铁皮石斛DcWOX4基因及其在提高植物茎分蘖中的应用的制作方法

本发明涉及基因功能领域，更具体地涉及铁皮石斛dcwox4基因及其在提高植物茎分蘖中的应用。

背景技术：

铁皮石斛dendrobiumcatenatum(或称为d.officinale)为兰科石斛属珍稀名贵中药材，具有益胃生津、滋阴清热之传统功效。铁皮石斛始载于《神农本草经》，为保健滋补之上品；唐代开元《道藏》则把其列为“中华九大仙草之首”，倍受历代医家和典籍推崇。2010版《中华人民共和国药典》特将其从药材石斛中单列出来独立标准；2018年浙江省更是将其确定为新“浙八味”中药材培育品种之首，体现其广泛的应用价值、市场潜力和社会效益。野生铁皮石斛生长环境苛刻，常附生于具丹霞地貌的悬崖峭壁上，喜温、湿、通风、半阴环境，且铁皮石解自交不育、种子无胚乳、萌发率极低，再加上民间毁灭性采挖与栖息地的破坏，使其野生资源极度稀缺并被列为国家二级保护中药材。20世纪90年代以来，随着铁皮石斛组培快繁和设施栽培等产业化关键技术的突破，铁皮石斛及相关产品已在全国，特别是浙江省，快速发展为百亿级产业。

wuschelrelatedhomeobox(wox)家族是植物干细胞维持的主控因子，负责调控植物初生分生组织(茎尖和根尖分生组织)和次生分生组织(维管形成层)等各级干细胞的维持和分化，从而进一步影响器官分化和发育进程。在番茄中，slwox4过表达系表现出更高程度的复叶形态。因此，不同植物的wox4基因除了拥有祖先的共同角色外，还进化出新的物种特异的功能。

铁皮石斛的药用部位主要是茎秆。铁皮石斛可以在基部通过分蘖产生新的枝条，枝条的多寡直接决定了铁皮石斛茎秆的产量。然而，铁皮石斛dcwox4基因在植物发育中的功能尚未可知。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种铁皮石斛dcwox4基因及其在提高植物茎分蘖中的应用。

本发明提供了一种铁皮石斛dcwox4基因，该dcwox4基因具有seqidno:1所示的核苷酸序列，或者对所述序列进行一个或几个核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不变的序列。优选地，所述的dcwox4基因具有seqidno:1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了含有上述的dcwox4基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。

在一个实施方案中，上述的重组菌为将dcwox4基因插入表达载体得到的重组菌。

另一方面，本发明还提供了一种提高植物茎分蘖的方法，该方法包括将上述的dcwox4基因导入到植物细胞中，得到茎分蘖增多的转基因植株。

在一个实施方案中，上述植物为拟南芥。

在一个实施方案中，上述方法还包括：将包含所述dcwox4基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到拟南芥、筛选、培养和获得转基因株系。

本发明还提供了上述的dcwox4基因在提高植物茎分蘖中的应用。

在一个实施方案中，上述植物为拟南芥。

本发明的优点在于，依据铁皮石斛wox4基因在模式植物拟南芥中过表达的表现型观察与统计，应用dcwox4，有望调控铁皮石斛的分蘖数，使得铁皮石斛的分枝增多，提高最具药用价值的枝条数量。

附图说明

图1为本发明的一个实施例中的铁皮石斛幼苗中的总rna；

图2为本发明的一个实施例中的铁皮石斛dcwox4的基因克隆pcr后电泳检测；

图3为本发明的一个实施例中的铁皮石斛dcwox4的中间载体菌液pcr后电泳检测；

图4为本发明的一个实施例中的铁皮石斛dcwox4的中间载体重组质粒双酶切后电泳检测；

图5为本发明的一个实施例中的铁皮石斛dcwox4的表达载体菌液pcr后电泳检测；

图6为本发明的一个实施例中的铁皮石斛dcwox4的表达载体重组质粒双酶切后电泳检测；

图7为本发明的一个实施例中的铁皮石斛dcwox4转基因拟南芥植株的抗性筛选；

图8为本发明的一个实施例中的野生型(wt)和铁皮石斛dcwox4转基因拟南芥的分蘖数目统计；

图9为本发明的一个实施例中的观察到的野生型(wt)和铁皮石斛dcwox4转基因拟南芥的表型。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

1.材料

1.1实验材料

铁皮石斛品种“晶品一号”幼苗采自浙江省杭州市临安区浙江农林大学温室大棚。样品采下后液氮速冻，带回实验室并放置在-80℃冰箱保存待用。拟南芥种子使用哥伦比亚生态型(columbia-0)。

1.2实验试剂与仪器

dna聚合酶、各种限制性内切酶、t4连接酶、marker和rnaisoplus试剂均为takara品牌，均购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒提取试剂盒及dna胶回收试剂盒均为transgen品牌，购自北京全式金生物技术有限公司。pcr仪为bio-rads1000thermalcyclerpcr仪，超净工作台购自苏州净化科技有限公司。

1.3引物合成及测序

引物合成及测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2.方法

2.1铁皮石斛的无菌苗晶品一号根中的总rna的提取

采用ctab+rnaisoplus法提取根中样品总rna，步骤如下：

(1)在2ml离心管中加入1ml65℃预热的ctab提取缓冲液(2％ctab，2％pvp-k30，0.1mtris-hcl(ph8.0)，2mnacl，0.025medta(ph8.0))，加入200μlβ-巯基乙醇；

(2)取-80℃保存的幼苗2g，放入液氮充分预冷的研钵中，于液氮中充分研磨至白色粉末；

(3)将白色粉末迅速转入预热的提取液中，立即充分振荡混匀，65℃水浴20min，期间振荡3-5次；

(4)12000rpm4℃离心10min后取上清于新的2ml离心管中，加入等体积的10mlicl混匀后放置于4℃冰箱，过夜；

(5)次日，打开40℃水浴，后将sste(1mnacl，0.5％sds，1mmedta(ph8.0)，10mmtris-hcl(ph8.0))放入水浴中，离心机预冷到4℃，再将过夜的混合液12000rpm4℃离心20min，得到沉淀；

(6)加入0.5ml预冷的75％乙醇洗涤沉淀，温和振荡，12000rpm4℃离心5min，弃掉上清；(可以重复步骤6一次)；

(7)加入0.5ml的sste溶解沉淀，剧烈震荡，再加0.8ml的rnaisoplus，混合均匀后再加入200μl氯仿摇匀，12000rpm4℃离心10min后取上清；

(8)取上清转入新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)上下颠倒混匀，12000rpm4℃离心10min后取上清；

(9)上清转移至1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇后放置于-20℃冰箱冷冻30min。12000rpm4℃离心10min加入1ml预冷的75％乙醇洗涤沉淀，温和振荡，

(10)弃掉上清，加入0.5ml预冷的75％乙醇洗涤沉淀，温和振荡，12000rpm4℃离心5min，弃掉上清；(可以重复步骤10一次)；

(11)4℃12000rpm离心5min，获得rna沉淀；

(12)用10μl枪头尽量吸净残留的酒精，置于超净工作台中吹干，获得干燥的总rna；加入适量depc水溶解沉淀，-80℃保存备用。

2.2cdna第一链合成

使用takara试剂盒primescripttmⅱ1ststrandcdnasynthesiskit，详细内容如下：

(1)在经过depc处理过的pcr管中配置下列反应体系:

(2)65℃保温5min，冰上迅速冷却。(模板rna变性)

(3)继续配置反应体系如下：

(4)缓慢摇匀。

(5)42℃反应30-60min。

(6)95℃5min酶失活后，冰上冷却。

(7)获得cdna后，用depc水稀释5倍使用。

2.3基因序列的引物设计

依据铁皮石斛wox4基因序列：

tagtggtaagtataccatgaagtttcagcagttggaattagcctttttgaataaaaattcctcaacgtcttcttcctcttcgtcttccttgactcttggatttaagcgtcttcggccggtcgtaccggctgcatccactgtcaagcctgttacttctctggaactcaagagcttcagcttctctaaggcttcttccgcacctctgcaacatcaacatgtcactctgtcaggagggggaacaagatggaacccaactcaagaacagataaggaaactagagtcactctacaatagcgggatgaggacaccgaacgcccagcagatcgagaagataactgctgagctgatcaaacatggaagaattgaaggaaagaatgtcttctactggttccagaaccataaggcaagggaaaggcagaagcagaagcgcaacggtctcctcagcccctccttgccaccagactcaaacttctctgaaacaaagggagctgaagagaagaaggagagtagagatgggagaagcaagaggagaagcaggagttggggagttgagcttgatcagattattgagtgcggcggtgatgacagagtaacactcgagctcttccctttgcacccggagaacattaatggaaataactacttttaa；

使用primerprimer5.0软件设计引物，正反向引物两端分别加上酶切位点bamhi和sali，正向引物：5’-g|gatccatgaagtttcagcagttggaat-3，

反向引物：5’-g|tcgacaaagtagttatttccattaatgttc-3’，克隆所需序列。

2.4pcr扩增反应

以铁皮石斛cdna为模板扩增，反应体系如下：

pcr反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min。30个循环后，68℃延伸10min。pcr反应完成后16℃暂时保存，其中退火温度可根据tm值进行调整。

2.5琼脂糖凝胶电泳检测与胶回收

将pcr反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为1xtae(40mmtris-hcl(ph8.3)，1mmedta，20mm冰乙酸)，核酸染料为gelred(biotium)。紫外光检测电泳结果并回收pcr产物。利用transgen品牌的dna胶回收试剂盒进行胶回收，具体步骤如下：

(1)通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的dna片段与其他片段分开，用干净的手术刀片将含有目的dna的琼脂糖凝胶块切下，放入2ml离心管中。每个离心管先称量，其重量作为一个凝胶体积，每个胶块尽量不要超过600mg，否则可能将会导致溶胶不完全。另外切胶过程应尽可能快，从而减少dna在紫外线中暴露时间来降低对dna的损伤。

(2)根据胶块的质量和浓度，加入3倍凝胶体积的buffergsb。

(3)置于40℃水浴10min，期间混匀3～5次直至胶块完全溶化为止。

(4)等待融化的凝胶块溶液恢复室温。

(5)将溶化好的溶液全部移入吸附柱，静置5min，10,000g离心1min。倒掉收集管中的液体，并将吸附柱放入同一个收集管中。

(6)加入500μlbufferwb，10,000g离心1min。再次倒掉收集管中的液体。

(7)重复一次步骤6。

(8)将带有收集管的吸附柱放入离心机，10,000g空离1min。扔掉收集管，并将吸附柱置于灭过菌的1.5mlep管中。

(9)打开吸附柱的盖子，室温放置10min。为了去除残留的酒精，否则会严重影响回收得率和后续实验结果。

(10)在吸附膜中央加入15-30μlddh2o。室温静置5min，10,000g离心1min。1.5mlep管底部收集的dna溶液即为回收的dna，-20℃保存。

2.6dna回收片段与peasy-bluntcloningvector(transgen品牌)载体连接

根据peasy-bluntcloningvector载体使用说明书，在灭过菌的pcr反应管中将vector与回收dna片段进行连接，反应体系如下：

pcr克隆回收产物4μl

peasy-bluntvector1μl

轻轻混匀后16℃过夜连接10h以上，转化trans1-t1phageresistantchemicallycompetentcell感受态(transgen品牌)。

2.7连接产物转化感受态大肠杆菌

转化感受态具体操作步骤如下：取出适量trans1-t1phageresistantchemicallycompetentcell感受态细胞并至于冰上冻融。在超净工作台内向冰冷的50μl感受态细胞中加入上述连接混合液，并轻轻敲打混匀。置于冰上20-30min。快速平稳放入42℃水浴中30s(热激，使细胞膜开放，重组质粒进入细胞)，并迅速放入冰水混合物中，保持2min(使细胞膜关闭)。加入500μl无抗性的lb液体培养基，37℃恒温振荡培养1h，200rpm，使细胞复苏。室温下4000rpm离心5min，弃掉大部分上清(保留少许培养基，约100-150μl)。超净台内，用枪头轻轻吸打并重悬菌液，涂于卡那霉素(kan)或氨苄(amp)抗性平板。倒置琼脂平板于37℃，平板通常在37℃温育14h。

2.8重组子的筛选和鉴定

用高压蒸汽灭菌的竹签挑取平板上8个单菌落(每个菌落均做好标记)，并置于含有3mllb培养基(含相应抗生素)的10ml离心管中，37℃振荡培养4h左右至培养基浑浊或者过夜培养，并对所有培养基浑浊的菌样进行菌检pcr以及1％琼脂糖凝胶电泳检测，菌检可以初步验证载体构建成功的菌液(可以先取1ml送上海生工测序)。

2.9提取重组质粒

使用transgen品牌的easypureplasmidminiprepkit试剂盒提取质粒。

(1)取过夜培养的菌液，10,000g离心1分钟，去上清(尽量吸尽)。如菌液量过大，可分多次离心收集。

(2)根据产品说明书，加入250μl无色溶液rb(含rnasea)，震荡悬浮细菌沉淀，不应留有小的菌块。

(3)根据产品说明书，加入250μl蓝色溶液lb，温和地上下翻转混合4-6次，使尚体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液，颜色由半透光变为透完蓝色，指示完全裂解(不宜超过5分钟)。

(4)根据产品说明书，加入350μl黄色溶液nb，轻轻混合5-6次(颜色由蓝色完全变成黄色，指示混合均匀，中和完全)，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2分钟。

(5)12,000g离心5分钟，小心吸取上清加入离心柱中。12,000g离心1分钟，弃洗脱液。如果溶液体积过大，可以多次加入柱中，重复操作。

(6)加入650μl溶液wb，12,000g离心1分钟，弃洗脱液。

(7)12,000g离心1-2分钟，彻底去除残留的wb。

(8)将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30-50μleb或去离子水(ph>7.0)(eb或去离子水在60-70℃水浴预热，使用效果更好)。室温静置1分钟。

(9)10,000g离心1分钟，洗脱dna，置于-20℃保存。

2.10双酶切鉴定

(1)将提取的重组质粒后用限制性内切酶bamhi和sali双酶切，鉴定是否有目的条带。使用takara的快切酶进行实验。

(2)酶切体系：30μl，具体如下：

(3)37℃恒温孵育30min。

(4)琼脂糖凝胶电泳检测

将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为1xtae(40mmtris-hclph8.3，1mmedta，20mm冰乙酸)，核酸染料为gelred(biotium)。紫外光检测电泳结果并拍照记录。如果实际条带位置与目的条带的预期位置相同，条带单一，则取10μl重组质粒送生工测序。

(5)利用blast、clustal、mega4.0等软件对序列进行分析。

2.11表达载体的构建

(1)将测序获得完全正确的序列，使用提取的质粒再次用takara的快切酶bamhi和sali双酶切中间载体和表达载体pcambia1300-gfp。

(2)将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，具体操作步骤与“2.5琼脂糖凝胶电泳检测与胶回收”相同，分别割胶回收，获得相应的条带，并且使用紫外分光光度计(thermonanodrop2000)测定回收产物的od值浓度(ng/μl)，并且记录相应的体积(μl)。

(3)再用t4连接酶连接经过双酶切的pcambia1300-gfp载体和dcwox4基因片段，具体如下：

连接体系：5μl

10xt4dnaligasebuffer0.5μl

基因片段：载体5:1摩尔比(ng/bp)

t4dnaligase0.5μl

16℃恒温孵育30-60min，也可以连接过夜。

(4)转化到大肠杆菌中，菌液pcr(pcr使用2xtaqmastermixdna聚合酶)检测后，挑选阳性菌落，继续过夜摇菌3-5ml，收获质粒。具体的操作步骤与“2.7连接产物转化感受态大肠杆菌”、“2.8重组子的筛选和鉴定”、“2.9提取重组质粒”相同。

(5)提取质粒重新酶切验证，具体的操作步骤与“2.9提取重组质粒”“3.0双酶切鉴定”相同，但是由于之前的酶切位点可能不存在了，因此具体的限制酶可能需要改变，不过此基因和pcambia1300-gfp都有bamhi和sali位点，因此限制内切酶不变。

2.12转化农杆菌

2.12.1转化农杆菌感受态

(1)取-80℃保存的农杆菌感受态(gv3101chemicallycompetentcell，上海唯地生物技术有限公司)于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。

(2)每100μl感受态加入0.01-1μg质粒dna(转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量)，用手轻弹管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。

(3)加入700μl无抗生素的lb(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠)或yep(1％胰蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％氯化钠)液体培养基，于28℃避光振荡(220rpm)培养2～3h。

(4)6000rpm离心1min收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的lb或yeb平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。

(当平板只含有50μg/mlkan时，28℃培养48h即可；平板中同时加入50μg/mlkan，20μg/mlrif时，需28℃培养60h；如果使用的平板含有50μg/mlrif则需要28℃培养72-90h)。

2.12.2阳性菌的筛选与增殖(摇菌)

(1)小摇：在超净工作台内挑选lb或yeb平板上的单菌落2-3个，添加入4ml的含有50μg/mlkan，25μg/mlrif的lb或yeb液体培养基中，离心管用10ml的，28℃振荡避光培养24h。

(2)大摇：在超净工作台内挑选lb或yeb液体培养基的菌液1个，先吸取600μl的菌液进行菌种保存(添加400μl的50％甘油，混匀后，液氮速冻，保存于-80℃)，剩下的转入到50ml含有50μg/mlkan，25μg/mlrif的lb或yeb液体培养基中，继续摇菌，28℃振荡避光培养48h左右，等到菌液比较浑浊时停止培养。

2.12.3转化农杆菌的浓度测定及其侵染拟南芥前的准备

(1)28℃振荡避光培养了48小时左右时候，观察lb或yeb液体培养基由比较澄清变为橙色浑浊时候，测其od值，若达到1.2左右时，则停止摇菌培养。

(2)配制100ml高渗溶液(1/2ms，5％蔗糖，0.1％6-ba，2％silwet)用于侵染拟南芥。

2.13拟南芥遗传转化及其转基因植株纯合子的筛选

2.13.1拟南芥的种植

(1)在计划侵染拟南芥转基因实验时，提前1个月左右种植野生型拟南芥。将消毒(75％酒精中震荡浸泡消毒5-10min，然后在95％的酒精中震荡浸泡消毒5-10min)过的野生型拟南芥种子，在超净工作台内均匀撒在1/2ms(0.22％ms培养基(solarbio,cat#m8521,固体粉末)，3％蔗糖，0.9％琼脂粉)固体培养基中。

(2)4℃冰箱避光春化处理2天。

(3)2天后，移至拟南芥培养室或者比较干净的光照培养箱中光照培养，条件为温度23℃，光强7000-9000lax，光照16小时，黑暗8小时。

(4)待拟南芥长出2片子叶和2片真叶后(一般两周左右)，将其移植到含基质(营养土：蛭石：珍珠岩＝3：1：1)的盆中，继续培养。

2.13.2拟南芥的遗传转化

(1)农杆菌菌液的准备：此步骤农杆菌菌液的培养与准备需要配合拟南芥的生长情况(生长健壮植株的盛花期)。

(2)将准备好的农杆菌菌液，4000rpm，离心10min，倒掉上清液，用配好且高压蒸灭菌过的高渗溶液悬浮菌体，再使用比色皿和分光光度计调整侵染用的菌液od值，使其介于0.6-1.0之间，终体积为50-100ml(一般一个基因50ml左右)。

(3)喷洒花朵法转化拟南芥

a.选取开花前期花苞密集的拟南芥植株(若有已经有很多果荚，则可以剪去这部分果荚)，将侵染用的菌液倒入喷壶内，均匀喷洒于9-18株的野生型拟南芥花序上。

b.将浸染过的拟南芥植株平放于一个大容器中，避光培养12小时，期间保持湿度。

c.12小时后开盖通风，10min，再盖盖密封光照培养12小时，之后移出容器让其恢复正常生长。

d.期间合理管理施肥和浇水，等待种子成熟，收获拟南芥种子，37℃干燥2-3天，4℃保存。

2.13.3拟南芥转基因种子的筛选及种植

(1)在超净工作台内，将转基因种子均匀撒在1/2ms的固体培养基中(培养基中潮霉素的浓度为25mg/l)。同时将野生型拟南芥种子撒在不含潮霉素培养基中，作为对照。

(2)4℃避光春化处理2天。

(3)2天后，将撒有野生型拟南芥种子的培养皿置于光照下，于培养室中正常培养，而含有转基因种子的培养皿则继续避光培养。

(4)2天后，将含有转基因种子的培养皿置于光下正常培养。转基因成功的植株就会生长，反之不生长。

(5)待拟南芥长出2片及以上真叶后，随机挑选两株正常生长状态的幼苗(还可以挑选长根的但生长不好或者死亡的幼苗)的根，去除固体的培养基，置于滴有1-3滴20％甘油的载玻片上，盖上盖玻片，再移到荧光显微镜下观察是否有绿色荧光出现，再次判断是否是转基因植株。剩下的成活幼苗移植到拟南芥种植土的盆中，继续培养生长。

(6)观察对照野生型col拟南芥和铁皮石斛dcwox4转基因拟南芥的生长情况，拍照记录、文字描述记录以及统计指标性状。

3.实验结果

3.1铁皮石斛幼苗总rna提取分析

利用ctab+rnaisoplus法提取铁皮石斛晶品一号无菌苗的总rna(见图1)，首先通过紫外分光光度计(thermonanodrop2000)测定3个rna样品260nm及280nm的吸光度，从而可以计算rna的a260nm/280nm；其次通过1％琼脂糖凝胶电泳(120v15min)检测rna的是否降解。提取的rna吸光度a260nm/280nm比值均分布在2.0-2.2之间，说明总rna中基本上没有糖类、edta、酚、胍盐及蛋白质等的污染；另外rna的电泳图谱结果则显示rna样品的18s和28s两条带比较清晰，5.8srna条带不明显，因此可推断rna没有降解，符合进行后续反转录等分子实验的要求。

3.2铁皮石斛wox4基因序列的克隆

利用设计的引物序列，使用pcr仪器扩增，获得单一条带(图2)，产物经连接到peasy-bluntcloningvector(transgen)，菌检pcr进行检测阳性克隆(图3)，以及提取重组质粒后用限制性内切酶bamhi和sali双酶切发现1％琼脂糖凝胶电泳图谱实际条带位置与目的条带的预期位置相同，条带单一(图4)，从而取10μl重组质粒送生工测序。然后送到上海生工测序，主要利用ncbi在线网站的blast功能对序列进行分析。最终验证了铁皮石斛wox4基因序列的存在和正确。

3.3铁皮石斛dcwox4基因的功能验证

对通过铁皮石斛dcwox4基因的克隆而获得的序列，进行表达载体的构建，将dcwox4基因序列连接到pcambia1300-gfp表达载体上，转化trans1-t1phageresistantchemicallycompetentcell大肠杆菌感受态细胞，经菌落pcr(图5)和质粒酶切(图6)鉴定阳性克隆，目的载体质粒转化到土壤农杆菌gv3101中，从而进行铁皮石斛dcwox4基因对拟南芥的转基因。对铁皮石斛dcwox4转基因拟南芥植株单株收获的种子进行抗性筛选(图7)，并在t2代获得纯合转基因植株，随后对其表现型进行观察，可以发现dcwox4转基因植株的分蘖数目在植株生长的第5周到第6周期间，明显多于野生型(图8和图9)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江农林大学

<120>铁皮石斛dcwox4基因及其在提高植物茎分蘖中的应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>649

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

tagtggtaagtataccatgaagtttcagcagttggaattagcctttttgaataaaaattc60

ctcaacgtcttcttcctcttcgtcttccttgactcttggatttaagcgtcttcggccggt120

cgtaccggctgcatccactgtcaagcctgttacttctctggaactcaagagcttcagctt180

ctctaaggcttcttccgcacctctgcaacatcaacatgtcactctgtcaggagggggaac240

aagatggaacccaactcaagaacagataaggaaactagagtcactctacaatagcgggat300

gaggacaccgaacgcccagcagatcgagaagataactgctgagctgatcaaacatggaag360

aattgaaggaaagaatgtcttctactggttccagaaccataaggcaagggaaaggcagaa420

gcagaagcgcaacggtctcctcagcccctccttgccaccagactcaaacttctctgaaac480

aaagggagctgaagagaagaaggagagtagagatgggagaagcaagaggagaagcaggag540

ttggggagttgagcttgatcagattattgagtgcggcggtgatgacagagtaacactcga600

gctcttccctttgcacccggagaacattaatggaaataactacttttaa649

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列()

<400>2

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