本发明属于以等温扩增为代表的分子生物学检测方法在呼吸道合胞病毒检测方面的应用，即呼吸道合胞病毒的环介导等温扩增检测方法和试剂盒。
背景技术：
呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytialvirus,rsv）是临床常见的、重要的呼吸道病毒（virusesassociatedwithrespiratoryinfections），形态为球形，基因组为线性、不分节段的单链rna（ssrna），病毒体有包膜，膜上有刺突，由糖蛋白组成，无血凝素（hemagglutinin,ha）和神经氨酸酶（neuraminidase,na）。根据病毒表面蛋白抗原的变异，可将rsv分为两种类型：rsva型和rsvb型。
呼吸道合胞病毒肺炎（respiratorysyncytialviruspneumonia）简称合胞病毒肺炎，由呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytialvirus,rsv）引起的一种小儿常见的间质性肺炎，多发生于婴幼儿。由于母传抗体不能预防感染的发生，出生不久的小婴儿即可发病，但新生儿较少见。国外偶有院内感染导致产科医院新生儿病房爆发流行的报道。该病的诊断主要根据病毒学及血清学检查结果，但传统的病毒分离培养方法操作复杂、特异性不高、阳性率较低。
近年来，分子生物学方法不断被应用到流感病毒的快速检测中，流感病毒的实验室诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了流感病毒实验室诊断的发展方向。相对于传统的实验室检测法，分子诊断技术具有无可比拟的检测速度、特异性和灵敏度，已成为实验室诊断的新标准。
其中，环介导等温扩增法具有检测灵敏度高、结果判断直观，且不需要荧光定量pcr仪等价格昂贵的设备等优点，具有广泛应用前景。
环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)是一种新型等温核酸扩增技术，具有快速、简便、经济、灵敏等优点，目前已被广泛应用于核酸快速检测领域。lamp的原理是针对靶基因上6个区域设计2对引物(fip[f1c+f2]、bip[b2+b1c]、f3、b3)，在链置换型dna聚合酶的作用下，于等温条件在短时间内(30~90min)进行核酸扩增。在反应过程中，当一个dntp分子结合到dna链上时会解离下一个焦磷酸根离子，后者与镁离子结合形成大量副产物——焦磷酸镁，反应结果无需电泳检测，肉眼可见白色沉淀，加入荧光染料后可观察到绿色荧光。与传统pcr相比，lamp具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果判定简单、成本低廉等特点。lamp检测灵敏度至少比普通pcr高出2个数量级。此外，等温扩增仅需一个水浴锅或恒温装置，对设备的要求简单，其操作过程耗时较短，可在1小时内完成。lamp反应结果的检测不需要像普通pcr进行凝胶电泳，只需通过肉眼观察白色浑浊或者绿色荧光即可，是一种高效、简便、快捷、高通量的检测方法。
因此，开发一种针对呼吸道合胞病毒的环介导等温扩增试剂盒具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于：提供一种用于呼吸道合胞病毒核酸检测的方法；另一目的在于提供一种用于该方法的试剂盒。
1.呼吸道合胞病毒的lamp检测专用引物
根据呼吸道合胞病毒基因组特异性保守序列，应用在线引物设计软件primerexplorerv5，上传靶序列后，即可初步得到多组引物序列。
根据lamp引物设计的关键因素，主要包括引物末端的稳定性、gc含量、引物间的距离和二级结构对其进行筛选，最终得到的lamp引物。具体来说，为了在反应中能使f1c和b1c更加容易弯转，可以形成双茎环结构，引物f1c和b1c要高于其他几条引物的tm值5℃左右。为提高核苷酸越与模板退火结合效率，每条引物最末端的六个碱基自由能⊿g值≤-4kcal/mol，f3/b3，f2/b2，lf/lb的3’末端⊿g值≤-4kcal/mol，f1c和b1c的5’端的⊿g值≤-4kcal/mol。对于引物的gc含量设定范围在40%~60%之间。对于引物之间的距离，从f2的5’端到b2的5’端应在120~180bp之间，从f2的5’端到f1c的3’端也就是茎环段在40~60bp之间，从f2的5’端到f3的3’端在0~20bp之间。最后要特别注意引物之间不能形成二级结构。通过以上设计原则筛选即得到最终引物如下。
f3:5’-atattcatagcctcgcaaac-3’；
b3:5’-tggtatgatcgaagttgttgt-3’；
fip:5’-ttgcatcttgtatgattgcacaaagtcacactaacaactg-3’；
bip:5’-gccttgatgtagtgttaggtctgtctaacctcttcgac-3’。
2.呼吸道合胞病毒的lamp检测方法
本发明所提供的呼吸道合胞病毒的lamp检测方法，主要包括以下步骤：
[1]核酸提取：使用上海复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法核酸提取试剂（核酸提取及纯化试剂（体液rna））对待测样本进行核酸提取。
[2]lamp扩增
以上述提取的待测物核酸为模板，在专用引物的介导下进行扩增。其中，lamp反应体系（30μl）包括：待测样本的基因组rna12μl，20mmtris•hcl(ph8.8)，10mmkcl，10mmmgso4，10mm(nh4)2so4，0.1%tween20，1mbetaine，1.5mmdntpeach，9ubstdnapolymerase，9u逆转录酶，引物用量为：6pmolf3和b3，48pmolfip和bip。逆转录反应设置为50℃15min；lamp扩增条件可设定为54~68℃恒温反应30~90min(推荐设置62℃恒温反应60min)。
[3]结果判定
1)肉眼观察
反应结束后，肉眼观察产物是否浑浊。与阴性对照相比，明显出现浑浊物的样本为阳性，阳性产物经离心后在试管底部出现沉淀物；若无浑浊现象，则为阴性标本。
2)荧光显色
反应结束后加入3μlsybrgreen（×100），在紫外光激发下观察结果，产物呈荧光绿色表示该样品存在呼吸道合胞病毒，颜色无变化表示待测样品中不存在呼吸道合胞病毒。
3)检测浊度
使用浊度测定仪器，可间接反应核酸扩增情况。阳性样品的浊度随反应时间的延长呈s型上升趋势，浊度无变化表示待检样品中不存在呼吸道合胞病毒。根据仪器功能不同，可检测实时浊度或终点浊度，评估反应前后浊度的变化来判断结果。
3.呼吸道合胞病毒的lamp检测试剂盒
本发明所提供的呼吸道合胞病毒的lamp检测试剂盒，包含有上述lamp检测的专用引物、主要试剂和反应参数，本发明具有以下优点：
[1]高特异性
4条引物对靶序列的6个特异区域的识别保证了lamp扩增的高度特异性，即lamp能够从相差仅一个核苷酸的基因标本中寻找出相应的靶序列进行扩增；
[2]高效扩增
灵敏度比普通pcr高约100倍；
[3]操作简便
只需将待检样品(靶核酸)和检测试剂置于约62℃恒温水浴锅中60min左右即可判断结果；
[4]结果直观
可通过肉眼、浊度仪判断或添加荧光指示剂观察结果。本发明可以在等温条件下简便快速(62℃恒温反应60min)、高效特异地检测到呼吸道合胞病毒。该法不需要复杂仪器，为呼吸道合胞病毒的检测提供了一个新的技术平台，尤其适用于人群筛查，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
具体实施方式
现以本发明技术方案为前提，列举出详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例子。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、用于对呼吸道合胞病毒进行lamp检测的引物设计
利用ncbi数据库检索获得呼吸道合胞病毒基因组特异性保守序列，应用在线引物设计软件primerexplorerv5，上传靶序列后，即可初步得到多组引物序列。根据lamp引物设计的关键因素，主要包括引物末端的稳定性、gc含量、引物间的距离和二级结构对其进行筛选，最终得到的lamp引物。
实施例2、用于呼吸道合胞病毒进行lamp检测方法的建立
用实施例1获得的用于对呼吸道合胞病毒进行lamp检测的引物对拭子样本核酸提取液进行lamp检测，具体操作步骤如下：
[1]反应体系
使用上海复星长征医学科学有限公司生产的磁珠法核酸提取试剂（核酸提取及纯化试剂（体液rna））对待测样本进行核酸提取，将提取产物作为模板，在实施例1获得的lamp专用引物的引导下进行等温扩增。其中，lamp反应体系（30μl）包括：含待测样本基因组rna12μl，20mmtris•hcl(ph8.8)，10mmkcl，10mmmgso4，10mm(nh4)2so4，0.1%tween20，1mbetaine，1.5mmdntpeach，9ubstdnapolymerase，9u逆转录酶，引物用量为：6pmolf3和b3，48pmolfip和bip。
[2]结果判定
反应结束后肉眼观察产物是否浑浊。与阴性对照相比，明显出现浑浊物的样本为阳性，阳性产物经离心后在试管底部出现沉淀物。若无浑浊现象，则为阴性标本。亦可在反应液中添加3μlsybrgreen（×100），在紫外光激发下观察结果，产物呈荧光绿色表示该样品存在呼吸道合胞病毒，颜色无变化表示待测样品中不存在呼吸道合胞病毒。或利用浊度仪监测反应中的浊度变化来判断结果，浊度上升表示待测样品中存在呼吸道合胞病毒(阳性)，浊度无变化表示待测样品为阴性。
实施例3、制备呼吸道合胞病毒的lamp检测试剂盒
将lamp反应发生混合物即lamp反应引物(1.2umf3和b3；9.6umfip和bip)、lamp反应酶（bstdna聚合酶3u/ul；逆转录酶3u/ul）、反应缓冲液(60mmtris•hcl(ph8.8)；30mmkcl；30mmmgso4；30mm(nh4)2so4；0.3%tween20；3mbetaine；4.5mmdntpeach、sybrgreen和阳性对照（含有呼吸道合胞病毒基因组特异性保守序列的慢病毒稀释液）共同包装，得到呼吸道合胞病毒的lamp检测试剂盒。
序列表
<110>上海星耀医学科技发展有限公司
<120>一种检测呼吸道合胞病毒的试剂盒
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
atattcatagcctcgcaaac20
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
tggtatgatcgaagttgttgt21
<210>3
<211>40
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
ttgcatcttgtatgattgcacaaagtcacactaacaactg40
<210>4
<211>38
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
gccttgatgtagtgttaggtctgtctaacctcttcgac38