本发明涉及生物活性物质制备与应用技术领域，具体涉及一种从菠萝中提取神经酰胺的方法及应用。
背景技术：
神经酰胺(ceramide)，即n-酯酰基(神经)鞘氨醇，是皮肤角质层的重要组分，具有屏障、粘合、保湿、抗衰老、抗过敏等作用，越来越广泛地应用到日化、医学及化妆品行业。最新的研究发现，神经酰胺可以通过活化多种蛋白激酶和转录因子参与细胞内信号传导，从而影响细胞生长、增殖、分化、凋亡及损伤等多种生理、病理过程。作为一种新型生物活性物质，在医药保健和化妆品行业具有广阔的应用前景。
目前，由于神经酰胺分子结构的多样性，而且在生物试样中的含量极低，导致神经酰胺的分离和分析非常困难。神经酰胺由长链鞘氨醇通过酰胺键与脂肪酸共价结合而成，其中鞘氨醇和脂肪酸的碳链长度、不饱和度和羟基数目是可变化的。
根据《中国植物志》记载，菠萝属于凤梨科植物。《中华本草》记载菠萝叶具有消食和胃、止泻功能，主治夏日暑泻，消化不良，胃脘胀痛。王伟等人对菠萝叶中的化学成分进行了系统的研究，从乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部分分离得到过7个化合物成分，但均不是酰胺类成分，大部分为酚类物质。《中国中药杂志》第32卷第5期名称为“菠萝叶中新的酰胺类成分”的文章公开了一种研究菠萝叶中化学成分的方法，采用硅胶，sephadexlh-20及大孔吸附树脂等色谱分离方法，从菠萝叶80％乙醇提取物中分离得到一个酰胺类化合物，结合nmr、ir、ms等技术，确定结构为1-o-β-d-葡萄糖-n-正二十二碳酰基-正十六碳-4,10(e，e)-二烯鞘氨醇苷。
本申请的发明人在研究中发现，新鲜的菠萝皮与菠萝叶部位的醇提化合物、活性物质接近，包括2,4-二氯苯甲酸、小麦黄素、金圣草黄素、甘油酯类活性物质、n-酯酰基鞘氨醇类物质。“菠萝叶中新的酰胺类成分”文中公开的提取分离酰胺类物质的方法包括乙醇回流提取、减压浓缩、稀释离心、大孔树脂吸附、水洗、醇解析、柱色谱梯度洗脱、凝胶柱色谱洗脱、分离纯化，从5kg的菠萝叶中提取出20mg的目标化合物。
经实验发现，上述方法存在以下问题：1、菠萝叶水洗、高温干燥后就使用高浓度的80％乙醇回流提取，没有进行切断、粉碎等步骤，菠萝叶中的活性物质不能充分地破壁释放，导致提取出的活性物质大大减少，高温干燥也容易破坏高温致敏性活性物质，导致活性物质变性，化合物增多，增大分离提纯难度；2、大孔树脂吸附后采用过色谱硅胶柱、氯仿-甲醇梯度洗脱，在硅胶拌样和洗脱的过程中，不仅大大稀释了n-酯酰基鞘氨醇类物质的浓度，而且氯仿、甲醇毒性大、用量大，增加了提取成本，无法实现工业化生产；3、没有利用新鲜菠萝皮部位进行提取，造成了资源的浪费，降低了n-酯酰基鞘氨醇类物质的收率。
技术实现要素：
为了克服上述的技术问题，本发明的目的在于提供一种从菠萝中提取神经酰胺的方法及应用，选取未成熟菠萝的菠萝叶与菠萝皮，设计出菠萝挑选与预处理、冷冻干燥、粉碎、提取、浓缩、萃取、分离、柱层析分离、梯度洗脱、重结晶的工艺路线，工艺设计合理，使用的溶剂毒性小，无苛刻条件，可得到高纯度的n-酯酰基鞘氨醇类物质，结合nmr、ms、hplc检测，检测结果显示该n-酯酰基鞘氨醇类物质为1-o-β-d-葡萄糖-n-正二十二碳酰基-正十六碳-4,10(e，e)-二烯鞘氨醇苷，纯度达到98.7％，收率从现有技术中的0.0004％提高到0.13％，适合大规模工艺化生产。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种从菠萝中提取神经酰胺的方法，包括以下步骤：
s1、菠萝挑选与预处理：选取生长一年两个月以上、未成熟的菠萝，剥下菠萝叶，削下1-2mm厚的表层菠萝皮，收集菠萝叶与菠萝皮，剪切成长3-5cm长条状，使用6-8wt％的碳酸钠溶液浸润20-30min，取出后放入盛装有纯化水的超声波清洗器中，超声5-8min后，取出，静置沥干水分；
本发明在菠萝挑选与预处理步骤中，在预先的研究中发现新鲜的菠萝皮与菠萝叶部位的醇提化合物、活性物质接近，均含有一定量的n-酯酰基鞘氨醇类物质，而一年半以上成熟菠萝中的菠萝皮、菠萝叶中的糖类、维生素含量较高，2,4-二氯苯甲酸、小麦黄素、金圣草黄素、甘油酯类活性物质、n-酯酰基鞘氨醇类物质含量少。因此，选取尚未成熟的菠萝中的菠萝叶和表层菠萝皮，剪切成长条状后增加了菠萝叶与菠萝皮的比表面积，在碳酸钠溶液的浸润过程中，增加了与溶液的接触面积，同时利于去除表面的灰尘和农药，使菠萝皮内层粘附的胶状物质菠萝朊酶在碱性条件下水解，利于后续工序中活性物质的释放。超声波清洗可以通过超声波空化作用现象使菠萝皮、菠萝叶表面残留的碳酸钠溶液扩散溶解于水中，使易变性物质菠萝有机酸溶解于水中，利于后续工序中活性物质的提取分离。
s2、冷冻干燥、粉碎：沥干水分后的菠萝叶、菠萝皮送入蒸汽回转干燥机中，通入70±5℃的热蒸汽，作用时间为40-60s，保证中药材的中心温度在30±5℃之间，冷却至室温；然后送入真空冷冻干燥机中，在-15℃～-10℃冷冻干燥1-2h；投入粉碎机预粉碎成颗粒状，过20-40目筛，去除细小粉末，筛余物放入冷冻料桶中，-5℃冷冻10min，超微粉碎得到粒径8-12μm的叶皮混合细粉；
本发明的冷冻干燥、粉碎工艺中，先将菠萝叶、菠萝皮通入蒸汽回转干燥机中，使用70±5℃的热蒸汽进行40-60s的短时热处理，不会使菠萝叶、菠萝皮过分热涨致孔，热敏性物质、蛋白质、维生素也不至于受热变性，降低了残余水份含量，冷却至室温后活性成分不会失活；-15℃～-10℃冷冻干燥1-2h，可以将菠萝叶、菠萝皮预先降温冻结成固体，然后在真空条件下使水蒸气升华出来，而热敏性物质、蛋白质、维生素等活性物质会剩留在冻结的冰架子中，干燥后体积差异小，呈现疏松多孔的结构，而且低温下氧气极少，容易被氧气氧化的酚类物质、n-酯酰基鞘氨醇类物质不会被氧化失活，最大限度地保留了活性物质。粉碎步骤中，采用低温超微粉碎，不会使菠萝叶、菠萝皮变脆，保留不耐高温的黄酮类、苷类、糖类、挥发油等生物活性成分，促进活性成分的释放和溶出，4000-5000r/min的高电机转速加压破壁对中药材的细胞充分粉碎破壁，增大比表面积，提高了生物利用度。
s3、提取、浓缩：叶皮混合细粉加入到多功能提取罐内，加入6倍量70％乙醇，回流提取1-2h，再加入4倍量85％乙醇，回流提取40-60min；提取液使用真空吸入单效外循环浓缩罐内，减压浓缩除去乙醇得到浓缩浸膏；
本发明在提取、浓缩步骤中，先选取6倍量70％乙醇进行回流提取，再使用4倍量85％乙醇进行回流提取，而现有技术中直接采用大量的80％乙醇回流提取2次。与现有技术相比，本发明先使用低浓度、较多量乙醇进行1-2h回流提取，再使用高浓度、较少量乙醇进行40-60min回流提取。一方面，小粒径的叶皮混合细粉已经在超微粉碎过程充分破壁，有效成分已经基本释放，无需大量的高浓度乙醇进行醇提；另一方面，低浓度乙醇与细粉的接触面积大，醇溶性成分提取率高，再使用高浓度乙醇，补充已蒸发掉的乙醇，增加乙醇浓度，提取出醇溶性较差的活性物质，两步提取液浓缩后，可以得到活性物质含量高的浓缩浸膏。
s4、萃取、分离：向浓缩浸膏中加入6-8倍量的纯化水，分四次萃取，先加入6倍量石油醚，离心分离40-50s，萃取，放出一次水相；一次水相加入浓缩浸膏4倍量的正己烷，离心分离30-40s，萃取，放出二次水相；二次水相加入浓缩浸膏2倍量的环己烷，离心分离20-30s，萃取，放出三次水相；三次水相中加入浓缩浸膏8-10倍量的乙酸乙酯，搅拌30-50min后萃取，静置分层后取出乙酸乙酯层，重复萃取2-3次，合并萃取液，减压浓缩得到焦油状脂类混合物；
本发明萃取、分离步骤中，具体分为四次萃取过程，采用小极性溶剂石油醚、正己烷、环己烷进行前三次萃取，再使用中等极性、溶解性好的乙酸乙酯进行第四次萃取，由于石油醚、正己烷、环己烷极性接近但又依次增大，可以依次萃取出极性与石油醚、正己烷、环己烷接近的小极性杂质，最后使用乙酸乙酯萃取出中等极性的酯溶性物质。
s5、柱层析分离：将脂类混合物溶解于二氯甲烷溶剂中，使用葡萄糖凝胶柱sephadexlh-20层析处理，合并层析液、减压浓缩得到神经酰胺粗品；
s6、梯度洗脱：使用极性逐渐增大的乙酸乙酯/石油醚混合溶液进行梯度洗脱，通过神经酰胺苯甲酰化uv法检测洗脱液，合并洗脱液、浓缩得到神经酰胺精品；
s7、重结晶：神经酰胺精品溶解于dmf/环己烷混合溶液中，重结晶、真空干燥得到神经酰胺纯品。
作为本发明进一步的方案，所述步骤s1中超声波清洗器的超声频率为35-40khz，超声波功率密度为0.45-0.5w/cm2。
作为本发明进一步的方案，所述步骤s2中超微粉碎采用气流粉碎，粉碎压力为7-10bar，电机转速为3600-3900r/min。
作为本发明进一步的方案，所述步骤s3中减压浓缩的温度为50-60℃，真空度为-0.085～-0.08mpa。
作为本发明进一步的方案，所述步骤s5中层析处理时先使用20％乙醇除去杂质，再使用40％乙醇洗脱，最后使用70％乙醇洗脱，收集洗脱液。
作为本发明进一步的方案，所述步骤s6中梯度洗脱具体为：依次使用体积比9:1、8:1、6:1、4:1、2:1的乙酸乙酯/石油醚混合溶液进行洗脱，每个梯度洗脱体积100ml，流速控制在2.5ml/min。
作为本发明进一步的方案，所述步骤s7中重结晶具体为：缓慢加入体积比3:1的dmf/环己烷混合溶液，搅拌升温至55℃，添加至神经酰胺精品溶解完全，停止搅拌，静置降至室温，-5℃冰乙醇冰浴结晶6-8h。
本发明的重结晶步骤中，发明人通过对重结晶溶剂、温度条件进行了大量的筛选和实验，发现采用体积比3:1的dmf/环己烷混合溶液、-5℃冰乙醇结晶时，可以析出高纯度的n-酯酰基鞘氨醇类物质，其中hplc测定纯度达到98％以上。
本发明还提供了一种从菠萝中提取神经酰胺的应用，该神经酰胺在具有保湿补水功能护肤品上的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明的从菠萝中提取神经酰胺的方法，选取未成熟菠萝的菠萝叶与菠萝皮，设计出菠萝挑选与预处理、冷冻干燥、粉碎、提取、浓缩、萃取、分离、柱层析分离、梯度洗脱、重结晶的工艺路线，工艺设计合理，使用到的溶剂乙醇、石油醚、正己烷、环己烷、乙酸乙酯、dmf均为无毒或低毒溶剂，提取分离过程无需苛刻条件，可得到高纯度的n-酯酰基鞘氨醇类物质，结合nmr、ms、hplc检测，检测结果显示该n-酯酰基鞘氨醇类物质为1-o-β-d-葡萄糖-n-正二十二碳酰基-正十六碳-4,10(e，e)-二烯鞘氨醇苷，纯度达到98.7％，收率从现有技术中的0.0004％提高到0.13％，适合大规模工艺化生产。
2、菠萝挑选与预处理步骤中，选取尚未成熟的菠萝中的菠萝叶和表层菠萝皮，剪切成长条状增加了比表面积，在碳酸钠溶液的浸润过程中，增加了与溶液的接触面积，同时利于去除表面的灰尘和农药，使菠萝皮内层粘附的胶状物质菠萝朊酶在碱性条件下水解，利于后续工序中活性物质的释放；超声波清洗通过超声波空化作用现象使表面残留的碳酸氢铵溶液扩散溶解于水中，易变性物质菠萝有机酸溶解于水中，利于后续工序中活性物质的提取分离。
3、冷冻干燥、粉碎工艺中，热蒸汽短时热处理不会使菠萝叶、菠萝皮过分热涨致孔，热敏性物质、蛋白质、维生素也不至于受热变性，降低了残余水份含量，冷却至室温后活性成分不会失活；冷冻干燥可以将菠萝叶、菠萝皮预先降温冻结成固体，然后在真空条件下使水蒸气升华出来，而热敏性物质、蛋白质、维生素等活性物质会剩留在冻结的冰架子中，干燥后体积差异小，呈现疏松多孔的结构，最大限度地保留了活性物质；粉碎采用低温超微粉碎，不会使菠萝叶、菠萝皮变脆，促进活性成分的释放和溶出，4000-5000r/min的高电机转速加压破壁对中药材的细胞充分粉碎破壁，增大比表面积，提高了生物利用度。
4、提取、浓缩步骤中，先使用低浓度、较多量乙醇进行1-2h回流提取，再使用高浓度、较少量乙醇进行40-60min回流提取。一方面，小粒径的叶皮混合细粉已经在超微粉碎过程充分破壁，有效成分已经基本释放，无需大量的高浓度乙醇进行醇提；另一方面，低浓度乙醇与细粉的接触面积大，醇溶性成分提取率高，再使用高浓度乙醇，补充已蒸发掉的乙醇，增加乙醇浓度，提取出醇溶性较差的活性物质，两步提取液浓缩后，可以得到活性物质含量高的浓缩浸膏。
5、萃取、分离步骤中，具体分为四次萃取过程，采用小极性溶剂石油醚、正己烷、环己烷进行前三次萃取，再使用中等极性、溶解性好的乙酸乙酯进行第四次萃取，由于石油醚、正己烷、环己烷极性接近但又依次增大，可以依次萃取出极性与石油醚、正己烷、环己烷接近的小极性杂质，最后使用乙酸乙酯萃取出中等极性的酯溶性物质。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例的一种从菠萝中提取神经酰胺的方法，包括以下步骤：
s1、菠萝挑选与预处理：选取生长一年两个月以上、未成熟的菠萝，剥下菠萝叶，削下1-2mm厚的表层菠萝皮，收集菠萝叶与菠萝皮，剪切成长3-5cm长条状，使用6wt％的碳酸钠溶液浸润30min，取出后放入盛装有纯化水的超声波清洗器中，超声8min后，取出，静置沥干水分；其中，超声波清洗器的超声频率为35-40khz，超声波功率密度为0.45-0.5w/cm2。
s2、冷冻干燥、粉碎：沥干水分后的菠萝叶、菠萝皮送入蒸汽回转干燥机中，通入72℃的热蒸汽，作用时间为52s，保证中药材的中心温度在30±5℃之间，冷却至室温；然后送入真空冷冻干燥机中，在-12℃冷冻干燥1.5h；投入粉碎机预粉碎成颗粒状，过20-40目筛，去除细小粉末，筛余物放入冷冻料桶中，-5℃冷冻10min，超微粉碎得到粒径8-12μm的叶皮混合细粉；其中，超微粉碎采用气流粉碎，粉碎压力为7-10bar，电机转速为3600-3900r/min。
s3、提取、浓缩：叶皮混合细粉加入到多功能提取罐内，加入6倍量70％乙醇，回流提取1-2h，再加入4倍量85％乙醇，回流提取40-60min；提取液使用真空吸入单效外循环浓缩罐内，减压浓缩除去乙醇得到浓缩浸膏；其中，减压浓缩的温度为50-60℃，真空度为-0.085～-0.08mpa。
s4、萃取、分离：向浓缩浸膏中加入6-8倍量的纯化水，分四次萃取，先加入6倍量石油醚，离心分离40-50s，萃取，放出一次水相；一次水相加入浓缩浸膏4倍量的正己烷，离心分离30-40s，萃取，放出二次水相；二次水相加入浓缩浸膏2倍量的环己烷，离心分离20-30s，萃取，放出三次水相；三次水相中加入浓缩浸膏8-10倍量的乙酸乙酯，搅拌30-50min后萃取，静置分层后取出乙酸乙酯层，重复萃取2-3次，合并萃取液，减压浓缩得到焦油状脂类混合物；
s5、柱层析分离：将脂类混合物溶解于二氯甲烷溶剂中，使用葡萄糖凝胶柱sephadexlh-20层析处理，合并洗脱液、减压浓缩得到神经酰胺粗品；其中，层析处理时先使用20％乙醇除去杂质，再使用40％乙醇洗脱，最后使用70％乙醇洗脱，收集洗脱液。
s6、梯度洗脱：使用极性逐渐增大的乙酸乙酯/石油醚混合溶液进行梯度洗脱，通过神经酰胺苯甲酰化uv法检测洗脱液，合并洗脱液、浓缩得到神经酰胺精品；其中，梯度洗脱具体为：依次使用体积比9:1、8:1、6:1、4:1、2:1的乙酸乙酯/石油醚混合溶液进行洗脱，每个梯度洗脱体积100ml，流速控制在2.5ml/min。
s7、重结晶：神经酰胺精品溶解于dmf/环己烷混合溶液中，重结晶、真空干燥得到神经酰胺纯品。其中，重结晶具体为：缓慢加入体积比3:1的dmf/环己烷混合溶液，搅拌升温至55℃，添加至神经酰胺精品溶解完全，停止搅拌，静置降至室温，-5℃冰乙醇冰浴结晶6-8h。
本实施例选取菠萝皮、菠萝叶原料的质量总和为20kg，制备得到灰白色无定型粉末26.0g，收率达到0.13％，hplc检测纯度达到98.7％。
实施例2
本实施例的一种从菠萝中提取神经酰胺的方法，包括以下步骤：
s1、菠萝挑选与预处理：选取生长一年两个月以上、未成熟的菠萝，剥下菠萝叶，削下1-2mm厚的表层菠萝皮，收集菠萝叶与菠萝皮，剪切成长3-5cm长条状，使用7wt％的碳酸钠溶液浸润26min，取出后放入盛装有纯化水的超声波清洗器中，超声6min后，取出，静置沥干水分；其中，超声波清洗器的超声频率为35-40khz，超声波功率密度为0.45-0.5w/cm2。
s2、冷冻干燥、粉碎：沥干水分后的菠萝叶、菠萝皮送入蒸汽回转干燥机中，通入67℃的热蒸汽，作用时间为45s，保证中药材的中心温度在30±5℃之间，冷却至室温；然后送入真空冷冻干燥机中，在-15℃℃冷冻干燥1h；投入粉碎机预粉碎成颗粒状，过20-40目筛，去除细小粉末，筛余物放入冷冻料桶中，-5℃冷冻10min，超微粉碎得到粒径8-12μm的叶皮混合细粉；其中，超微粉碎采用气流粉碎，粉碎压力为7-10bar，电机转速为3600-3900r/min。
s3、提取、浓缩：叶皮混合细粉加入到多功能提取罐内，加入6倍量70％乙醇，回流提取1-2h，再加入4倍量85％乙醇，回流提取40-60min；提取液使用真空吸入单效外循环浓缩罐内，减压浓缩除去乙醇得到浓缩浸膏；其中，减压浓缩的温度为50-60℃，真空度为-0.085～-0.08mpa。
s4、萃取、分离：向浓缩浸膏中加入6-8倍量的纯化水，分四次萃取，先加入6倍量石油醚，离心分离40-50s，萃取，放出一次水相；一次水相加入浓缩浸膏4倍量的正己烷，离心分离30-40s，萃取，放出二次水相；二次水相加入浓缩浸膏2倍量的环己烷，离心分离20-30s，萃取，放出三次水相；三次水相中加入浓缩浸膏8-10倍量的乙酸乙酯，搅拌30-50min后萃取，静置分层后取出乙酸乙酯层，重复萃取2-3次，合并萃取液，减压浓缩得到焦油状脂类混合物；
s5、柱层析分离：将脂类混合物溶解于二氯甲烷溶剂中，使用葡萄糖凝胶柱sephadexlh-20层析处理，合并洗脱液、减压浓缩得到神经酰胺粗品；其中，层析处理时先使用20％乙醇除去杂质，再使用40％乙醇洗脱，最后使用70％乙醇洗脱，收集洗脱液。
s6、梯度洗脱：使用极性逐渐增大的乙酸乙酯/石油醚混合溶液进行梯度洗脱，通过神经酰胺苯甲酰化uv法检测洗脱液，合并洗脱液、浓缩得到神经酰胺精品；其中，梯度洗脱具体为：依次使用体积比9:1、8:1、6:1、4:1、2:1的乙酸乙酯/石油醚混合溶液进行洗脱，每个梯度洗脱体积100ml，流速控制在2.5ml/min。
s7、重结晶：神经酰胺精品溶解于dmf/环己烷混合溶液中，重结晶、真空干燥得到神经酰胺纯品。其中，重结晶具体为：缓慢加入体积比3:1的dmf/环己烷混合溶液，搅拌升温至55℃，添加至神经酰胺精品溶解完全，停止搅拌，静置降至室温，-5℃冰乙醇冰浴结晶6-8h。
本实施例选取菠萝皮、菠萝叶原料的质量总和为20kg，制备得到灰白色无定型粉末24.8g，收率达到0.124％，hplc检测纯度达到97.8％。
实施例3
本实施例的一种从菠萝中提取神经酰胺的方法，包括以下步骤：
s1、菠萝挑选与预处理：选取生长一年两个月以上、未成熟的菠萝，剥下菠萝叶，削下1-2mm厚的表层菠萝皮，收集菠萝叶与菠萝皮，剪切成长3-5cm长条状，使用8wt％的碳酸钠溶液浸润20min，取出后放入盛装有纯化水的超声波清洗器中，超声6min后，取出，静置沥干水分；其中，超声波清洗器的超声频率为35-40khz，超声波功率密度为0.45-0.5w/cm2。
s2、冷冻干燥、粉碎：沥干水分后的菠萝叶、菠萝皮送入蒸汽回转干燥机中，通入75℃的热蒸汽，作用时间为40s，保证中药材的中心温度在30±5℃之间，冷却至室温；然后送入真空冷冻干燥机中，在-10℃冷冻干燥2h；投入粉碎机预粉碎成颗粒状，过20-40目筛，去除细小粉末，筛余物放入冷冻料桶中，-5℃冷冻10min，超微粉碎得到粒径8-12μm的叶皮混合细粉；其中，超微粉碎采用气流粉碎，粉碎压力为7-10bar，电机转速为3600-3900r/min。
s3、提取、浓缩：叶皮混合细粉加入到多功能提取罐内，加入6倍量70％乙醇，回流提取1-2h，再加入4倍量85％乙醇，回流提取40-60min；提取液使用真空吸入单效外循环浓缩罐内，减压浓缩除去乙醇得到浓缩浸膏；其中，减压浓缩的温度为50-60℃，真空度为-0.085～-0.08mpa。
s4、萃取、分离：向浓缩浸膏中加入6-8倍量的纯化水，分四次萃取，先加入6倍量石油醚，离心分离40-50s，萃取，放出一次水相；一次水相加入浓缩浸膏4倍量的正己烷，离心分离30-40s，萃取，放出二次水相；二次水相加入浓缩浸膏2倍量的环己烷，离心分离20-30s，萃取，放出三次水相；三次水相中加入浓缩浸膏8-10倍量的乙酸乙酯，搅拌30-50min后萃取，静置分层后取出乙酸乙酯层，重复萃取2-3次，合并萃取液，减压浓缩得到焦油状脂类混合物；
s5、柱层析分离：将脂类混合物溶解于二氯甲烷溶剂中，使用葡萄糖凝胶柱sephadexlh-20层析处理，合并洗脱液、减压浓缩得到神经酰胺粗品；其中，层析处理时先使用20％乙醇除去杂质，再使用40％乙醇洗脱，最后使用70％乙醇洗脱，收集洗脱液。
s6、梯度洗脱：使用极性逐渐增大的乙酸乙酯/石油醚混合溶液进行梯度洗脱，通过神经酰胺苯甲酰化uv法检测洗脱液，合并洗脱液、浓缩得到神经酰胺精品；其中，梯度洗脱具体为：依次使用体积比9:1、8:1、6:1、4:1、2:1的乙酸乙酯/石油醚混合溶液进行洗脱，每个梯度洗脱体积100ml，流速控制在2.5ml/min。
s7、重结晶：神经酰胺精品溶解于dmf/环己烷混合溶液中，重结晶、真空干燥得到神经酰胺纯品。其中，重结晶具体为：缓慢加入体积比3:1的dmf/环己烷混合溶液，搅拌升温至55℃，添加至神经酰胺精品溶解完全，停止搅拌，静置降至室温，-5℃冰乙醇冰浴结晶6-8h。
本实施例选取菠萝皮、菠萝叶原料的质量总和为20kg，制备得到灰白色无定型粉末24.1g，收率达到0.121％，hplc检测纯度达到97.3％。
实施例4
结构鉴定
采用“菠萝叶中新的酰胺类成分”文章中的检测方法对实施例1制备的粉末进行检测，检测到熔点mp为216～218℃，[α]25d＝+75.6(c0.15，meoh)，分子式为c44h83o9nna，ir(kbr)cm-1:3224,1622,1540处为神经酰胺的典型吸收峰，1h-nmr(c5d5n，500mhz)δ：8.38(1h，d，j＝10.8hz，nh)和13c-nmr(c5d5n，500mhz)δ：175.6，结合dept谱、hmbc谱图的解析，与文章中公开的化合物结构相同，化合物命名为1-o-β-d-葡萄糖-n-正二十二碳酰基-正十六碳-4,10(e，e)-二烯鞘氨醇苷。
应用实施例
将实施例1制备的神经酰胺纯品加入到市售的护肤品大宝sod蜜中，具体是取20g大宝sod蜜，加入2mg的该神经酰胺纯品，混合搅拌均匀得到供试品组，选取市售大宝sod蜜为对照品组。进行皮肤透皮失水值的测试。皮肤透皮失水值的高低可反映皮肤保湿的效果，皮肤透皮失水值高说明皮肤保湿性差，皮肤透皮失水值低说明皮肤保湿性好。
采用tewametertm210(courage+khazaha，koln，germany)方法，测定具有保湿功能的护肤乳与对照护肤乳的皮肤透皮失水值，结果表明：供试品组皮肤透皮失水值为79％；对照品组皮肤透皮失水值为97％。说明本发明制备的神经酰胺应用到护肤品中可以明显增强保湿补水能力。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。