一种针对EGFRT790M位点突变进行检测的试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种针对egfrt790m位点突变进行检测的试剂盒。

背景技术：

近年来，以表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,egfr)为治疗靶标的分子靶向治疗(moleculartargetedtherapy)受到了国内外肿瘤界的普遍关注，其中egfr酪氨酸激酶抑制剂genfitinib(又称iressa)和erlotinib(又称tarceva)已被美国食品药品管理局(fda)批准用于治疗晚期非小细胞肺癌(nsclc)，并且gefitinib还分别获得包括日本、澳大利亚等27个国家的批准，我国也于2005年2月批准了genfitinib进入临床。

资料显示，大量临床研究证实，egfr突变阳性者对egfr-tki的有效率为50％～80％，而野生型患者的有效率仅约10％～15％。而且，诊断明确的nsclc病人，给予吉非替尼或埃罗替尼治疗，治疗开始阶段病情有明显改善，但在继续用药过程中病情复发，有研究证实可能是egfr基因编码区出现t790m(2369c>t)突变造成的药物失效，需要及时更换新的有效抑制剂或应用其它治疗方法。

关于t790m突变造成耐药的研究早已有报道。2005年2月kobayashi等发表于《nengljmed》上的文章对1例治疗前组织中有dell747-s752位点缺失突变、接受吉非替尼二线治疗达完全缓解28个月后疾病进展的71岁患者进行了二次活检，分析其活检组织基因突变状况，发现在原有突变基础上egfr确实发生了新的基因突变，即在20外显子790位上密码子发生了错义突变(t790m)，从而使egfr重新处于被激活状态。研究者因此认为获得性耐药源自t790m突变引起酪氨酸激酶域空间构象改变，影响其与吉非替尼、埃罗替尼的结合，此外继发突变亦极大地减弱了egfr-tki与激酶域之间氢键的亲和力。

无独有偶，2005年3月另一组发表于《plosmedicine》，有关egfr突变与耐药的报道接踵而至。pao等通过检测6例疾病进展后原发与转移活检标本egfr突变及kras突变，发现其中3例存在t790m错义突变，初治前及疾病进展后的标本均无kras突变。同时采用pcr-rflp验证了上述结果，为进一步证实t790m并非原发突变，作者回顾性研究了155例nsclc患者治疗前肿瘤组织egfr，结果无1例携带t790m突变。

但也有的文献报道t790m突变亦存在于治疗前肿瘤组织中。

因此，通过检测egfr基因突变型，可以从晚期肺癌病人中筛选出最适治疗对象进行个体化治疗，从而显著提高药物疗效，节约资源。这一基因诊断新技术应用于临床，每年可使数百万癌症病人得益，其社会意义和经济价值均十分显著。

体细胞突变目前最常用的方法是arms-pcr法，即扩增受阻突变系统荧光pcr法，该方法主要用来检测点突变，尤其是检测突变含量很低的体细胞突变。

荧光pcr的优点是反应灵敏、特异性高：具有模板序列特异的taqman探针在引物特异的基础上进一步提高的pcr的专一性；每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，仪器检测的是特异扩增的结果，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性。有多种不同波长的荧光基团对可供选择，使得taqman探针法可以实现在同一管内检测多重pcr，降低成本也提高效率和准确性避免了荧光染料对pcr反应的影响。

rnaseh2是一种广泛存在于真核生物和原核生物中核糖核酸酶，可以通过断裂磷酸二酯键，有效地移除rna/dna杂交链中的rna链，在dna复制起始、转录过程中r-loop的移除、dna的错配修复、冈崎片段中rna引物的降解等过程发挥重要的作用。rnaseh2可以水解各种类型的rna/dna杂交链，甚至包括仅含单个核糖核甘酸的杂交链。

rnaseh2是一种专一识别rna-dna杂合体的酶，并能特异识别单个rna碱基与dna模板互补的位点。本专利利用rnaseh2和pcr技术相结合开发一种针对egfrt790m突变位点基因的检测，目前还没有查到将该方法运用到egfrt790m位点基因检测中的相关技术。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明运用了双相酶系统rnaseh2和dna聚合酶技术，自主设计相关基因检测的引物和探针序列，进一步提供了一种针对egfrt790m位点基因突变进行检测的试剂盒，可以更灵敏方便地对样本进行检测。

本发明的技术方案是这样实现的：本发明第一方面提供了一组针对egfrt790m位点基因突变检测的引物组合，所述引物组合包括引物序列seqidno.1和seqidno.2。其中，小写字母a代表核糖核酸碱基，大写字母代表脱氧核糖核酸碱基，所述引物序列seqidno.1的3'端连接有间隔臂x，这样使引物能够特异地与模板序列结合，并在rnaseh2剪切后能特异扩增。

本发明第二方面提供了一种针对egfrt790m位点基因突变检测的探针，该探针分别位于相应靶核酸序列区域中的一段寡核苷酸单链序列，能特异地和靶核酸序列碱基配对，所述探针包括针对egfrt790m位点基因突变对应的探针序列seqidno.3，序列seqidno.3的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述seqidno.3探针5’端标记有fam荧光基团，3’端标记有淬灭基团bhq1。

本发明第三方面提供了一种针对egfrt790m位点基因突变检测的酶混合液，包括rnaseh2和taqdna聚合酶，所述rnaseh2与taqdna聚合酶酶活性浓度比为1:50～1:400，优选酶活性浓度比为1:250。

本发明第四方面提供了一种针对egfrt790m位点基因突变检测的试剂盒，包括上述特异性引物序列seqidno.1和seqidno.2、上述探针序列seqidno.3、上述酶混合液、pcr缓冲液和4种dntps。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述针对egfrt790m位点基因突变检测的试剂盒由以下试剂组成：

(1)pcr反应预混液：成分包括pcr缓冲液、4种dntps、探针seqidno.3和通用人源性内标探针、引物由seqidno.1和seqidno.2及通用内标引物混合而成；

(2)酶混合液：成分包括rnaseh2和taqdna聚合酶，所述rnaseh2与taqdna聚合酶酶活性浓度比为1:50～1:400；

(3)阴性质控品：构建的egfrt790m位点突变阴性的质粒模板；

(4)阳性质控品：构建的egfrt790m位点突变阳性的质粒模板。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述酶混合液中，rnaseh2与taqdna聚合酶酶活性浓度比为1:250。

本发明第五方面提供了一种针对egfrt790m位点基因突变检测的方法，包括以下步骤：

(1)设计相关基因分型的引物和探针，所述引物如seqidno.1和seqidno.2所示，所述探针如seqidno.3所示；

(2)用dna提取液提取组织或者血浆游离dna模板；

(3)pcr扩增检测：以步骤(2)提取的组织或者血浆游离dna为模板，利用本发明提供的试剂盒进行相应的扩增检测，将pcr反应预混液和酶混合液按照36：0.5的体积比配成混合液后，加入到相应的反应孔中，然后加入提取的组织或者血浆游离dna模板4μl，同时做一个阴性对照孔和一个阳性对照孔，pcr反应条件为95℃预变性5分钟，然后95℃变性10秒，60℃退火延伸45秒，共40次循环，在退火延伸阶段收集荧光；

(4)结果判定：根据各荧光通道的信号值来判断是否有扩增，有扩增就代表该荧光通道对应的检测位点为阳性，即有突变存在；没有扩增，就说明该通道对应的检测位点突变低于本试剂盒检测限。

本发明的试剂盒相对于现有技术具有以下有益效果：

(1)本发明开发了一种新的针对egfrt790m位点基因突变检测的试剂盒，运用了双相酶系统rnaseh2和dna聚合酶技术，由于采用的是双酶系统扩增法，在普通引物的基础上有所改变，即在引物序列seqidno.1的3'端连接有间隔臂x，这样使引物能够特异地与模板序列结合，并在rnaseh2剪切后能特异扩增；

(2)设计了针对egfrt790m突变位点的引物探针，采用荧光pcr，封闭式检测，减少了后期污染的可能性；

(3)本发明提供的试剂盒的敏感度高，检测快速，稳定性好，封闭式检测，减少了后期污染的可能性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的egfrt790m位点突变为阳性时的扩增曲线；

图2为本发明的egfrt790m位点突变为阴性时的扩增曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

实施例一

本实施例设计了针对egfrt790m位点基因突变检测的引物和探针序列，设计针对egfrt790m位点基因突变检测的引物序列seqidno.1和seqidno.2，设计针对egfrt790m位点基因突变检测的探针序列seqidno.3，具体序列如下：

5'-ccgaagggcatgagctgcatgat-x，序列如seqidno.1所示；

5'-ccgaagggcatgagcttca-3'，序列如seqidno.2所示；

fam-cacggtggaggtgaggcagatg-bhq1，序列如seqidno.3所示。

上述引物与普通引物不同的是，本发明专利由于采用的是双酶系统扩增法，即rnaseh2和taqdna聚合酶双酶系统，因此，在普通引物的基础上有所改变，即在引物序列seqidno.1的3'端连接有间隔臂x，这样使引物能够特异地与模板序列结合，并在rnaseh2剪切后能特异扩增；本发明专利经过对序列的分析和引物探针的优化设计，最终筛选出了本发明专利所示的能够对针对egfrt790m突变位点的引物探针。

实施例二

本实施例设计了一种针对egfrt790m位点基因突变检测的试剂盒，为了保证检测系统的可靠性，本发明专利引入了阳性和阴性质控品。

试剂盒具体设计如下：

(1)pcr反应预混液：成分包括pcr缓冲液、4种dntps、探针seqidno.3和通用人源性内标探针、引物由seqidno.1和seqidno.2及通用内标引物混合而成；

(2)酶混合液：成分包括rnaseh2和taqdna聚合酶，所述rnaseh2与taqdna聚合酶酶活性浓度比为1:50；

(3)阴性质控品：构建的egfrt790m位点突变阴性的质粒模板；

(4)阳性质控品：构建的egfrt790m位点突变阳性的质粒模板；

由上述四种试剂按照不同规格包装成不同大小的试剂盒。

实施例三

本实施例设计了一种针对egfrt790m位点基因突变检测的试剂盒，为了保证检测系统的可靠性，本发明专利引入了阳性和阴性质控品。

试剂盒具体设计如下：

(1)pcr反应预混液：成分包括pcr缓冲液、4种dntps、探针seqidno.3和通用人源性内标探针、引物由seqidno.1和seqidno.2及通用内标引物混合而成；

(2)酶混合液：成分包括rnaseh2和taqdna聚合酶，所述rnaseh2与taqdna聚合酶酶活性浓度比为1:250；

(3)阴性质控品：构建的egfrt790m位点突变阴性的质粒模板；

(4)阳性质控品：构建的egfrt790m位点突变阳性的质粒模板；

由上述四种试剂按照不同规格包装成不同大小的试剂盒。

实施例四

本实施例设计了一种针对egfrt790m位点基因突变检测的试剂盒，为了保证检测系统的可靠性，本发明专利引入了阳性和阴性质控品。

试剂盒具体设计如下：

(1)pcr反应预混液：成分包括pcr缓冲液、4种dntps、探针seqidno.3和通用人源性内标探针、引物由seqidno.1和seqidno.2及通用内标引物混合而成；

(2)酶混合液：成分包括rnaseh2和taqdna聚合酶，所述rnaseh2与taqdna聚合酶酶活性浓度比为1:400；

(3)阴性质控品：构建的egfrt790m位点突变阴性的质粒模板；

(4)阳性质控品：构建的egfrt790m位点突变阳性的质粒模板；

由上述四种试剂按照不同规格包装成不同大小的试剂盒。

实施例五

本实施例采用实施例三制备得到的针对egfrt790m位点基因突变检测的试剂盒检测样本，具体检测步骤如下：

(1)设计相关基因分型的引物和探针序列，所述引物为seqidno.1和seqidno.2，所述探针为seqidno.3；

(2)用dna提取液提取组织或者血浆游离dna模板；

(3)pcr扩增检测：以步骤(2)提取的组织或者血浆游离dna为模板，利用本发明提供的试剂盒进行相应的扩增检测，将pcr反应预混液和酶混合液按照36：0.5的体积比配成混合液后，加入到相应的反应孔中，然后加入提取的组织或者血浆游离dna模板4μl，同时做一个阴性对照孔和一个阳性对照孔，pcr反应条件为95℃预变性5分钟，然后95℃变性10秒，60℃退火延伸45秒，共40次循环，在退火延伸阶段收集荧光；

(4)结果判定：根据各荧光通道的信号值来判断是否有扩增，有扩增就代表该荧光通道对应的检测位点为阳性，即有突变存在；没有扩增，就说明该通道对应的检测位点突变低于本试剂盒检测限。

按实施例五方法测定的egfrt790m位点基因突变阳性样本的扩增曲线如附图1所示；测定的egfrt790m位点基因突变阴性样本的扩增曲线如附图2所示。

将针对egfrt790m位点基因突变检测的试剂盒用于某组织或者血浆样本的检测，采用dna提取液提取组织或者血清样本中的dna模板，按实施例五方法步骤进行检测，检测所得扩增曲线如附图1所示，图1显示该样本egfrt790m突变为阳性，试剂盒检测结果与测序结果一致。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>武汉千麦医学检验所有限公司

<120>一种针对egfrt790m位点突变进行检测的试剂盒

<130>2018-10-31

<141>2018-11-13

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>（人工合成）

<400>1

ccgaagggcatgagctgcatgat23

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>（人工合成）

<400>2

ccgaagggcatgagcttca19

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>（人工合成）

<400>3

cacggtggaggtgaggcagatg22