一种与绵羊单胎多羔性状相关的SNP分子标记及其检测试剂盒和应用的制作方法

本发明属于绵羊snp分子标记技术领域，尤其涉及一种与绵羊单胎多羔性状相关的snp分子标记及其检测试剂盒和应用。

背景技术：

产羔性状是绵羊的重要经济性状之一。对于绵羊而言，提高每胎的产羔数是提升生产经济效益的重要措施。应用基因组学方法的研究能在整个基因组的水平去筛选出与绵羊繁殖性状相关的候选基因和分子标记，使学者们能够更深入的理解绵羊多羔性状的遗传机理，可对我国绵羊业的可持续发展将带来巨大的经济效益。

lhcgr基因位于绵羊3号染色体上，包含11个外显子，编码区总长1965bp，编码蛋白含654个氨基酸，该基因在山羊、牦牛、水牛、羊驼、猫、老虎和猪之间具有非常高的同源性。哺乳动物的生殖活动主要受下丘脑、垂体、性腺轴的激素调节，gnrh通过刺激促性腺激素细胞分泌合成fsh，fsh与其受体相结合发挥作用，诱导促黄体素(lh)合成与释放并与lhr的胞外功能区相结合，激活g蛋白，进而激活camp系统，引起甾体激素的合成与分泌，从而参与哺乳动物受精卵着床、性腺发育等一系列生理活动的调节。因此，在卵巢中lhcgr的相对表达对研究动物多羔机制有十分重要的意义。在很多物种中，lhcgr已经被证实在卵巢组织的膜细胞和排卵前卵泡的颗粒细胞中表达。而wei对绵羊的研究也说明了lhcgr的表达水平会影响卵泡的发育，从而影响动物的繁殖性能。(weis，shenx，gongz，etal.fshrandlhrexpressionandsignalingaswellasmaturationandapoptosisofcumulus-oocytecomplexesfollowingtreatmentwithfshreceptorbindinginhibitorinsheep[j].cellularphysiologyandbiochemistry，2017，43(2):660-669.)

胡威研究表明，在黄体期和卵泡期牦牛的卵巢、子宫、输卵管组织中lhcgr基因的表达量存在差异，提示lhcgr在牦牛的繁殖过程中具有重要的调节作用。(胡威，陈虹，潘阳阳，等.lhr在牦牛肾和卵巢中表达情况的研究[j].中国兽医科学，2015，45(02)：212-216.

胡威，崔燕，潘阳阳，等.黄体生成素受体基因在牦牛发情周期不同阶段生殖系统中的表达模式[j].生物技术通报，2015，31(09):232-237.)

wohlres在瘤牛中观察到，通过lhcgr亚型表达模式的连续变化来调节lhcgr功能可能在优势卵泡的早期选择性差异中起重要的作用。(wohlres-vianas，arashiroekn，machadoma，etal.intrafollicularoestradiolproduction，expressionofthelhreceptor(lhr)geneanditsisoforms，andearlyfolliculardeviationinbosindicus[j].reproduction，fertilityanddevelopment，2017，29(10):1958-1970.)

目前尚没有发现与绵羊产羔性能紧密相关的snp位点。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与绵羊多羔性状相关的snp分子标记及其检测试剂盒和应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种与绵羊多羔性状相关的snp分子标记，所述snp位点位于绵羊第3号染色体上第75748150bp位点nc_019460.1(75708269-75749862)，所述位点上存在a/g碱基突变，与绵羊多羔具有显著的相关性，当所述位点为a碱基时，绵羊具有单胎产多羔性状；当所述位点为g碱基时，绵羊无单胎产多羔性状；所述snp位点信息基于的绵羊基因组序列信息版本号为oar_v3.1，2012年9月。

本发明还提供了利用sequenomsnp技术检测所述snp位点的引物组，包括第一引物、第二引物和延伸引物；所述第一引物的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述第二引物的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述延伸引物的核苷酸序列如seqidno.3所示。

本发明还提供了利用sequenomsnp技术检测所述snp位点的试剂盒，包括dntps、taqdna聚合酶、mgcl2、pcr反应缓冲液和sap酶，还包括所述的引物组。

优选的，所述引物组中第一引物和第二引物的使用浓度独立为0.45～0.55μmol/l；所述引物组中的延伸引物的浓度为0.6～1.3μmol/l。

优选的，所述试剂盒还包括基因型为aa的标准阳性模板dna。

本发明还提供了利用sequenomsnp技术检测与绵羊多羔性状相关的所述snp分子标记位点的方法，包括以下步骤：

1)提取待测绵羊的基因组dna；

2)以待测绵羊的基因组dna为模板，利用所述引物组中的第一引物和第二引物进行pcr扩增反应获得pcr扩增产物；

3)用sap酶对步骤2)中获得的pcr扩增产物进行消化获得消化后的产物；

4)以消化后的产物为模板，利用所述引物组中的延伸引物进行延伸反应获得延伸产物；

5)利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定所述snp位点的基因型。

优选的，步骤2)中所述pcr扩增反应使用的反应体系以以5μl计包括：

所述pcr扩增反应的程序为：

预变性94℃2min；

变性94℃20s；

退火56℃30s；

延伸72℃60s；

所述变性、退火和延伸步骤进行45个循环后；72℃保持3min。

优选的，步骤3)中所述消化体系以2μl计包括：

10×sapbuffer0.17μl；

1.7u/μlsap酶0.3μl；

去离子水1.53μl；

所述消化的程序为：37℃，40min；85℃，5min。

优选的，步骤4)中所述延伸反应的体系以2μl计包括：

所述延伸反应的程序为：

94℃30s；

[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)]；其中所述(52℃5s，80℃5s)进行5个循环，所述[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)]进行40个循环；

72℃3min。

本发明还提供了所述的snp位点在绵羊辅助育种中的应用，在绵羊育种过程中，筛选所述snp位点为a碱基的绵羊进行后续育种。

本发明的有益效果：本发明提供的与绵羊多羔性状相关的snp分子标记，所述snp位点位于绵羊第3号染色体上第75748150bp位点nc_019460.1(75708269-75749862)，所述位点上存在a/g碱基突变，与绵羊多羔具有显著的相关性，当所述位点为a碱基时，绵羊具有单胎产多羔性状；当所述位点为g碱基时，绵羊无单胎产多羔性状。所述snp位点的a/g碱基突变与绵羊多羔性状紧密相关，通过对所述snp位点进行分型即可确定待测绵羊产羔性能。

本发明提供的利用sequenomsnp技术检测绵羊所述snp位点基因型的方法，灵敏度，准确性更高，性价比更高，能同时对数百至数千份样本中数十到数百个snp位点进行检测。

本发明中所述方法可对所述snp位点实现自动化检测，在绵羊育种过程中，可以将具有单胎产多羔性状的aa纯合个体和ag杂合个体选留下来，从而提高绵羊的繁殖力，对绵羊大规模分子育种具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中利用sequenomsnp技术对lhcgr基因的三种基因型，即aa、ag和gg的检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种与绵羊多羔性状相关的snp分子标记，所述snp位点位于绵羊第3号染色体上第75748150bp位点nc_019460.1(75708269-75749862)，所述位点上存在a/g碱基突变，与绵羊多羔具有显著的相关性，当所述位点为a碱基时，绵羊具有单胎产多羔性状；当所述位点为g碱基时，绵羊无单胎产多羔性状；所述snp位点信息基于的绵羊基因组序列信息版本号为oar_v3.1，2012年9月。本发明中所述snp位点位于促黄体激素受体基因lhcgr中。

本发明还提供了利用sequenomsnp技术检测所述snp位点的引物组，包括第一引物、第二引物和延伸引物；所述第一引物的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述第二引物的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述延伸引物的核苷酸序列如seqidno.3所示。具体如下：第一引物5’-acgttggatgggagggcttatttgatccag-3’；第二引物：5’-acgttggatggagctgaactttataggagg-3’；延伸引物：5’-cttgtcagcttatatctccaact-3’。

本发明所述的sequenomsnp技术结合多重pcr技术、massarrayiplex单碱基延伸技术和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术对基因进行分型检测。利用此方法可对促黄体激素受体基因的snp位点实现自动化检测。

本发明还提供了利用sequenomsnp技术检测所述snp位点的试剂盒，包括dntps、taqdna聚合酶、mgcl2、pcr反应缓冲液和sap酶，还包括所述的引物组。本发明中，所述引物组中第一引物和第二引物的使用浓度优选的独立为0.45～0.55μmol/l，更优选的独立为0.50μmol/l；所述引物组中的延伸引物的浓度优选为0.6～1.3μmol/l。在本发明中，所述dntps的使用浓度优选为20～30μmol/l，更优选为25μmol/l；所述taqdna聚合酶的使用浓度优选为4～6u/μl，更优选为5u/μl；所述mgcl2的使用浓度优选为20～30mmol/l，更优选为25mmol/l；所述pcr反应缓冲液优选为10×pcr反应缓冲液；所述sap酶的酶活优选为1.7u/μl。本发明中所述试剂盒优选的还包括10×sapbuffer。在本发明中，所述试剂盒优选的还包括基因型为aa的标准阳性模板dna；所述标准阳性模板dna作为阳性对照，增加所述snp位点检测的准确性。

本发明还提供了利用sequenomsnp技术检测与绵羊多羔性状相关的所述snp分子标记位点的方法，包括以下步骤：1)提取待测绵羊的基因组dna；2)以待测绵羊的基因组dna为模板，利用所述引物组中的第一引物和第二引物进行pcr扩增反应获得pcr扩增产物；3)用sap酶对步骤2)中获得的pcr扩增产物进行消化获得消化后的产物；4)以消化后的产物为模板，利用所述引物组中的延伸引物进行延伸反应获得延伸产物；5)利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定所述snp位点的基因型。

在本发明中，首先提取待测绵羊的基因组dna。本发明对所述待测绵羊的种类没有特殊要求，任何种类的绵羊均可，在本发明实施例中采用的是小尾寒羊绵羊；本发明对所述待测绵羊基因组的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的动物细胞基因组提取方法即可，在本发明具体实施过程中，采用血液基因组dna提取系统(目录号：dp349)进行提取。

本发明在获得所述待测绵羊基因组dna后，以待测绵羊的基因组dna为模板，利用所述引物组中的第一引物和第二引物进行pcr扩增反应获得pcr扩增产物。本发明中所述pcr扩增反应使用的反应体系以以5μl计优选的包括：

所述pcr扩增反应的程序优选为：

预变性94℃2min；

变性94℃20s；

退火56℃30s；

延伸72℃60s；

所述变性、退火和延伸步骤进行45个循环后；72℃保持3min。本发明在所述pcr扩增完成后，优选的将pcr扩增产物保存于4℃。本发明所述pcr扩增反应结束后，所述pcr扩增产物中含有目标snps位点所在的dna片段。

本发明在获得所述pcr扩增产物后，用sap酶对获得的pcr扩增产物进行消化获得消化后的产物。在本发明中所述消化体系以2μl计优选的包括：10×sapbuffer，0.17μl；1.7u/μlsap酶，0.3μl；去离子水，1.53μl；在本发明中，所述消化的程序为：37℃，40min；85℃，5min。本发明中所述消化后的产物优选的保存于4℃。本发明中所述消化的作用为消化掉pcr扩增反应体系中的引物序列和剩余的dntps。

本发明在获得所述消化产物后，以消化后的产物为模板，利用所述引物组中的延伸引物进行延伸反应获得延伸产物。本发明中，所述延伸反应的体系以2μl计，优选的包括：

本发明中，所述延伸反应的程序优选为：94℃30s；94℃5s，52℃5s，80℃5s，其中所述(52℃5s，80℃5s)进行5个循环，所述[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)]进行40个循环；72℃3min。

本发明中，所述延伸体系中的10×iplexbufferplus、iplexterminator、0.6-1.3μmol/lprimermix和iplex酶来源于goldreagentset试剂盒。本发明所述延伸反应过程中，对延伸体系中的待检snp位点进行单碱基延伸，位点特异性的延伸引物将在突变位点处延伸一个碱基并终止。延伸引物将根据突变类型的差异而连接上不同的ddntps，形成分子量差异。本发明子在获得所述延伸产物后，优选的将所述延伸产物经过树脂纯化，本发明对所述树脂纯化的方法没有特殊限定，采用本领域常规的树脂纯化即可。

本发明在获得所述延伸产物后，利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定所述snp位点的基因型。本发明将所述延伸产物点样至靶片上，并使用质谱仪对不同延伸产物的分子量差异进行检测，通过数据分析，就可得到各突变位点的具体基因型。本发明中，所述质谱点样有关的使用massarraynanodispenserrs1000进行；所述质谱分析优选的使用massarraycompactsystem进行；本发明在所述质谱分析后，优选的利用typer4.0软件检测质谱峰，并根据质谱峰图判读各样本目标位点基因型。

本发明中所述sequenomsnp技术的基本原理为：首先使用第一引物和第二引物扩增目标snps所在dna片段，在扩增产物中加入sap酶消化掉反应体系中的引物序列和剩余的dntps，然后利用延伸引物对待检snp位点同时进行单碱基延伸，位点特异性的延伸引物将在突变位点处延伸一个碱基并终止。延伸产物将根据突变类型的差异而连接上不同的ddntps，形成分子量差异。延伸产物在经过树脂纯化后，将点样至靶片上，并使用质谱仪对不同延伸产物的分子量差异进行检测，通过数据分析，就可得到各突变位点的具体基因型。

本发明还提供了所述的snp位点在绵羊辅助育种中的应用，在绵羊育种过程中，筛选所述snp位点为a碱基的绵羊进行后续育种。在本发明中所述snp位点的筛选优选的采用上述sequenomsnp技术；优选的筛选snp位点为aa基因型和aa基因型的绵羊进行后续育种，更优选筛选snp位点为aa基因型的绵羊进行后续育种。本发明所述应用可以将具有高产羔数性状的基因型aa纯合个体和基因型ag杂合个体选留下来，从而提高绵羊的繁殖力，对绵羊大规模分子育种具有非常大的应用价值。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1

一种利用sequenomsnp技术检测绵羊lhcgr基因型并预测经产母羊窝平均产羔数的方法

1、实验材料

选取358只小尾寒羊绵羊为检测对象。

2、试剂及仪器

试剂：completegenotypingreagentkitforcompact384；

基因扩增：abi9700384dual；

质谱点样：massarraynanodispenserrs1000；

质谱分析：massarraycompactsystem；

所有试剂和仪器均购自北京康普森生物技术有限公司(beijingcompassbiotechnologyco.,ltd)。

3、基因组dna的提取

绵羊颈静脉采血1ml，用edta抗凝处理。使用天根血液基因组dna提取系统(目录号：dp349)进行提取dna。

4、sequenomsnp技术进行基因分型

针对绵羊第3号染色体上第75748150bp位点(nm_001278566.1，基于绵羊基因组序列信息版本号oar_v4.0，2015年12月)设计引物组合。

pcr扩增引物的核苷酸序列如下：

2nd-pcrp：acgttggatggagctgaactttataggagg(seqidno.1)；

1st-pcrp：acgttggatgggagggcttatttgatccag(seqidno.2)；

延伸引物序列及延伸产物如表1所示。

表1延伸引物序列及延伸产物

上述引物由北京康普森生物技术有限公司合成。

检测流程如下：

1、提取待测绵羊的基因组dna；

2、以待测绵羊的基因组dna为模板，利用上述引物2nd-pcrp和1st-pcrp进行pcr扩增反应；

3、用sap酶对pcr扩增产物进行消化；

4、以消化后的pcr扩增产物为模板，利用所述延伸引物s1进行延伸反应；

5、分析延伸产物，从而对绵羊lhcgr基因型进行判定。

其中，pcr扩增反应使用384孔pcr板进行，每孔加量为5μl，所述反应体系5μl计包括：

pcr扩增反应的扩增程序为：94℃2min；94℃20s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃3min；4℃保存。

对pcr扩增产物进行消化，使用的sap酶消化体系2μl每孔，所述反应体系以2μl计为包括：10×sapbuffer，0.17μl；1.7u/μlsap酶，0.3μl；去离子水，1.53μl；

反应条件为：37℃40min，85℃5min，4℃保存。

延伸反应体系2μl每孔，所述反应体系以2μl计为包括：

反应条件为：94℃30s；94℃5s，52℃5s，80℃5s，5个循环，40个循环；72℃3min；4℃保存。

将树脂纯化后的延伸产物移至384孔spectrochip(sequenom)芯片上，进行maldi-tof-ms(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)反应，利用typer4.0软件检测质谱峰，并根据质谱峰图判读各样本目标位点基因型。经质谱分析得到pcr扩增产物大小为103bp，延伸产物的质谱检测结果如图1所示。由图可看出该位点有三种基因型，其中第一条虚线处倒三角图标代表检测到7个gg型，中间的虚线处正方形图标代表检测到46个ag型，最下面一条虚线处的正三角图标代表检测到254个aa型。

统计结果：待测绵羊第3号染色体上第75748150bp位点不同基因型分析统计结果见表2。

表2待测绵羊第3号染色体上第75748150bp位点不同基因型分析统计

待测绵羊第3号染色体上第75748150bp位点不同基因型与小尾寒羊产羔数关联分析统计结果见表3。

表3待测绵羊第3号染色体上第75748150bp位点不同基因型与小尾寒羊产羔数关联分析

注：a、b表示差异极显著(p<0.01)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120>一种与绵羊单胎多羔性状相关的snp分子标记及其检测试剂盒和应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

acgttggatggagctgaactttataggagg30

<210>2

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

acgttggatgggagggcttatttgatccag30

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cttgtcagcttatatctccaact23