一种念珠菌分种检测的引物探针组合、试剂盒、检测方法及其应用与流程

本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种念珠菌分种检测的引物探针组合、试剂盒、检测方法及其应用，具体涉及一种白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌分种检测的引物探针组合、试剂盒、检测方法及其应用。
背景技术：
：念珠菌是真菌中最为常见的条件致病菌之一，主要包括白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌，所述念珠菌占临床医学样本中的80％以上。念珠菌常寄生于人的皮肤、口腔、阴道和肠粘膜等位置，当机体免疫机能下降时，容易引起念珠菌病。由于培养法区分不同念珠菌种的时间周期较长，不利于快速治疗，临床常用广谱抗真菌药物进行念珠菌感染的治疗。不同念珠菌种对抗生素的耐药性不同，若不区分菌种而采用统一的治疗方案容易对机体产生不同的影响。现有技术中常使用聚合酶链式反应(pcr)进行分种检测。cn109055502a公开了一种基于真菌游离dna(cellfreedna,cfdna)的侵袭性真菌感染快速多重pcr鉴定诊断检测方法，可鉴定由临床常见和高发的白色念珠菌(candidaalbicans)，热带假丝酵母(candidatropicalis)，近平滑假丝酵母(candidaparapsilosis)，克柔念珠菌(candidakrusei)，光滑念珠菌(candidaglabrata)及烟曲霉(aspergillusfumigtus)造成的侵袭性感染。该发明根据各真菌属、种的特征基因组区段设计扩增引物，依据所述扩增片段设计可区分菌种的检测荧光探针，对待测样品进行实时荧光pcr(realtimepcr)，综合了巢式pcr的高灵敏性和多重荧光杂交探针pcr的高特异性和多靶标性的优势鉴定真菌菌种。虽然该方法实现一步单管反应鉴定多种病原菌，但该反应体系中存在多条引物和探针，通过不同荧光通道进行分析，增加检测成本与周期。cn101509037a公开了一种检测四种/四种以上侵袭性念珠菌的快速诊断试剂盒及其应用方法，在试剂盒内设有含有特异性引物和至少四种念珠菌相对应的荧光探针的荧光定量pcr反应液、至少四种念珠菌的阳性质控品和阴性质控品，根据荧光定量pcr检测仪检测的ct值进行判断。通过引物高特异扩增和荧光探针的高特异杂交双重控制，假阳性低。但不同荧光探针的荧光基团修饰以及检测通道均不同，增加检测的成本和时间。cn108034745a公开了一种检测四种念珠菌的引物探针组合，属于微生物检测
技术领域：
，包括引物和探针，所述引物为上游引物和下游引物；所述探针为标记有报告荧光基团和淬灭荧光基团的序列。该发明提供的一对引物一条探针特异性地同时检测白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌及近平滑念珠菌四种念珠菌。但该发明无法区分阳性样本对应的具体菌种，即无法对念珠菌进行分型。因此，提供一种特异性好、高效快速、灵敏度高、能区分不同念珠菌种的方法，具有重要意义，为精准用药、流行性疾病研究奠定基础。技术实现要素：针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种念珠菌分种检测的引物探针组合、试剂盒、检测方法及其应用，一次检测确定是否为念珠菌感染，能够在同一荧光通道里同时区分白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种念珠菌分种检测的引物探针组合，包括分别针对白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌的特异性引物、检测探针以及互补探针，所述互补探针与检测探针不完全互补配对。本发明中，采用多重pcr同时扩增侵袭性念珠菌属中常见的白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌的特异靶序列，再通过特殊设计的taqman探针熔解曲线分析鉴定，实现对于五种常见的侵袭性念珠菌多重检测，本发明的引物探针组合特异性好，灵敏度高，实现念珠菌的菌种间分种检测。本发明中，检测探针与互补探针不完全互补配对，不互补的碱基位置不位于检测引物的5’端或3’端的5个碱基序列内，不互补的位置不能是连续的。按照最邻近法的tm值计算公式计算不完全互补的检测探针和互补探针的tm值。公式如下：tm＝δh*/(δs*+rlnct)，其中δh*、δs*分别为杂交反应的标准焓变和熵变，r为气体常数1.987cal/kmol、ct为dna分子的摩尔浓度(当dna分子为非对称序列时，其摩尔浓度取ct/4)分别是，利用该公式设计得到设计的检测探针和互补探针的tm值的探针，进而设计出一系列可以通过tm值明确区分的互补探针和检测探针组合，从而实现在同一荧光通道中通过不同tm值区分不同念珠菌。优选地，所述白色念珠菌的特异性引物的核苷酸序列如seqidno.1-2所示，所述热带念珠菌的特异性引物的核苷酸序列如seqidno.3-4所示，所述近平滑念珠菌的特异性引物的核苷酸序列如seqidno.5-6所示，所述克柔念珠菌的特异性引物的核苷酸序列如seqidno.7-8所示，所述光滑念珠菌的特异性引物的核苷酸序列如seqidno.9-10所示。在同一反应体系中同存多对引物和探针，检测不同目标序列，需要平衡各种序列之间的稳定性、反应条件、扩增效率，随着检测菌种的数量递增，引物探针组合设计的难度显著提高，受到多种条件的制约，本发明中，通过针对白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌的多重序列比对，设计特异性引物，使得多重引物能稳定存在于同一反应体系中，且扩增效率一致，提高检测特异性与灵敏度，避免引物间的交叉影响。优选地，所述白色念珠菌的检测探针的核苷酸序列如seqidno.11所示，所述热带念珠菌的检测探针的核苷酸序列如seqidno.12所示，所述近平滑念珠菌的检测探针的核苷酸序列如seqidno.13所示，所述克柔念珠菌的检测探针的核苷酸序列如seqidno.14所示和所述光滑念珠菌的检测探针的核苷酸序列如seqidno.15所示。本发明中，通过clustax比对ncbi上大量核酸序列，比对菌种范围包括：白色念珠菌lc016565.1、he860439.1、he860438.1、lc201976.1、hg916992.1等430条序列；近平滑念珠菌ab109223.1、lt596112.1、ln864561.1、fm172980.1、lc390002.1等800条序列；热带念珠菌kx664485.1、lt837798.1、jn542555.1、hm222942.1、fj515173.1等350条序列；克柔念珠菌ku987874.1、kp674518.1、kx912139.1、fj515204.1、ef568018.1等177条序列；光滑念珠菌he993756.1、ku936094.1、kp780450.1、km603625.1、lc011411.1、hg970737.1等291条序列。通过比对2048条序列，可以最大程度获得念珠菌种内高保守区，得到不同临床分离株的高保守区和可变区，进而指导引物设计位置，提高对不同菌种的不同分离株的敏感性，目标序列的选择对引物探针组合的设计至关重要，需要同时满足不同引物、探针之间的稳定性、扩增效率一致、检测特异性、灵敏度，同时还要满足反应条件的一致性，检测的念珠菌种数越多，需要考虑的因素越多，同时设计真对五种念珠菌种检测的引物探针组合并不等同于真对单一菌种的引物探针的组合。本发明中，在待测五种念珠菌特异靶序列的区域，优选18srrna、28srrna序列区域，分别设计并制备五条taqman探针和五条其互补序列，以及检测探针序列外围分别设计一对引物序列，包括一条上游引物和一条下游引物。用设计的引物对特异性靶点进行单重或多重单色或多重多色实时荧光定量pcr扩增反应。优选地，所述白色念珠菌的互补探针的核苷酸序列如seqidno.16所示，热带念珠菌的互补探针的核苷酸序列如seqidno.17所示，近平滑念珠菌的互补探针的核苷酸序列如seqidno.18所示，克柔念珠菌的互补探针的核苷酸序列如seqidno.19所示和光滑念珠菌的互补探针的核苷酸序列如seqidno.20所示。本发明中，针对五种不同念珠菌的检测探针分别设计一条互补探针，所述互补探针与检测探针不完全互补配对可以形成双链探针，使得针对不同念珠菌种的双链探针有不同的熔解性，可以通过其特征熔化温度(tm)区分五种不同念珠菌。优选地，所述引物探针组合还包括内参系统。优选地，所述内参系统包括内参引物和内参探针。优选地，所述内参引物的核苷酸序列如seqidno.21-22所示。优选地，所述内参探针的核苷酸序列如seqidno.23所示。优选地，所述白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌的检测探针的3’端修饰有淬灭基团，5’端修饰有荧光基团。优选地，优选地，所述荧光基团包括alex-350、alexafluor488、cy3、fam、vic、tet、calgold540、joe、hex、calfluororange560、tamra、calfluorred590、rox、calfluorred610、texasred、calfluorred635、quasar670、cy5、cy5.5、lcred640或quasar705中的任一种或至少两种的组合。本发明中，针对不同念珠菌种的检测探针的5’端均修饰有荧光基团，其可以为相同的荧光基团也可以为不同的荧光基团，当修饰有相同荧光基团时，本发明设计的引物探针组合可以在同一荧光检测通道中进行检测分析，根据所述检测探针和互补探针形成的双链探针的熔解温度不同，在实时荧光定量pcr扩增反应后进行熔解曲线分析，根据taqman探针熔点的变化来判断待检测样品中是否存在五种致病念珠菌的一种或多种并通过tm值-菌种标准对照表鉴定待测样品中的念珠菌菌种，即进行多重单色实时荧光定量pcr反应；当修饰有不同荧光基团时，也可以进行多重多色实时荧光定量pcr反应；此外，单独使用针对五种念珠菌种的某一种进行检测同样可行，即单重单色实时荧光定量pcr反应。优选地，所述检测探针3’端修饰的淬灭基团包括tamra、dabcyl、bhq-1、bhq-2、bhq-3或eclipse中的任一种或至少两种的组合。针对不同的念珠菌，所用的荧光基团和淬灭基团可以是相同的，也可以是不同的，但不同的荧光基团所需要的荧光检测通道需要不同，且所选择的不同荧光基团的激发光和吸收光光谱范围需要避免干扰。优选地，检测不同念珠菌的探针修饰的荧光基团和淬灭基团为同一组。所述荧光基团和淬灭基团的组合典型非限定地可以是荧光基团fam和淬灭基团tamra；荧光基团hex淬灭基团bhq-1；荧光基团rox和淬灭基团bhq-2；荧光基团cy5和淬灭基团bhq-3，优选为为荧光基团fam和淬灭基团tamra。优选地，所述互补探针的3’端修饰有淬灭基团。优选地，所述互补探针3’端修饰的淬灭基团包括tamra、dabcyl、bhq-1、bhq-2、bhq-3或eclipse中的任一种或至少两种的组合。优选地，所述互补探针和检测探针地淬灭基团相同。探针的淬灭基团与互补序列的淬灭基团也可不同，但需要匹配荧光基团的光谱波段。本发明中，所述互补探针的3’端可以选择性修饰淬灭基团。检测探针与靶序列互补，检测探针设计时在5’端用荧光基团标记，3’端标记淬灭基团。互补探针的3’端可以设计为包含带有淬灭基团也可以不设计带有淬灭基团。当互补探针3’端不带有淬灭基团时，温度升高时，随着检测探针和互补探针解链而荧光值减少。这种现象的原因是溶液中的线性单链双标记寡核苷酸为无规则卷曲：它的两端偶尔彼此接近，导致荧光基团的能量被淬灭基团所吸收。然而，当检测探针和互补探针结合时，标记的杂合体迫使探针的两端分开，破坏两个末端标记之间的相互作用，从而引起荧光值的变化。如果互补探针在3’端用猝灭基团标记，则探针间杂交降低荧光值，并且当温度升高以使双链体变性时，荧光值增加。这是因为探针杂合体的形成使淬灭基团和荧光基团紧密接近，有效地淬灭荧光信号。第二方面，本发明提供一种念珠菌分种检测的试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的引物探针组合。优选地，所述试剂盒还包括阴性质控、阳性质控和辅助试剂。优选地，所述阴性质控为含有拟南芥dna片段的质粒，所述拟南芥dna片段的核苷酸序列如seqidno.24所示。优选地，所述阳性质控分别为含有白色念珠菌dna片段的质粒、含有热带念珠菌dna片段的质粒、含有近平滑念珠菌dna片段的质粒、含有克柔念珠菌dna片段的质粒和含有光滑念珠菌dna片段的质粒。本发明中，阴性质控和阳性质控均采用本领域常用的质粒pmd19，需要说明的是，任何满足阴性质控和阳性质控质粒构建的载体均可用于替换pmd19，此处无需特殊限定。优选地，所述白色念珠菌dna片段、热带念珠菌dna片段、近平滑念珠菌dna片段、克柔念珠菌dna片段和光滑念珠菌dna片段的核苷酸序列分别如seqidno.25、seqidno.26、seqidno.27、seqidno.28和seqidno.29所示。优选地，所述辅助试剂包括taq酶、dntp、mgcl2、dmso和缓冲液。优选地，所述缓冲液包括tris-hcl和kcl。优选地，所述tris-hcl在缓冲液中的浓度为15-20mm，例如可以是15mm、16mm、17mm、18mm、19mm或20mm。优选地，所述kcl在缓冲液中的浓度为100-200mm，例如可以是100mm、110mm、120mm、130mm、140mm、150mm、160mm、170mm、180mm、190mm或200mm。第四方面，本发明提供一种利用如第二方面所述的试剂盒用于念珠菌分种检测的方法，所述方法包括如下步骤：(1)提取样本dna；(2)向步骤(1)样本dna中加入taq酶、dntp、mgcl2、dmso、缓冲液以及如第一方面所述的引物探针组合；(3)实时荧光pcr反应。优选地，步骤(2)所述dna样本的终浓度为0.1pg-10ng，例如可以是0.1pg、0.5pg、1pg、2pg、3pg、4pg、5pg、10pg、20pg、30pg、40pg、50pg、60pg、70pg、80pg、90pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、2ng、3ng、4ng、5ng、6ng、7ng、8ng、9ng或10ng。优选地，步骤(2)所述taq酶的终浓度为0.5-5u，例如可以是0.5u、0.8u、1u、1.2u、1.5u、1.8u、2u、2.5u、3u、3.5u、4u、4.5u或5u。优选地，步骤(2)所述dntp的终浓度为0.1-5m，例如可以是0.1m、0.3m、0.5m、0.8m、1m、1.2m、1.5m、1.8m、2m、2.5m、2.8m、3m、3.5m、4m、4.5m、4.8m或5m。优选地，步骤(2)所述dmso的体积百分比为1-8％，例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％或8％，优选为5％。优选地，步骤(2)所述五种念珠菌的特异性引物的终浓度为50-500nm，例如可以是50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、120nm、150nm、180nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm或500nm。优选地，步骤(2)所述五种念珠菌的检测探针的终浓度为50-500nm，例如可以是50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、120nm、150nm、180nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm或500nm。优选地，步骤(2)所述五种念珠菌的互补探针的终浓度为50-500nm，例如可以是50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、120nm、150nm、180nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm或500nm。本发明pcr反应体系中针对每种念珠菌的特异性引物终浓度一致，按照五对引物1:1:1:1:1组合配比，所述终浓度范围为所述终浓度范围为50-500nm，本发明的引物探针设计满足扩增效率一致。本发明pcr反应体系中针对每种念珠菌的检测探针终浓度一致，按照五种探针1:1:1:1:1组合配比，所述终浓度范围为所述终浓度范围为50-500nm。本发明pcr反应体系中针对每种念珠菌的互补探针终浓度一致，按照五种探针1:1:1:1:1组合配比，所述终浓度范围为所述终浓度范围为50-500nm。优选地，步骤(3)所述实时荧光pcr反应的条件为：(1’)90-98℃预变性，1-2min，1个循环；(2’)90-98℃变性10s，55-60℃延伸35-45s，40-50个循环；(3’)35-97℃升温，1个循环。优选地，步骤(1’)之前还包括预热的过程：50℃，2min，1个循环。优选地，步骤(1)所述实时荧光pcr反应具体包括如下步骤：(1”)50℃预热2min，1个循环；(2”)95℃预变性10min，1个循环；(3”)95℃变性10s，58℃延伸40s，延伸时采集荧光信号，45个循环；(4”)95℃5s，35℃1min；升温到97℃，0.2℃/s，连续采集荧光信号，5次/℃。优选地，步骤(2)所述判断的标准为：(a)若检测通道的ct值不大于35，则为阳性结果，若检测通道的ct值大于35，则为阴性结果；(b)对阳性结果进一步分析，通过熔解曲线分析，比对产物与五种阳性质控的对应退火温度tm值，tm值相同的即判定待测样本含有对应阳性质控的念珠菌种。第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的引物探针组合和/或如第二方面所述的试剂盒用于念珠菌分种检测或制备念珠菌分种检测的试剂种的应用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明的引物探针组合具有高特异性和灵敏度，能同时检测白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌并区分具体菌种；(2)本发明中针对白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌设计的引物在满足普通扩增需求的同时还满足扩增效率的一致，使检测体系更加稳定，检测特异性好，避免扩增效率不同导致菌种间的相互影响；(3)本发明的检测方法灵敏度高，配合特定引物探针组合可以快速检测白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌，可在同一荧光检测通道中同时鉴别区分不同念珠菌种，根据taqman探针熔点的变化可在同一荧光通道来区分多种念珠菌菌种的特异靶序列；(4)寡核苷酸探针熔解曲线分析可以在实时荧光pcr扩增反应后直接进行，无需开管操作，也可以在普通pcr进行扩增后转移到实时荧光pcr仪进行分析；(5)寡核苷酸探针熔解曲线分析属于非消耗性的检测，在分析结束后，样本保持pcr后的状态，并且可以多次重复分析。附图说明图1为分别以含有白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌dna片段的质粒为模板，检测产物的熔解曲线；图2为实施例4中不同浓度的含有白色念珠菌dna片段的标准质粒对应的扩增曲线；图3为实施例4中不同浓度的含有白色念珠菌dna片段的标准质粒对应的熔解曲线；图4为实施例5中白色念珠菌不同浓度梯度的扩增曲线图；图5为实施例5中白色念珠菌不同浓度与ct值的线性关系图。具体实施方式为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。实施例1试剂盒的组装针对白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌的特异性引物、检测探针以及互补探针的核苷酸序列见表1.表1引物名称编号seqidno.核苷酸序列5’-3’白色念珠菌上游引物1tgtttgagcgtcgtttct白色念珠菌下游引物2aagttcagcgggtagtcc热带念珠菌上游引物3gcctgtttgagcgtcgtttc热带念珠菌下游引物4cgccttaccactaccgtctt近平滑念珠菌上游引物5ctgtttgagcgtcgtttct近平滑念珠菌下游引物6taagttcagcgggtagtcc克柔念珠菌上游引物7agtactacactgcgtgagcg克柔念珠菌下游引物8tgcgagaaccaagagatccg光滑念珠菌上游引物9aacgcagcgaaatgcgatac光滑念珠菌下游引物10ggaataccagagggcgcaat白色念珠菌检测探针11atcactgtacttgttcgctatcggt热带念珠菌检测探针12tttccactcattggtacaaactcca近平滑念珠菌检测探针13acgcacactcccaggtcttt克柔念珠菌检测探针14tcctccgtctatgctccgttacctgtt光滑念珠菌检测探针15aaacgcttattttgctagtggcca白色念珠菌互补探针16tagtgacatgaacaagcgataacca热带念珠菌互补探针17aaaggcgagaaaccaagttagaggt近平滑念珠菌互补探针18tgcgagtgagggaccagaaa克柔念珠菌互补探针19aggatgcacatacgagacaatggacaa光滑念珠菌互补探针20tttgcgaataaaaccatcaccggt内参引物上游引物21ctgtgaatgccatttctc内参引物下游引物22acacctcctttggaatag内参探针23cctaacctacccgccttggatatt阴性质控品：所述阴性质控为含有拟南芥dna片段的质粒，所述拟南芥dna片段的核苷酸序列如seqidno.24所示，具体序列如下：catgattcagccaacataacccgacccgtacaattctattacgcgtctccggcgactgactatacttgccgttcggagttagggttttactccgagagaaaattgagtcagcgatgaatccgttgacaaggtgaagaagacgcagagcattaacgcgaaagaattagatctagggatttacgacgaagcatcttggcacgccaagtacaaagattcagcctacgtttacgtcggagaattaccttacgatctcacggagggtgacctcctcgccgttttctcacaatatggtgaagttgttgatttgaatcttgttcgagataaaggaactgggagatcaaaaagatttgcgtttgttgcttatgaagatcagagaagtactaatcttgctgttggataataaaagtggagcattgtggtaaatacttaaagagagaagaggaagatgaagagacgaagcagaagaagagagaagctccgtggtgtttgcagagcttttcagagaaaggagtgtactcgtggagattcttgcaaattttctcacgatgaaaatagagctgccaataccgggtggggtcacgaagatcgtagaagttccaagtgagagatcaagtaagtaaataccataatgatgtagaggataaatagggattgttcatattgatatccaagtggtaatgctctacattgaagaatggtttctaagttgtagctagaatctaatggaaaatgtgatttattgaccattagcttacacaccggtgttttgctctgtatatgtcgatcttattttcagtgttcacctttac.阳性质控品：含有白色念珠菌dna片段的质粒、含有热带念珠菌dna片段的质粒、含有近平滑念珠菌dna片段的质粒、含有克柔念珠菌dna片段的质粒和含有光滑念珠菌dna片段的质粒。白色念珠菌dna片段的核苷酸序列如seqidno.25所示，具体如下：atatcaataagcggaggaaaagaaaccaacagggattgcctcagtagcggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggcgtctttggcgtccgagttgtaatttgaagaaggtatctttgggcccggctcttgtctatgttccttggaacaggacgtcacagagggtgagaatcccgtgcgatgagatgacccgggtctgtgtaaagttccttcgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcttgagatcagacttggtattttgcatgctgctctctcgggggcggccgctgcggtttaccgggccagcatcggtttggagcggcaggataatggcggaggaatgtggcacggcttctgctgtgtgttatagcctctgacgatactgccagcctagaccgaggactgcggtttttacctaggatgttggcataatgatcttaagtcgc.热带念珠菌dna片段的核苷酸序列如seqidno.26所示，具体如下：aaaagaaaccaacagggattgccttagtagcggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggctctttcagagtccgagttgtaatttgaagaaggtatctttgggtctggctcttgtctatgtttcttggaacagaacgtcacagagggtgagaatcccgtgcgatgagatgatccaggcctatgtaaagttccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcttgagatcagacttggtattttgtatgttacttcttcgggggtggcctctacagtttatcgggccagcatcagtttgggcggtaggagaattgcgttggaatgtggcacggcttcggttgtgtgttatagccttcgtcgatactgccagcctagactgaggactgcggtttatacctaggatgttggcataatgatcttaagtcgcccgtcttgaaacacggaccaaggagtctaacgtctatgcgagtgtttgggtgtaaaacccgtacgcgtaatgaaagtgaacgtaggtgggggcccgtatgggtgcaccatcgaccgatcctgatgtcttcggatggatttgagtaagagcatagctgttgggacccgaaagatggtgaactatgcctgaatagggtgaagccagaggaaactctggtggaggctcgtagcggttctgacgtgcaaatcgatcgtcgaatttgggtataggggcgaaagactaatcgaccc.近平滑念珠菌dna片段的核苷酸序列如seqidno.27所示，具体如下：gcatatcaataagcggaggaaaagaaaccaacagggattgccttagtagcggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggcactttcagtgtccgagttgtaatttgaagaaggtatctttgggtctggctcttgtctatgtttcttggaacagaacgtcacagagggtgagaatcccgtgcgatgagatgtcccagacctatgtaaagttccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcttgagatcagacttggtattttgtatgttactctctcgggggtggcctctacagtttaccgggccagcatcagtttgagcggtaggataagtgcaaagaaatgtggcactgcttcggtagtgtgttatagtctttgtcgatactgccagcttagactgaggactgcggcttcggcctaggatgttggcataatgatcttaagtcgcccgtcttgaaacacggacc.克柔念珠菌dna片段的核苷酸序列如seqidno.28所示，具体如下：tttcatgcgcttgatttttcaagccaaccatcgaaagggaatccggttaaaattccggaacttggatatggattcttcacggcaacgtaactgaatgtggagacgtcggcgtgagccctgggaggagttatcttttcttcttaacagcttatcaccctggaattggtttatccggagatggggtcttatggctggaagagcgcggtaattttgccgcgtccggtgcgctcacgacggtccttgaaaatccacaggaaggaatagttttcatgccaagtcgtactcataaccgcagcaggtctccaaggttaacagcctctagttgatagaataatgtagataagggaagtcggcaaaatagatccgtaacttcgggataaggattggctctaaggatcgggtggtttgggccttgcgtagaagtggtggtgactggcggcgggctgctttcgggcggactgctgttggacgtcgctatagacacacttggtaggcatttatgtcgtccggatcacgcttaacgatcaacttagaactggtacggacaaggggaatctgactgtctaattaaaacatagcattgtgatggtcagaaagtgatgttgacacaatgtgatttctgcccagtgct.光滑念珠菌dna片段的核苷酸序列如seqidno.29所示，具体如下：gccttagtaacggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtacctttggtgcccgagttgtaatttggagagtaccactttgggactgtactttgcctatgttccttggaacaggacgtcatggagggtgagaatcccgtgtggcgaggtgtgtcagttctttgtaaagggtgctcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatacaggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgcgccttgcctctcgtggggggactctcgcagctcactgggccagcatcggttttggcggccggaaaaaacctagggaatgtggctctgcctcggtgtagagttatagccctggggaatacggccagccgggaccgaggactgcgatttgtatctaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaaacacggaccaaggagtctaacgtctatgcgagtgtttgggtgttaaacccgtacgcgtaatgaaagtgaacgtaggttgggcccctggggggtgcacaatcgaccgatcctgatgtcttcggatggatttgagtaagagcatagctgttgggacccgaaagatggtgaactatgcctgaatagggtgaagccagaggaaactctggtggaggctcgtagcggttctgacgtgcaaatcgatcgtcgaatttgggtataggggcgaaagactaatcgaaccatctagtagctggttcctgccgaagtt.辅助试剂：taq酶、dntp、mgcl2、dmso和缓冲液。将装有上述组分的离心管及说明书等装入试剂盒中。实施例2念珠菌的分种检测采用实施例1中的试剂盒进行念珠菌分种检测，包括如下步骤：(1)提取样本dna；(2)向步骤(1)样本dna中加入taq酶、dntp、mgcl2、dmso、缓冲液、针对五种念珠菌的特异性引物、检测探针以及互补探针，按照表2配制体系；表2组分剂量taqpolymerase2udntp2mprimers引物(5对)200nm*10probes探针(5条)100nm*5mgcl23mmtemplate1μldmso5％total25μl(3)将步骤(2)体系放入实时荧光pcr仪，进行pcr扩增反应，具体条件如下所示：(1”)50℃预热2min，1个循环；(2”)95℃预变性10min，1个循环；(3”)95℃变性10s，58℃延伸40s，延伸时采集荧光信号，45个循环；(4”)95℃5s，35℃1min；升温到97℃，0.2℃/s，连续采集荧光信号，5次/℃。步骤(4”)的检测荧光通道为fam，运行pcr反应程序，保存文件；(4)结果判定：1)试剂盒有效性的判定：阴性质控组有效：阴性质控组在fam通道下无典型扩增曲线或无ct值，否则可能存在试剂污染，请排除污染源后重测；阳性质控组有效：阳性质控组在fam通道下均有典型扩增曲线，确认无误后通过调节阈值将阳性质控的ct值调节至20，并以此作为待测样本的阈值；2)检测样本的有效性判定：若ct值在，表明加入的dna量正常；3)念珠菌分型判定：pcr循环扩增产物后，不同念珠菌种dna序列的熔解温度不同，通过阳性质控的五种质粒进行仪器校准，本发明采用罗氏480进行检测，得到白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌对应的产物退火温度表(表3)，需要说明的是，任何满足实时荧光pcr的仪器均可，在此无需做具体限定，校准目的在于消除不同仪器带来的具体退火温度差异。表3不同念珠菌种的退火温度tm值对照表由表2可知，不同念珠菌种的产物tm值差异较大，均在4℃以上，便于区分，特异性好，灵敏度高，不限于pcr仪器的具体测量值可能稍有偏差，但念珠菌种间的tm值是相对稳定的，通过对阳性质控的检测，可以得到适用于任何机器的tm值对照表，阳性质控对应的熔解曲线图见图1。实施例3特异性检测分析分别提取新生隐球菌、格特隐球菌、烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、杂色曲霉、酿酒酵母、马尔尼菲青霉、葡萄牙念珠菌、季也蒙念珠菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的dna，采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法进行检测，结果见下表4。表4菌种名检测ct值检测tm值新生隐球菌--格特隐球菌--烟曲霉--黄曲霉--土曲霉--黑曲霉--构巢曲霉--杂色曲霉--酿酒酵母--马尔尼菲青霉--葡萄牙念珠菌--季也蒙念珠菌--百日咳杆菌--流感嗜血杆菌--绿脓杆菌--金黄色葡萄球菌--肺炎链球菌--隐球菌、曲霉菌和念珠菌等是临床常见的引物侵袭性真菌病的真菌，上述细菌为引起呼吸道等细菌感染的常见菌种。由表4可知，本发明的检测体系在上述真菌或细菌的核酸存在的情况下，不产生扩增反应，也检测不到特异性的熔解曲线和tm值，说明本发明具有很好的特异性。实施例4灵敏度检测分析通过熔解曲线法检测不同浓度五种念珠菌靶序列的质粒标准品的灵敏度，利用人工合成的白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌的靶序列质粒标准品(上海生工合成)，稀释成106copies、105copies、104copies、103copies、102copies、101copies、100copies。将其作为模板，使用实施例1中的试剂盒和实施例2中的方法，利用罗氏480ii荧光定量pcr仪器进行检测，并进行熔解曲线分析。以白色念珠菌为例，不同浓度的扩增曲线见图2，其中曲线1-8分别对应的是106copies、105copies、104copies、103copies、102copies、101copies、100copies和阴性对照，熔解曲线见图3。由扩增曲线图2可知，在106copies-102copies质粒标准品存在的情况下，本发明都能给出较好的信号，在101copies-100copies质粒标准品存在的情况下，无法检测出荧光信号，在靶序列不存在的情况下，本发明无法检测出荧光信号。由熔解曲线图3表明，在106copies-102copies质粒标准品存在的情况下，能够形成独特且一致的熔点，形成图中的单峰；在101copies-100copies质粒标准品存在的情况下，无法形成独特一致的单峰，在靶序列不存在的情况下，无单峰。因此，采用本发明进行熔解曲线法检测念珠菌靶序列的质粒标准品的灵敏度可达102copies。实施例5定量分析定量检测五种念珠菌：白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌。将本试剂盒可检测的五种念珠菌每种浓度为1ng/μl等量均匀混合，进行10倍连续梯度稀释制备成7个浓度点的标准曲线，每个浓度进行3个复孔，使用拟南芥的基因片段做为阴性对照，扩增曲线见图4(以白色念珠菌为例)，建立起ct值与浓度之间的线性关系见图5。由图5可知，标准曲线在pcr反应的线性扩增区域形成线性方程y＝3.4329x+7.6029，r2＝0.9999,试剂盒扩增效率是95.9％，其线性范围是：1ng/μl～0.000001ng/μl。在测量样本时，上述标准曲线、阴性对照以及未知浓度的样本dna进行荧光pcr反应，使用罗氏lightcycler480ii、abi7500、steponeplus等荧光定量pcr仪时，其内置分析软件可以根据标准曲线和样本的ct值，计算出样本中的靶基因的核酸浓度，进行定量分析。实施例6稳定性检测1)利用实施例1中的辅助试剂和白色念珠菌的特异性引物、检测探针和互补探针按照下表的组分和剂量组成稳定性检测试剂盒-白念；利用实施例1中的辅助试剂和近平滑念珠菌的特异性引物、检测探针和互补探针按照下表的组分和剂量组成稳定性检测试剂盒-近平滑；利用实施例1中的辅助试剂和热带念珠菌的特异性引物、检测探针和互补探针按照下表的组分和剂量组成稳定性检测试剂盒-热带；利用实施例1中的辅助试剂和克柔念珠菌的特异性引物、检测探针和互补探针按照下表的组分和剂量组成稳定性检测试剂盒-克柔；利用实施例1中的辅助试剂和光滑念珠菌的特异性引物、检测探针和互补探针按照下表的组分和剂量组成稳定性检测试剂盒-光滑，针对每种菌的单独检测体系如表5所示；表52)提取培养好的白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌的dna；3)利用实施例2中的方法分别比较实施例1中的试剂盒检测上述菌种dna的ct值和1)中的五个稳定性检测试剂盒检测2)中对应菌种的ct值，即比较实施例1中对五种念珠菌dna检测的ct值和稳定性检测试剂盒对五种念珠菌dna检测的ct值结果，分析比较了两组结果的标准差和cv值，结果如下表6所示；表6白色念珠菌近平滑念珠菌热带念珠菌克柔念珠菌光滑念珠菌检测试剂盒23.12±0.0525.56±0.0621.26±0.0420.76±0.0519.98±0.06稳定性试剂盒23.13±0.0325.55±0.0821.25±0.0520.74±0.0419.97±0.08std0.050.060.040.050.06cv％<3<3<3<3<3由表6可知，检测试剂盒中设计的复杂引物和探针体系具有与单独体系一致的检测效率，复杂体系下检测性能稳定。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。sequencelisting<110>丹娜（天津）生物科技有限公司<120>一种念珠菌分种检测的引物探针组合、试剂盒、检测方法及其应用<130>2019<160>29<170>patentinversion3.3<210>1<211>18<212>dna<213>人工合成序列<400>1tgtttgagcgtcgtttct18<210>2<211>18<212>dna<213>人工合成序列<400>2aagttcagcgggtagtcc18<210>3<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>3gcctgtttgagcgtcgtttc20<210>4<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>4cgccttaccactaccgtctt20<210>5<211>19<212>dna<213>人工合成序列<400>5ctgtttgagcgtcgtttct19<210>6<211>19<212>dna<213>人工合成序列<400>6taagttcagcgggtagtcc19<210>7<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>7agtactacactgcgtgagcg20<210>8<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>8tgcgagaaccaagagatccg20<210>9<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>9aacgcagcgaaatgcgatac20<210>10<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>10ggaataccagagggcgcaat20<210>11<211>25<212>dna<213>人工合成序列<400>11atcactgtacttgttcgctatcggt25<210>12<211>25<212>dna<213>人工合成序列<400>12tttccactcattggtacaaactcca25<210>13<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>13acgcacactcccaggtcttt20<210>14<211>27<212>dna<213>人工合成序列<400>14tcctccgtctatgctccgttacctgtt27<210>15<211>24<212>dna<213>人工合成序列<400>15aaacgcttattttgctagtggcca24<210>16<211>25<212>dna<213>人工合成序列<400>16tagtgacatgaacaagcgataacca25<210>17<211>25<212>dna<213>人工合成序列<400>17aaaggcgagaaaccaagttagaggt25<210>18<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>18tgcgagtgagggaccagaaa20<210>19<211>27<212>dna<213>人工合成序列<400>19aggatgcacatacgagacaatggacaa27<210>20<211>24<212>dna<213>人工合成序列<400>20tttgcgaataaaaccatcaccggt24<210>21<211>18<212>dna<213>人工合成序列<400>21ctgtgaatgccatttctc18<210>22<211>18<212>dna<213>人工合成序列<400>22acacctcctttggaatag18<210>23<211>24<212>dna<213>人工合成序列<400>23cctaacctacccgccttggatatt24<210>24<211>809<212>dna<213>人工合成序列<400>24catgattcagccaacataacccgacccgtacaattctattacgcgtctccggcgactgac60tatacttgccgttcggagttagggttttactccgagagaaaattgagtcagcgatgaatc120cgttgacaaggtgaagaagacgcagagcattaacgcgaaagaattagatctagggattta180cgacgaagcatcttggcacgccaagtacaaagattcagcctacgtttacgtcggagaatt240accttacgatctcacggagggtgacctcctcgccgttttctcacaatatggtgaagttgt300tgatttgaatcttgttcgagataaaggaactgggagatcaaaaagatttgcgtttgttgc360ttatgaagatcagagaagtactaatcttgctgttggataataaaagtggagcattgtggt420aaatacttaaagagagaagaggaagatgaagagacgaagcagaagaagagagaagctccg480tggtgtttgcagagcttttcagagaaaggagtgtactcgtggagattcttgcaaattttc540tcacgatgaaaatagagctgccaataccgggtggggtcacgaagatcgtagaagttccaa600gtgagagatcaagtaagtaaataccataatgatgtagaggataaatagggattgttcata660ttgatatccaagtggtaatgctctacattgaagaatggtttctaagttgtagctagaatc720taatggaaaatgtgatttattgaccattagcttacacaccggtgttttgctctgtatatg780tcgatcttattttcagtgttcacctttac809<210>25<211>593<212>dna<213>人工合成序列<400>25atatcaataagcggaggaaaagaaaccaacagggattgcctcagtagcggcgagtgaagc60ggcaaaagctcaaatttgaaatctggcgtctttggcgtccgagttgtaatttgaagaagg120tatctttgggcccggctcttgtctatgttccttggaacaggacgtcacagagggtgagaa180tcccgtgcgatgagatgacccgggtctgtgtaaagttccttcgacgagtcgagttgtttg240ggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccg300atagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagt360acgtgaaattgttgaaagggaagggcttgagatcagacttggtattttgcatgctgctct420ctcgggggcggccgctgcggtttaccgggccagcatcggtttggagcggcaggataatgg480cggaggaatgtggcacggcttctgctgtgtgttatagcctctgacgatactgccagccta540gaccgaggactgcggtttttacctaggatgttggcataatgatcttaagtcgc593<210>26<211>865<212>dna<213>人工合成序列<400>26aaaagaaaccaacagggattgccttagtagcggcgagtgaagcggcaaaagctcaaattt60gaaatctggctctttcagagtccgagttgtaatttgaagaaggtatctttgggtctggct120cttgtctatgtttcttggaacagaacgtcacagagggtgagaatcccgtgcgatgagatg180atccaggcctatgtaaagttccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagt240gggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacag300tgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaa360gggaagggcttgagatcagacttggtattttgtatgttacttcttcgggggtggcctcta420cagtttatcgggccagcatcagtttgggcggtaggagaattgcgttggaatgtggcacgg480cttcggttgtgtgttatagccttcgtcgatactgccagcctagactgaggactgcggttt540atacctaggatgttggcataatgatcttaagtcgcccgtcttgaaacacggaccaaggag600tctaacgtctatgcgagtgtttgggtgtaaaacccgtacgcgtaatgaaagtgaacgtag660gtgggggcccgtatgggtgcaccatcgaccgatcctgatgtcttcggatggatttgagta720agagcatagctgttgggacccgaaagatggtgaactatgcctgaatagggtgaagccaga780ggaaactctggtggaggctcgtagcggttctgacgtgcaaatcgatcgtcgaatttgggt840ataggggcgaaagactaatcgaccc865<210>27<211>613<212>dna<213>人工合成序列<400>27gcatatcaataagcggaggaaaagaaaccaacagggattgccttagtagcggcgagtgaa60gcggcaaaagctcaaatttgaaatctggcactttcagtgtccgagttgtaatttgaagaa120ggtatctttgggtctggctcttgtctatgtttcttggaacagaacgtcacagagggtgag180aatcccgtgcgatgagatgtcccagacctatgtaaagttccttcgaagagtcgagttgtt240tgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagac300cgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaa360gtacgtgaaattgttgaaagggaagggcttgagatcagacttggtattttgtatgttact420ctctcgggggtggcctctacagtttaccgggccagcatcagtttgagcggtaggataagt480gcaaagaaatgtggcactgcttcggtagtgtgttatagtctttgtcgatactgccagctt540agactgaggactgcggcttcggcctaggatgttggcataatgatcttaagtcgcccgtct600tgaaacacggacc613<210>28<211>631<212>dna<213>人工合成序列<400>28tttcatgcgcttgatttttcaagccaaccatcgaaagggaatccggttaaaattccggaa60cttggatatggattcttcacggcaacgtaactgaatgtggagacgtcggcgtgagccctg120ggaggagttatcttttcttcttaacagcttatcaccctggaattggtttatccggagatg180gggtcttatggctggaagagcgcggtaattttgccgcgtccggtgcgctcacgacggtcc240ttgaaaatccacaggaaggaatagttttcatgccaagtcgtactcataaccgcagcaggt300ctccaaggttaacagcctctagttgatagaataatgtagataagggaagtcggcaaaata360gatccgtaacttcgggataaggattggctctaaggatcgggtggtttgggccttgcgtag420aagtggtggtgactggcggcgggctgctttcgggcggactgctgttggacgtcgctatag480acacacttggtaggcatttatgtcgtccggatcacgcttaacgatcaacttagaactggt540acggacaaggggaatctgactgtctaattaaaacatagcattgtgatggtcagaaagtga600tgttgacacaatgtgatttctgcccagtgct631<210>29<211>872<212>dna<213>人工合成序列<400>29gccttagtaacggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtacctttggtg60cccgagttgtaatttggagagtaccactttgggactgtactttgcctatgttccttggaa120caggacgtcatggagggtgagaatcccgtgtggcgaggtgtgtcagttctttgtaaaggg180tgctcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaa240agctaaatacaggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaa300ctttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcaga360catggtgttttgcgccttgcctctcgtggggggactctcgcagctcactgggccagcatc420ggttttggcggccggaaaaaacctagggaatgtggctctgcctcggtgtagagttatagc480cctggggaatacggccagccgggaccgaggactgcgatttgtatctaggatgctggcata540atggttatatgccgcccgtcttgaaacacggaccaaggagtctaacgtctatgcgagtgt600ttgggtgttaaacccgtacgcgtaatgaaagtgaacgtaggttgggcccctggggggtgc660acaatcgaccgatcctgatgtcttcggatggatttgagtaagagcatagctgttgggacc720cgaaagatggtgaactatgcctgaatagggtgaagccagaggaaactctggtggaggctc780gtagcggttctgacgtgcaaatcgatcgtcgaatttgggtataggggcgaaagactaatc840gaaccatctagtagctggttcctgccgaagtt872当前第1页12