一种低渗低电导率电穿孔缓冲液及其应用的制作方法

本发明属于实验用缓冲液配方，涉及一种电穿孔缓冲液，尤其是涉及一种低渗低电导率电穿孔缓冲液及其应用。

背景技术：

细胞转染是一种重要的技术手段，用于研究目的基因在细胞中的功能。电穿孔是一种重要的转染手段，可用于向细胞中转染dna、rna及药物等(neumann,e.,1982)。目前的研究认为，电穿孔的原理为，外界电场的刺激赋予细胞膜足够的自由能，使细胞膜磷脂分子发生重排，导致细胞膜上疏水性孔洞的产生。随后，混合在电穿孔缓冲液中的外源dna分子即可通过细胞膜孔洞进入到细胞内(neumann,e.,1989)。由于商业化电穿孔缓冲液价格高昂，限制了电穿孔技术的大规模应用。因而，开发一个高效、廉价的电穿孔缓冲液十分必要。国内外部分实验室亦有采用dmem等培养基作为电穿孔缓冲液(shegogue,d.,2004)，但实际操作中发现其转染效率较低，限制了其应用。既往研究发现，转染成功的首要步骤是外源dna和细胞膜的有效接触(wolf,h.,1994；golzio,m.,1998)。而低渗缓冲液可减少外源dna与细胞膜之间的排斥(nikolailebovka.,2008)。同时，在低渗条件下，细胞肿胀，细胞膜上磷脂分子间距大，在细胞膜孔洞形成后，孔洞不易于回封，也可增加外源dna进入细胞的数量。因而，我们推测低渗电穿孔缓冲液可增加转染效率。另一方面，既往研究表明，电导率对转染效率有较大影响，降低电导率可增加电穿孔效率(djuzenova,c.s.,1996)。因而，我们认为，采用低浓度的nacl溶液作为电穿孔缓冲液，可达到低渗、低电导率的目的，增加电穿孔效率。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种低渗低电导率电穿孔缓冲液，所述缓冲液每100ml含30mmnacl。本发明所用缓冲液通过以下方法配制：取175.32mgnacl溶于100ml纯水中，滤器过滤除菌，即得。

本发明的另一个目的是提供上述低渗低电导率电穿孔缓冲液在hela细胞电转染中的应用。

本发明所述低渗低电导率缓冲液在使用时，以hela细胞为例，将hela细胞消化，并重悬在30mmnacl电穿孔缓冲液中。随后，加入2ugpegfp-c1质粒混匀，并将混合液置入电转杯中。使用biorad公司电穿孔仪，采用biorad公司预设hela细胞电穿孔程序进行电穿孔，随后，将电击杯中细胞转移到培养板中，加入dmem培养基继续培养。48小时后流式细胞术，分析egfp阳性细胞比例。

本发明所述低渗低电导率电穿孔缓冲液，由于其低渗、低电导率的性质，可以达到较高的电穿孔效率。本发明经比较转染效率的试验证明，本技术的低渗低电导率缓冲液在用量相同情况下转染效率显著高于dmem，而且在价格上明显低于市售商品，市售商品的价格是几千块一瓶，折合单次100元左右，而本技术的低渗低电导率缓冲液只要几分甚至几毛钱即可。本发明所述低渗低电导率电穿孔缓冲液，配置简便，价格低廉，转染效率显著高于dmem培养基，易于推广。

附图说明

图1为本发明的电穿孔效果示例图。

图2为本发明缓冲液与dmem组及商业化电穿孔缓冲液比较的转染效率图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

将hela细胞培养至70％作用密度，胰酶消化hela细胞后计数，取5*10^5的细胞，离心后用400μl30mmnacl电穿孔缓冲液重悬，随后加入2ug质粒pegfp-c1(质粒增强型绿色荧光蛋白羧基端1)并混匀，将混合液转移到电击杯中，按biorad预设hela电穿孔程序进行电穿孔。电穿孔后，将电击杯中细胞转移至6孔板中，并加入2mldmem培养基继续培养。48小时后荧光显微镜下观察转染效率。如图1所示，转染后hela可高效表达gfp(绿色荧光蛋白)。

实施例2

参见图2，本发明缓冲液与dmem组及商业化电穿孔缓冲液比较的转染效率。将hela细胞培养至70％作用密度，胰酶消化hela细胞后计数，取5*10^5的细胞，离心后用400μl30mmnacl电穿孔缓冲液重悬，随后加入2ugpegfp-c1质粒并混匀，将混合液转移到电击杯中，按biorad预设hela电穿孔程序进行电穿孔。电穿孔后，将电击杯中细胞转移至6孔板中，并加入2ml培养基继续培养。48小时后流式细胞术分析转染效率。如图2d所示，使用本发明所配置的低渗低电导率电穿孔缓冲液转染效率显著高于dmem组(*dmem组vs.本发明,p<0.05)，低于商业化电穿孔缓冲液(genepulser，biorad公司)(#genepulser组vs.本发明,p<0.05)。

技术特征：

技术总结
本发明提供一种低渗低电导率电穿孔缓冲液，所述缓冲液每100ml含30mM NaCl。通过将Hela细胞消化，并重悬在缓冲液中，加入质粒混匀，进行电穿孔，将电击后细胞继续培养，行流式细胞术，即可分析EGFP阳性细胞比例。本发明所述低渗低电导率电穿孔缓冲液，因其低渗、低电导率的性质，可达到较高的电穿孔效率。本发明经比较转染效率，证明低渗低电导率缓冲液在用量相同情况下转染效率显著高于DMEM，而且在价格上明显低于市售商品。本发明所述低渗低电导率电穿孔缓冲液，配置简便，价格低廉，转染效率显著高于DMEM培养基，易于推广。

技术研发人员：孙泽玮;陈文静;郑良荣
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2018.11.15
技术公布日：2019.04.09