老陈醋发酵过程中产酯酵母的筛选实验方法与流程

本发明涉及老陈醋产酯酵母的筛选方法，特别涉及老陈醋发酵过程中产酯酵母的筛选实验方法。

背景技术：

老陈醋作为中国著名的传统发酵醋，老陈醋发酵中代谢物的浓度和类型主要受微生物多样性的影响。然而，醋酸发酵过程中微生物群与代谢物之间的关联在以前的研究中尚未被分析，大多数研究主要集中在醋酸发酵过程中微生物群的动态变化或芳香族化合物的检测。老陈醋传统固态发酵是复杂的多种微生物生物转化过程，酵母在起重要作用。酵母的作用，大致分成两大类。一类是saccharomycescerevisiae，主要完成酒精发酵，具有较高发酵速率和发酵能力。另一类是non-saccharomyces，发酵效率较低，但能将原料中的前体物质转换成风味物质(如酯、酸、高级醇和醛等)，对发酵食品风味、质地和色泽的形成有着重要的作用。老陈醋主要通过传统固态发酵，利用特有的大曲作为发酵剂，因此确定老陈醋发酵大曲中微生物的组成，筛选出产酯量最大且有利于老陈醋香气形成的酵母作为试验菌种显得尤为必要。

现有的技术对于老陈醋的研究不能确定酵母菌影响老陈醋的最终化学和挥发性风味成分，老陈醋含酯量低，产品品质有待提高。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供老陈醋发酵过程中产酯酵母的筛选实验方法，本试验从老陈醋传统发酵过程中分离纯化得到产酯酵母菌菌株，经26srdna测序鉴定；采用顶空固相微萃取法结合气质联用技术对成品醋中的酯类物质进行分析，使用y2和y18可以增加香气化合物的形成，有助于老陈醋香气复杂性的产生，以期达到提高老陈醋含酯量，提高产品品质的目的，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

老陈醋发酵过程中产酯酵母的筛选实验方法，老陈醋酒醅取自老陈醋传统固态发酵生产过程中的酒醪，实验包括如下步骤：

s1：发酵第3d、4d、5d和6d的酒醅样品中分别筛选出3株、8株、5株和3株酵母菌，依次编号为y1-y19；

s2：菌株的筛选

准确称取10g酒醪置于90ml生理盐水中，28℃振荡培养30min，依次稀释至10^-5、10^-6，取100μl稀释液涂布于孟加拉红培养基，28℃培养48h。挑取具有典型酵母菌落特征的单菌落，划线分离纯化；将具有酵母细胞特征的菌株转入yepd斜面，4℃保存；酵母菌活化后接种到yepd琼脂培养基上，28℃恒温培养48h，观察菌落形态；在载玻片上滴加1滴0.05％美蓝试剂与少许菌体混匀，加盖玻片，显微镜下观察细胞形态；

s3：菌株产酯分析

将分离所得酵母菌活化，以3％的接种量接入含有80ml产酯发酵液中，28℃静置培养7d，测定发酵液中总酯含量，对照菌株为安琪酵母；

s4：酵母基因组dna提取

根据酵母基因组dna提取试剂盒操作说明提取酵母基因组dna，核酸蛋白测定仪nd-1000测定dna纯度、浓度，-80℃保存；

s5：引物设计与合成

参考genbank上已登录的代表菌株26srdna近5’端的d1/d2区域序列，利用primerpremier5.0软件设计1对特异性引物，交由公司合成；

s6：常规rt-pcr检测

以不同酵母基因组dna为模板，构建15μlpcr反应体系：正反向引物各0.6μl，基因组dna模板0.8μl，ddh2o5.5μl，2×estaqmastermix7.5μl；

s7：老陈醋小规模发酵

6.5kg冷水中加入10kg磨碎高粱，拌匀，润料14h后蒸3h；冷却至25℃，加入6.3kg磨细大曲和27kg冷水拌匀，酒精发酵；前3d敞口发酵，搅拌4次/d，降温，减少乙醇的蒸发，封口发酵18d。拌入麸皮11kg、谷糠7.5kg，分装至12个浅缸中醋酸发酵；每缸加入0.7kg醋种子；醋酸发酵持续9d，2次/d搅拌，加入5％的盐；取一半醋醅90℃加热5d，搅拌1次/d；另一半醅加水浸泡4h，溶解所有浸出液，加热至90℃以上，浸泡熏醅12h；

s8：食醋中常规理化指标分析

总酸、不挥发酸、还原糖、总酯和氨基酸态氮均依据国家标准国标gb/t19777-2013进行测定，所用试验所测参数均重复2次；

s9：挥发性香气成分测定

将醋样4℃10,000r/min离心10min，收集上清液，4℃保存备用；吸取8ml上清液置于20ml样品瓶中，加入0.6gnacl；采用顶空自动进样法进行挥发性香气成分测定；

s10：数据处理

所有数据均使用spss17.0软件进行分析，并表示为平均值±标准误，单因素方差分析用于确定数据的统计学差异，所有结果均以平均值±标准差表示。

进一步地，s5的引物序列为(5’-3’)：nl-1(gcatatcaataagcggaggaaaag)和nl-4(ggtccgtgtttcaagacgg)。

进一步地，s6的反应条件为94℃3min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环，72℃5min，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

进一步地，s7实验室条件下模拟老陈醋传统固态发酵工艺酿醋，酿出4种醋，发酵剂分别为：t1大曲，t2，t3，t4。

进一步地，t1大曲为对照组，t2为y2+大曲，t3为y14+大曲，t4为y18+大曲。

进一步地，s9的顶空自动进样法中的顶空进样器条件：振荡温度45℃，振荡时间2min，进样量2ml；gc分析条件：色谱柱为tr-5ms，进样口温度300℃，载气he，流速1ml/min，进样量350μl，分流比为20∶1，升温程序：起始温度40℃，保持3min，以3℃/min的速度升温至190℃，保持5min，以20℃/min的速度升温至270℃，保持5min；ms条件：电子轰击离子源，电子能量70ev，离子源温度250℃，传输线温度280℃，四极杆温度180℃，质量扫描范围m/z：35-500。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提出的老陈醋发酵过程中产酯酵母的筛选实验方法，本试验从老陈醋传统发酵过程中分离纯化得到产酯酵母菌菌株，经26srdna测序鉴定；并在其发酵过程中添加该产酯酵母，采用顶空固相微萃取法结合气质联用技术对成品醋中的酯类物质进行分析，结果显示：酵母菌影响老陈醋的最终化学和挥发性风味成分，y14产酯最大量的酵母，这些酯类有利于老陈醋的香气的形成，使用y2和y18可以增加香气化合物的形成，有助于老陈醋香气复杂性的产生，以期达到提高老陈醋含酯量，提高产品品质的目的，总之，y14的成品醋中酯类物质更为丰富，香味更浓郁。

附图说明

图1为本发明天然酵母菌的细胞形态特征图；

图2为本发明不同酵母菌株产酯能力测定结果对照图；

图3为本发明y2、y14、y18菌株26srdnad1/d2pcr产物凝胶电泳图图；

图4为本发明y2、y14、y18菌株同源性分析图；

图5为本发明老陈醋常规理化指标检测结果图；

图6为本发明老陈醋中不同酯类成分相对百分含量图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

老陈醋发酵过程中产酯酵母的筛选实验方法，老陈醋酒醅取自老陈醋传统固态发酵生产过程中的酒醪，实验包括如下步骤：

步骤1：发酵第3d、4d、5d和6d的酒醅样品中分别筛选出3株、8株、5株和3株酵母菌，依次编号为y1-y19；

步骤2：菌株的筛选

准确称取10g酒醪置于90ml生理盐水中，28℃振荡培养30min，依次稀释至10^-5、10^-6，取100μl稀释液涂布于孟加拉红培养基，28℃培养48h。挑取具有典型酵母菌落特征的单菌落，划线分离纯化；将具有酵母细胞特征的菌株转入yepd斜面，4℃保存；酵母菌活化后接种到yepd琼脂培养基上，28℃恒温培养48h，观察菌落形态；在载玻片上滴加1滴0.05％美蓝试剂与少许菌体混匀，加盖玻片，显微镜下观察细胞形态；

步骤3：菌株产酯分析

将分离所得酵母菌活化，以3％的接种量接入含有80ml产酯发酵液中，28℃静置培养7d，测定发酵液中总酯含量，对照菌株为安琪酵母；

步骤4：酵母基因组dna提取

根据酵母基因组dna提取试剂盒操作说明提取酵母基因组dna，核酸蛋白测定仪nd-1000测定dna纯度、浓度，-80℃保存；

步骤5：引物设计与合成

参考genbank上已登录的代表菌株26srdna近5’端的d1/d2区域序列，利用primerpremier5.0软件设计1对特异性引物，引物序列为(5’-3’)：nl-1(gcatatcaataagcggaggaaaag)和nl-4(ggtccgtgtttcaagacgg)，交由公司合成；

步骤6：常规rt-pcr检测

以不同酵母基因组dna为模板，构建15μlpcr反应体系：正反向引物(10μmol·l^-1)各0.6μl，基因组dna模板0.8μl，ddh2o5.5μl，2×estaqmastermix(含染料)7.5μl。反应条件：94℃3min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测；

步骤7：老陈醋小规模发酵

6.5kg冷水中加入10kg磨碎高粱，拌匀，润料14h后蒸3h。冷却至25℃，加入6.3kg磨细大曲和27kg冷水拌匀，酒精发酵(此时的物料叫醪)。前3d敞口发酵，搅拌4次/d，降温，减少乙醇的蒸发，封口发酵18d。拌入麸皮11kg、谷糠7.5kg，分装至12个浅缸中醋酸发酵(此时的物料叫醅)。每缸加入0.7kg醋“种子”(来自最后一批醋醅)。醋酸发酵持续9d，2次/d搅拌，加入5％的盐。取一半醋醅90℃加热5d，搅拌1次/d(此时的物料叫熏醅)；另一半醅加水浸泡4h，溶解所有浸出液，加热至90℃以上，浸泡熏醅12h，过滤称为“新醋”。敞口陈酿1年称为成品老陈醋。实验室条件下模拟老陈醋传统固态发酵工艺酿醋，酿出4种醋。发酵剂分别为：t1大曲(对照组)；t2(y2+大曲)；t3(y14+大曲)；t4(y18+大曲)；

步骤8：食醋中常规理化指标分析

总酸、不挥发酸、还原糖、总酯和氨基酸态氮均依据国家标准国标gb/t19777-2013进行测定，所用试验所测参数均重复2次；

步骤9：挥发性香气成分测定

将醋样4℃10,000r/min离心10min，收集上清液，4℃保存备用；吸取8ml上清液置于20ml样品瓶中，加入0.6gnacl；采用顶空自动进样法进行挥发性香气成分测定；采用顶空自动进样法：1)顶空进样器条件：振荡温度45℃，振荡时间2min，进样量2ml。2)gc分析条件：色谱柱为tr-5ms(30m×0.25mm，0.25μm)。进样口温度300℃，载气he，流速1ml/min。进样量350μl，分流比为20∶1。升温程序：起始温度40℃，保持3min，以3℃/min的速度升温至190℃，保持5min，以20℃/min的速度升温至270℃，保持5min。3)ms条件：电子轰击(ei)离子源，电子能量70ev，离子源温度250℃，传输线温度280℃，四极杆温度180℃，质量扫描范围m/z：35-500；

步骤10：数据处理

所有数据均使用spss17.0软件(spssinc.，usa)进行分析，并表示为平均值±标准误(s.e.m.)。单因素方差分析(anova)用于确定数据的统计学差异。所有结果均以平均值±标准差(sd)表示，p＜0.05表示有统计学意义。结果中相同字母表示差异不显著(p＞0.05)，不同字母表示差异显著(p＜0.05)。

通过以上的实验，以下进行本发明实验的结果分析。

(1)天然酵母菌菌株的初筛

从酒醅中进行酵母菌株筛选，通过菌种形态观察获得19株菌株(图1)。从发酵第3d、4d、5d和6d的酒醅样品中分别筛选出3株、8株、5株和3株酵母菌，依次编号为y1-y19。

(2)天然酵母菌产酯分析

皂化中和滴定法测定各菌株产酯能力结果如图2所示。y14、y2和y18酵母菌株产酯能力显著高于对照组和其他酵母菌株(p＜0.05)，产酯量分别为36.05g/l、33.75g/l、33.47g/l；发酵液澄清，发酵性状稳定，是比较理想的产酯酵母。

注：y1-y19：不同的酵母菌株；ck：对照组；相同字母表示差异不显著(p＞0.05)，不同字母表示差异显著(p＜0.05)。

(3)天然酵母菌菌株26srdna分子鉴定

rt-pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果显示，目的片段大小为500bp左右，无拖尾和引物二聚体(图3)。将特异性片段连接转化后测序，序列长度为514bp、516bp、534bp，blast分析结果显示(表1、图4)：y2、y18为candidaethanolica(乙醇假丝酵母)；y14为pichiamanshurica(毕赤酵母)。

表1菌株鉴定结果

(4)老陈醋常规理化指标检测结果

本试验中，对t1大曲(对照组)、t2(y2+大曲)、t3(y14+大曲)、t4(y18+大曲)4株酵母用于发酵老陈醋后，发酵产物中总酸、不挥发酸、还原糖、总酯和氨基酸态氮等5项常规理化指标进行测定。老陈醋总酸、不挥发酸、还原糖、总酯和氨基酸态氮等5项常规理化指标检测结果显示(图5)，t3(y14+大曲)醋中总酯含量最高。单菌株添加对提高老陈醋总酯含量的贡献依次为：y14＞y2＞y18。添加产酯酵母对老陈醋常规理化指标无不良影响，总酸含量显著提高(p＜0.05)。

(5)老陈醋含酯量测定结果

hs-spme-gc-ms法分析t1大曲(对照组)、t2(y2+大曲)、t3(y14+大曲)、t4(y18+大曲)4株酵母用于发酵老陈醋后，4种醋样的含酯量，结果表明(图6)：添加3株产酯酵母菌可使酯类物质含量显著提高(p＜0.05)。添加y14的成品醋中酯类物质更为丰富，这与发酵液中含酯量的测定结果一致。图6中由左向右横坐标的英文分别表示：乙酸乙酯、乙酸异戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异丁酯、丙烯酸异冰片酯、庚酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、苯甲酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、己酸异戊酯、棕榈酸乙酯、月桂酸乙酯、苯甲酸甲酯、乙酸异龙脑酯、乙酸苯乙酯。

酵母菌影响老陈醋的最终化学和挥发性风味成分。y14(pichiamanshurica)产酯最大量的酵母。这些酯类有利于老陈醋的香气的形成。使用y2和y18(candidaalcoholica)可以增加香气化合物的形成，有助于老陈醋香气复杂性的产生。总之，y14(盔式毕赤酵母(pichiamanshurica)的成品醋中酯类物质更为丰富，香味更浓郁，有望将其开发成为老陈醋新型发酵剂。

综上所述，本发明提出的老陈醋发酵过程中产酯酵母的筛选实验方法，本试验从老陈醋传统发酵过程中分离纯化得到产酯酵母菌菌株，经26srdna测序鉴定；并在其发酵过程中添加该产酯酵母，采用顶空固相微萃取法结合气质联用技术对成品醋中的酯类物质进行分析，结果显示：酵母菌影响老陈醋的最终化学和挥发性风味成分，y14产酯最大量的酵母，这些酯类有利于老陈醋的香气的形成，使用y2和y18可以增加香气化合物的形成，有助于老陈醋香气复杂性的产生，以期达到提高老陈醋含酯量，提高产品品质的目的，总之，y14的成品醋中酯类物质更为丰富，香味更浓郁。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。