一种牛丝氨酸苏氨酸激酶STK11干扰腺病毒的构建方法与流程

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种牛丝氨酸苏氨酸激酶stk11干扰腺病毒的构建方法。

背景技术：

丝氨酸苏氨酸激酶11(serine/threonine，kinase，stk11)，又称肝脏激酶b1(lkbl)，是激活磷酸腺苷活化蛋白激酶(ampk)信号通路的关键上游蛋白分子，参与细胞极性、细胞分裂、细胞增殖、细胞分化、细胞代谢等多种细胞进程，主要通过磷酸化和亚细胞定位两种信号转导机制发挥作用。

研究表明，stk11-ampk途径同时是影响脂肪组织和肌肉组织两大代谢器官的重要信号通路。在模式动物小鼠中的研究发现，敲除脂肪组织stk11基因影响白色脂肪组织和棕色脂肪组织的发育和功能(shan，xiongetal.，2016；zhang,wang，song，&zou，2013)，敲除骨骼肌stk11基因导致骨骼肌代谢紊乱，影响脂滴和脂肪酸氧化(jeppesen等，2013)，增加葡萄糖稳态和胰岛素敏感性，并且条件性敲除小鼠stk11基因，促使脂肪组织在骨骼肌的异位沉积shant(2014)。据此，推测牛stk11基因可能参与牛肌肉-脂肪组织的对话机制并发挥重要的节点交互调控作用。

但是，牛作为一种大型家畜动物，基因敲除模型个体建立难度大，若以分离的原代目的细胞作为研究对象，一般的shrna载体转染效率低、市面上合成的sirna产品作用时效短，因此，研究牛丝氨酸苏氨酸激酶stk11干扰腺病毒，可实现在牛脂肪细胞和肌肉细胞中同时或独立持续敲低stk11基因的表达，为研究stk11基因功能奠定良好的技术基础。

以下是发明人给出的相关参考文献：

【1】shan，t.，etal.，lkb1controlsbrownadiposetissuegrowthandthermogenesisbyregulatingtheintracellularlocalizationofcrtc3.naturecommunications，2016.7(1)。

【2】jeppesen，j.，etal.，lkb1regulateslipidoxidationduringexerciseindependentlyofampk.diabetes，2013.62(5)：p.1490-9。

【3】zhang，w.，etal.，liverkinaseb1isrequiredforwhiteadiposetissuegrowthanddifferentiation.diabetes，2013.62(7)：p.2347-58。

【4】shan，t.，etal.，lkb1isindispensableforskeletalmuscledevelopment，regeneration，andsatellitecellhomeostasis.stemcells，2014.32(11)：p.2893-907。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种牛丝氨酸苏氨酸激酶stk11干扰腺病毒构建方法，以获得stk11基因表达持续敲低的牛脂肪细胞或肌肉细胞研究模型。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种牛丝氨酸苏氨酸激酶stk11干扰腺病毒构建方法，其特征在于，该方法首先筛选干扰效率最高的shrna序列，然后将该shrna序列与干扰腺病毒载体重组，构建stk11干扰腺病毒；

所述的shrna序列为：

5’-gacgacgagctcttcgacatttcaagagaatgtcgaagagctcgtcgtcttttttagatctg-3’。

根据本发明，所述筛选干扰效率最高的shrna序列按以下步骤进行：

步骤a1，克隆秦川牛丝氨酸苏氨酸激酶11(stk11)基因编码区；

步骤a2，构建psicheckⅱ-stk11表达载体；

步骤a3，设计并合成靶向stk11基因的shrna片段；

步骤a4，构建pentr/cmv-gfp/u6-shrna表达载体；

步骤a5，shrna干扰效率的测定与筛选。

进一步地，所述的构建stk11干扰腺病毒按以下步骤进行：

步骤b1，构建载体pdc316-egfp-shrna；

步骤b2，pdc316-egfp-shrna-cstk11腺病毒包装；

步骤b3，pdc316-egfp-shrna-cstk11腺病毒扩增、滴度测定；

步骤b4，pdc316-egfp-shrna-cstk11腺病毒侵染效率与干扰效率的检测。

本发明的牛丝氨酸苏氨酸激酶stk11干扰腺病毒构建方法，所得到的stk11干扰腺病毒在秦川牛原代前脂肪细胞中进行侵染和干扰效率验证，结果表明侵染效果良好，在mrna水平上stk11水平降低76％，蛋白水平也呈显著性下降，可成功实现stk11基因在体细胞中的持续敲低，为今后开展stk11基因功能的相关研究提供了可靠的实验技术。

附图说明

图1是stk11基因cdspcr扩增图；

图2是双荧光素酶报告法测定各shrna的干扰效率图；

图3是pdc316-egfp-shrna载体构建示意图；

图4是pdc316-egfp-shrna-cstk11酶切鉴定图；

图5是ad-shstk11转染后到获得p1代病毒的绿色荧光及白光图；

图6是ad-shstk11病毒感染细胞48h绿色荧光及白光图；

图7是ad-shstk11病毒侵染牛原代前脂肪细胞48h绿色荧光图；

图8是qrt-pcr和western-blot分别在mrna水平和蛋白书平检测stk11的表达。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

本实施例给出一种牛丝氨酸苏氨酸激酶stk11干扰腺病毒构建方法，首先筛选干扰效率最高的shrna序列，然后将该shrna序列与干扰腺病毒载体重组，构建stk11干扰腺病毒；

所述的shrna序列为：

5’-gacgacgagctcttcgacatttcaagagaatgtcgaagagctcgtcgtcttttttagatctg-3’。

本实施例涉及的载体、菌株、细胞、试剂来源如下：

牛前脂肪细胞为国家肉牛改良中心秦川牛肾周脂肪通过酶消化法分离获得。

hek293细胞，购自中科院上海细胞库，dh5α购自天根生化科技有限公司；

rt-pcr试剂盒，购自takara公司，质粒提取、胶回收试剂盒购自omega公司，双荧光素酶试剂盒，购自promega公司。

内切酶、连接酶、maxdnapolymerase高保真酶实时荧光定量pcr试剂盒，均购自takara公司dmem、

胎牛血清(fbs)，购自hyclone公司。

lipo3000转染试剂，购自invitrogen。

蛋白酶抑制剂，购自roche。

兔抗stk11多克隆抗体，购自lsbio公司、兔抗gapdh多克隆抗体(一抗)以及抗兔hrp二抗均购自abcam公司。

其余western-blot相关试剂均购自碧云天。

引物合成在上海英潍捷基贸易有限公司和上海生工公司完成。

酶切、连接、回收、转化、rna提取、pcr扩增等常规分子生物学实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。

所述筛选干扰效率最高的shrna序列按以下步骤进行：

a1步骤，克隆秦川牛丝氨酸苏氨酸激酶11(stk11)基因编码区

a1.1克隆stk11基因引物的设计与合成

以genbank公布的牛的stk11(ncbireferencesequence:xm_024995119.1)基因序列为模板，设计引物克隆cds序列全长，综合考虑基因序列与所用载体mcs序列特征，在上、下游游引物中分别添加了xhoⅰ/pmeⅰ限制性内切酶酶切位点，pcr产物大小是933bp，引物详细信息如下：

stk11上游引物(xhoⅰ)：ccgctcgagatggtgatggagtactgcgtgtgt；

stk11下游引物(pmeⅰ)：agctttgtttaaactcattgctgtttgcaggccgac。a1.2stk11完整的cds区克隆

以提取的秦川牛肾周脂肪组织rna反转录的cdna为模板，利用maxdnapolymerase高保真酶以98℃10sec，55℃5sec，72℃5sec，30～35cycles的程序扩增stk11基因的cds区部分。pcr产物首先用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，发现有符合目的大小的片段后(参考附图1)，然后将目的片段切胶回收，送上海生工测序。

a2步骤，构建psicheckⅱ-stk11表达载体

用xhoⅰ、pmeⅰ双酶切stk11dna片段和psichecktm-2载体，酶切体系如下：

胶回收stk11片段和psichecktm-2酶切片段，然后回收含有粘性末端的psichecktm-ⅱ质粒dna片段和stk11酶切dna片段，将二者连接，连接体系如下：

10μl连接产物全量转化100μl感受态e.colidh5α，冰浴30min，42℃水浴90s后，冰浴2min，加入800ullb液体培养基，37℃摇床培养1h，取100ul菌液涂布于含氨苄的lb琼脂培养皿上，37℃过夜培养，挑取单克隆菌落，在30ml含氨苄的lb液体培养基中震荡培养12-14h，提取质粒并送上海生工用psichecktm-2质粒通用测序引物测序鉴定。

a3步骤，设计与合成靶向stk11基因的shrna片段

a3.1参考shrna的设计原则(dallasandjohnston2013；elbashiretal.2002，tuschl2006)，以牛的stk11(ncbireferencesequence:xm_024995119.1)基因序列为模板，应用shrna在线设计软件(http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/-setoption.do？designoption＝shrna&pid＝4452122476208466843和http://www.thermoscientificbio.com/design-center/？redirect＝true)共设计4条特异shrna，根据其靶向定位在stk11基因cds区的位置依次命名为shrna-961、shrna-1127、shrna-1135和shrna-1150(序列划线部分表示酶切位点，斜体部分表示shrna茎环)。

各序列分别如下：

stk11-shrna-961：

gatccgcggttctccatacagcagattcaagagatctgctgtatggagaaccgctttttta；

agcttaaaaaagcggttctccatacagcagatctcttgaatctgctgtatggagaaccgcg；

stk11-shrna-1127：

gatccgacgacgagctcttcgacatttcaagagaatgtcgaagagctcgtcgtctttttta；

agcttaaaaaagacgacgagctcttcgacattctcttgaaatgtcgaagagctcgtcgtcg；

stk11-shrna-1135：

gatccgctcttcgacattgaggacgatcaagagtcgtcctcaatgtcgaagagctttttta；

agcttaaaaaagctcttcgacattgaggacgactcttgatcgtcctcaatgtcgaagagcg；

stk11-shrna-1150：

gatccggacgacgtcatctacactcatcaagagtgagtgtagatgacgtcgtcctttttta；

agcttaaaaaaggacgacgtcatctacactcactcttgatgagtgtagatgacgtcgtccg。

为确保shrna序列的特异性，将设计的shrna与阴性对照序列与rna数据库blast比对，从而保证其不会靶向作用于其他基因。shrna的详细信息见列表，并将设计的shrna送上海英潍捷基贸易有限公司合成。

a3.2单链dna寡核苷酸退火反应生成双链

分别用100μl退火buffer(10mmtris-hcl，50mmnacl，ph8.0)充分溶解合成dna片段。分别对应各取2μldna引物片段，加入至16μl退火buffer中，充分混匀，100℃退火自然冷却至室温。退火产物分别用无菌水稀释100倍。

a4步骤，构建pentr/cmv-gfp/u6-shrna表达载体

用bamhⅰ和hindⅲ双酶切pentr/cmv-gfp/u6质粒，酶切体系如下：

胶回收质粒dna大片段，然后将a3.2步中退火产物分别与胶回收产物连接，连接体系如下：

16℃恒温连接过夜，然后转化感受态，经过“涂布～挑单克隆菌落～摇菌扩繁～测序验证～质粒提取测序验证”等步骤，得到四种pentr/cmv-gfp/u6-shrna表达载体。

a5步骤，shrna干扰效率的测定与筛选

a5.1hek293细胞的复苏与传代

于液氮罐中取出冻存的hek293细胞，37℃水浴快速融化，然后将其接种于25cm²培养瓶中，加入dmem培养基(含10％胎牛血清)，置于培养箱37℃，5％co2培养箱内培养。待细胞生长成均匀单层细胞并达80％～90％汇合度时传代，将培养基吸出加入500μl，0.25％胰蛋白酶室温下短暂消化，于显微镜下观察当细胞皱缩变圆时立即加入dmem培养基，反复吹打成细胞悬液，血球计数板计数，以含10％胎牛血清的dmem调整细胞密度后重新接种于24孔板中，置于37℃、浓度5％的co2培养箱内培养。

a5.2用lipofectamine3000转染目的质粒到细胞中

转染前2h换成无双抗的培养基。

制备转染复合物：取500ng的dna，1ul的p3000用50μl无血清稀释培养基(建议采用opti-mem)稀释，充分混匀，制成dna稀释液。使用50μl无血清稀释培养基稀释0.75μl的3000试剂，充分混匀，制成转染试剂稀释液，室温静置5分钟后，混合dna稀释液和转染试剂稀释液，室温静置15min。

将转染复合物逐滴加入到含有细胞和完全培养基的24孔板中，轻柔混匀。

将细胞置于含浓度5％的co2、37℃培养箱中培养48h。

a5.3双荧光素酶报告检测，计算干扰效率

按照promega公司dual-luciferasereporterassaysystem的说明书与步骤收集并多功能酶标仪检测化学发光强度，以共同转染pentr/cmv-gfp/u6—nc(本实验室保存)与psicheckⅱ-stk11质粒作为阴性对照并规定干扰效率为零，计算其他shrna的干扰效率，筛选高干扰效率的shrna(参考附图2)。

构建stk11干扰腺病毒按以下步骤进行：

b1步骤，构建载体pdc316-egfp-shrna

b1.1载体pdc316-egfp-shrna(载体示意图参考附图3)用限制性内切酶psti单酶切，酶切体系如下：

37℃下反应40分钟然后用pcr回收试剂盒回收。

b1.2pdc316-egfp-shrnapsti单酶切回收质粒的klenow酶末端补齐，klenow补平体系如下：

37℃反应20分钟然后用pcr回收试剂盒回收。

b1.3pdc316-egfp-shrnapstiklenown端补平后，再用限制性内切酶bamhi单酶切,酶切体系如下：

37℃反应40分钟然后跑胶用琼脂糖凝胶试剂盒回收。

b1.4质粒pdc316-egfp-shrna回收大片段与cstk11的稀释退火产物的连接，22℃水浴反应过夜。连接反应体系如下：

b1.5各取10μl过夜连接产物转化100μljm109感受态细胞，将连接产物与感受态细胞混匀后冰浴30min，42℃热激45s，立即置冰上放置2min，加入预热至室温的400μl的lb培养基，200rpm，37℃恒温摇床培养1h，4000rpm离心1min，弃去400μl培养上清，剩余100μl用移液器混匀后均匀涂布于含100μg/mlampicillin抗性的lb平板上，倒置，37℃恒温培养箱培养过夜。

b1.6分别挑取3个单菌落接种于含5ml，100μg/mlampicillin抗性的lb培养液中，250rpm，37℃恒温摇床培养过夜，用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，并分别用bglii做酶切鉴定，阳性克隆可切出600bp的条带(参考附图4)。

b1.7挑取酶切鉴定正确的阳性菌测序，测序引物为：

u6-f：5‘-tacgatacaaggctgttagagag-3’。

b2步骤，pdc316-egfp-shrna-cstk11腺病毒包装

同a5.1步骤，复苏冻存的hek293细胞并传代至6孔板中，用polyfectine转染目的质粒到细胞中，转染前2h换成无双抗的培养基；制备转染复合物：取4μgdna用246μl无血清稀释培养基(或者采用opti-mem、无血清dmem或rpmi1640)稀释，充分混匀，制成dna稀释液。取8μlpolyfectine加入到dna稀释液中，充分混匀，室温静置15分钟；将转染复合物逐滴加入到含有细胞和完全培养基的平皿中，轻柔混匀；将细胞置于含5％co2的37℃培养箱中孵育4-6h后换液。待细胞长满培养皿，将细胞传代于25cm²细胞培养皿中；每天观察，待细胞长满瓶底时，再传入75cm²细胞培养瓶中，每天观察出毒迹象，即细胞收缩变圆，并伴随有细胞脱落；待细胞大部分病变并从培养瓶壁脱落后，进行收毒，为病毒母液p1(参考附图5)。

b3步骤，pdc316-egfp-shrna-cstk11腺病毒扩增

b3.1培养扩增hek293细胞，当细胞汇合度达到80％-90％时加入p1代病毒ad-cstk11；

b3.2感染48h后收集细胞，-80℃/37℃反复冻融3次，10，000g离心10min收集病毒上清，标记为p2(参考附图6)。

b4步骤，pdc316-egfp-shrna-cstk11腺病毒侵染效率与干扰效率的检测

将秦川牛前脂肪细胞接种于细胞6孔培养板中,待细胞融合度达到80％左右时,分别加入腺病毒ad-sh1127,同时以空病毒载体作为对照组(参考附图7)。48h收集细胞,提取总rna，用于荧光定量检测stk11的干扰效率，同时另外一组同样的处理用来提取总蛋白，蛋白样品添加pmsf蛋白酶抑制剂，短时间内,测定总蛋白浓度,添加上样缓冲液进行煮蛋白，用于westernblotting检测stk11蛋白的表达量。

结果表明，stk11干扰腺病毒侵染效果良好，在mrna水平上stk11水平降低76％，蛋白水平也呈显著性下降(参考附图8)，可成功实现stk11基因在体细胞中的持续敲低，为今后开展stk11基因功能的相关研究提供了可靠的实验技术。

核苷酸序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种牛丝氨酸苏氨酸激酶stk11干扰腺病毒构建方法，

<160>

<210>1

<211>60

<212>shrna序列

<213>dna

<220>

<400>

5’-gacgacgagctcttcgacatttcaagagaatgtcgaagagctcgtcgtcttttttagatctg-3’。

<210>2

<211>33

<212>stk11上游引物（xhoⅰ）序列

<213>dna

<220>

<400>

ccgctcgagatggtgatggagtactgcgtgtgt

<210>3

<211>36

<212>stk11下游引物（pmeⅰ）序列

<213>dna

<220>

<400>

agctttgtttaaactcattgctgtttgcaggccgac

<210>4

<211>122

<212>stk11-shrna-961序列

<213>dna

<220>

<400>

gatccgcggttctccatacagcagattcaagagatctgctgtatggagaaccgcttttttaagcttaaaaaagcggttctccatacagcagatctcttgaatctgctgtatggagaaccgcg

<210>5

<211>122

<212>stk11-shrna-1127序列

<213>dna

<220>

<400>

gatccgacgacgagctcttcgacatttcaagagaatgtcgaagagctcgtcgtcttttttaagcttaaaaaagacgacgagctcttcgacattctcttgaaatgtcgaagagctcgtcgtcg

<210>6

<211>122

<212>stk11-shrna-1135序列

<213>dna

<220>

<400>

gatccgctcttcgacattgaggacgatcaagagtcgtcctcaatgtcgaagagcttttttaagcttaaaaaagctcttcgacattgaggacgactcttgatcgtcctcaatgtcgaagagcg

<210>7

<211>122

<212>stk11-shrna-1150序列

<213>dna

<220>

<400>

gatccggacgacgtcatctacactcatcaagagtgagtgtagatgacgtcgtccttttttaagcttaaaaaaggacgacgtcatctacactcactcttgatgagtgtagatgacgtcgtccg

<210>8

<211>23

<212>测序引物u6-f序列

<213>dna

<220>

<400>

5‘-tacgatacaaggctgttagagag-3’