅坦布苏病毒、鹅星状病毒gsfj2017株、和鹅星状病毒castv-8株均不能有效扩增，说明本研究所设计的探针及引物具有较强的特异性。其结果见表4。

表4特异性验证试验

1.6应用该试剂盒进行敏感性试验

将新型鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒的标准品的基因组分别定量到10ng/μl，按10×梯度稀释，每个梯度均取2.0μl为模板量，(即：20ng、2ng、0.2ng、0.02ng、0.002ng、0.0002ng、0.00002ng)进行实时荧光定量pcr检测，评估本发明的检测限。见图2、图4和图6，结果表明本方法在样品浓度稀释到0.00002ng时也有极好的线性关系，表明该试剂盒具有极高的灵敏度。

1.7临床样品的检测

对山东、河南、江苏地区鹅群收集100份临床样品进行检测，采集死亡鹅样品的肝脏、肾脏组织，与生理盐水按照1:3的比例进行研磨后离心，使用离心柱型病毒dna/rna提取试剂盒提取病毒的dna/rna，采用最佳的荧光定量pcr反应条件进行反应，计算阳性率。同时使用常规pcr方法进行检测。结果如下表5所示：检测出gpmv13份(阳性率为13％)，goast8份(阳性率为8％)，gpv10份(阳性率为10％)，其中gpmv和gpv混合感染病例2例；利用常规单一pcr方法，对同一组临床样品进行检测，同样地，检测出gpmv13份(阳性率为13％)，goast8份(阳性率为8％)，gpv10份(阳性率为10％)，其中gpmv和gpv混合感染病例2例。两者结果的符合率为100％。

表5

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。