一种基于转基因技术的人工创制矮化西瓜新品种的方法与流程

本发明涉及一种rna干扰载体、构建方法及创制矮化西瓜新品种的方法，属于转基因植物制备技术领域。

背景技术：

西瓜为葫芦科作物，是世界性的瓜类蔬菜作物，西瓜年产量约为90亿吨，具有较高的市场供应。西瓜生产上的一个重要环节是选育优良品种，其中矮化植株的选育是一个重要目标，矮化西瓜株型紧凑，无须整枝，适应密植，能充分利用土地和光照资源，可提高单位面积产量且早熟，并且能够节约劳动力，降低成本，提高经济效益。但是，目前的西瓜种质资源单一，遗传基础狭窄，利用常规杂交育种技术已经越来越耗时耗力。因此，采用新技术培育新品种是当前西瓜产业升级发展的迫切要求。

目前西瓜全基因组测序及骨干育种材料的重测序工作已经完成，大量功能基因有待验证，这对建立高效的西瓜转基因技术提出了迫切需求。但是，西瓜是公认的较难进行基因编辑的作物之一，亟需建立高效稳定的转基因西瓜的制备方法，尤其是基于转基因技术的矮化西瓜新品种的制备方法。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：为解决现有矮化西瓜新品种的制备方法存在的上述技术问题，提供一种rna干扰载体、构建方法及创制矮化西瓜新品种的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

本发明首先公开了含有西瓜glaga20ox基因序列的rna干扰载体dhpart27rnaifadp1p4-glaga20ox的构建方法，构建步骤如下：

根据西瓜的glaga20ox基因序列信息，克隆获得正向序列及反向序列，然后将克隆获得的正向序列及反向序列插入dhpart27rnaifadp1p4载体中，获得rna干扰载体dhpart27rnaifadp1p4-glaga20ox，所述glaga20ox基因序列如seqidno.1所示。

优选地，所述rna干扰载体dhpart27rnaifadp1p4-glaga20ox的构建方法具体为：

选取西瓜glaga20ox基因的保守功能区作为rna干扰片段，利用pcr法将rna干扰片段两端添加5'(hindiii)和3'(xbai)酶切位点，得到正向序列；利用hindiii和xbai对dhpart27rnaifadp1p4载体和正向序列进行酶切，得到plasmid1酶切载体和酶切正向序列；将酶切正向序列连接至plasmid1酶切载体，得到重组载体；

利用pcr法将干扰片段两端添加5'(kpni)和3'(xhoi)酶切位点，得到反向序列；利用kpni和xhoi对重组载体和反向序列进行酶切，得到plasmid2酶切载体和酶切反向序列；将酶切反向序列连接至plasmid2酶切载体，得到rna干扰载体dhpart27rnaifadp1p4-glaga20ox；

所述正向序列如seqidno.2所示，所述反向序列如seqidno.3所示。

优选地，制备正向序列所用的引物对为d1-f和d1-r，所述d1-f为5’-cccaagcttaaaacctctagagaatgctcttt-3’，所述d1-r为5’-ctagtctagagcctcgtatttccttctcc-3’。

优选地，制备反向序列所用的引物对为d2-f和d2-r，所述d2-f为5’-ggggtaccaaaacctctagagaatgctctttt-3’，所述d2-r为5’-ccgctcgaggcctcgtatttccttctcc-3’。

本发明所述用于创制矮化西瓜新品种的rna干扰载体dhpart27rnaifadp1p4-glaga20ox包括dhpart27rnaifadp1p4载体、正向序列及反向序列，所述正向序列如seqidno.2所示，所述反向序列如seqidno.3所示。

本发明还公开了一种利用上述dhpart27rnaifadp1p4-glaga20oxrna干扰载体创制矮化西瓜新品种的方法，包括以下步骤：

将所构建的rna干扰载体dhpart27rnaifadp1p4-glaga20ox转化到西瓜细胞中，并通过抗生素筛选获得阳性转化植株；

利用检测引物，通过pcr技术对阳性转化植株中卡那霉素基因区域进行扩增，扩增产物连入t载体后进行dna测序，以确认西瓜阳性植株。

优选地，利用花粉管通道转化法将所构建的rna干扰载体dhpart27rnaifadp1p4-glaga20ox转化到西瓜细胞中，花粉管通道转化法为：在西瓜自花授粉后，将构建的dhpart27rnaifadp1p4-glaga20ox载体涂抹柱头。

进一步，花粉管通道转化法为：在西瓜自花授粉后1-3h，将30-70μl浓度为80-120ng/μl的dhpart27rnaifadp1p4-glaga20ox载体溶液涂抹柱头，所述dhpart27rnaifadp1p4-glaga20ox载体溶液由水或te缓冲液配制而成。

进一步，花粉管通道转化法为：在西瓜自花授粉后2h，将50μl浓度为100ng/μl的dhpart27rnaifadp1p4-glaga20ox载体水溶液涂抹柱头。

优选地，所述检测引物为kan-f和kan-r，kan-f和kan-r为：

kan-f：5’-tgaagatgaacaaagccctgaa-3’，

kan-r：5’-gcagaaggcaatgtcataccact-3’。

本发明的有益效果是：

本发明将构建的干扰载体进行遗传转化，可实现对西瓜中glaga20ox基因进行定点突变，获得基因功能缺失的矮化西瓜，该矮化西瓜植株矮化，株型紧凑、丰满，茎秆更为健壮，不易倒伏，西瓜明显变小，特别适合于用作礼品型西瓜。另外，本发明通过花粉管通道法将构建的rna干扰载体进行遗传转化，与农杆菌介导的转基因技术相比，节省了种子处理、预培养、共培养、选择培养等复杂步骤，简化了转基因的程序。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是本发明实施例的dhpart27rnaifadp1p4载体信息；

图2为本发明实施例2的转基因西瓜阳性植株检测电泳图；其中，m：marker，1-5为转基因西瓜；

图3为本发明实施例2的转基因西瓜植株和野生型西瓜植株的对照图；a：野生型植株，b：转基因植株；

图4为本发明实施例2的转基因西瓜和野生型西瓜的对照图；a：野生型西瓜，b：转基因西瓜。

具体实施方式

现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。

实施例1

本实施例提供了一种基于西瓜glaga20ox基因的rna干扰载体的构建方法，具体包括如下步骤：

利用西瓜数据库网站提供数据(http://cucurbitgenomics.org/)，检索西瓜glaga20ox基因序列，所述glaga20ox基因序列如seqidno.1所示；

选取西瓜glaga20ox基因的保守功能区作为rna干扰片段，利用引物对d1-f和d1-r，通过pcr法将rna干扰片段两端添加5'(hindiii)和3'(xbai)酶切位点，得到正向序列，所述正向序列如seqidno.2所示，所述d1-f为5’-cccaagcttaaaacctctagagaatgctcttt-3’，所述d1-r为5’-ctagtctagagcctcgtatttccttctcc-3’，pcr反应程序为：98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，4℃保温，采用25μl反应体系，反应体系具体如下：

利用hindiii和xbai对dhpart27rnaifadp1p4载体和正向序列进行酶切，得到plasmid1酶切载体和酶切正向序列，反应条件为37℃反应3h，采用10μl反应体系，反应体系具体如下：

将酶切正向序列连接至plasmid1酶切载体，得到重组载体1，反应条件为4℃反应过夜，采用10μl反应体系，反应体系具体如下：

利用引物对d2-f和d2-r，通过pcr法将西瓜glaga20ox基因的rna干扰片段两端添加5'(kpni)和3'(xhoi)酶切位点，得到反向序列，所述反向序列如seqidno.3所示，所述d2-f为5’-ggggtaccaaaacctctagagaatgctctttt-3’，所述d2-r为5’-ccgctcgaggcctcgtatttccttctcc-3’，pcr反应程序为：98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，4℃保温，采用25μl反应体系，反应体系具体如下：

利用kpni和xhoi对重组载体1和反向序列进行酶切，得到plasmid2酶切载体和酶切反向序列，反应条件为37℃反应3h，采用10μl反应体系，反应体系如下：

将酶切反向序列连接至plasmid2酶切载体，得到连接载体，反应条件为4℃反应过夜，采用10μl反应体系，反应体系如下：

将连接载体(10ng以下)转化大肠杆菌dh5a菌株的感受态细胞，经pcr鉴定、序列分析正确的重组质粒就是rna干扰载体dhpart27rnaifadp1p4-glaga20ox。

实施例2

本实施例提供了一种利用rna干扰载体dhpart27rnaifadp1p4-glaga20ox创制矮化西瓜新品种的方法，具体包括如下步骤：

将实施例1构建的dhpart27rnaifadp1p4-glaga20ox载体配制成浓度为100ng/μl的水溶液；

利用花粉管通道转化法，在西瓜自花授粉后2h，将50μl的dhpart27rnaifadp1p4-glaga20ox载体水溶液涂抹柱头，待西瓜长成熟，采收西瓜籽；

将采收的西瓜籽加入50ml、75％的乙醇漂洗消毒1min，沉淀种子，再加入50ml、0.1％升汞漂洗10min，沉淀种子，最后用无菌水漂洗种子5次后浸泡在无菌水中过夜；

将在无菌水中过夜的种子均匀的铺在含有100mg/l卡那霉素ms培养基培养瓶里，放置于28℃植物培养室培养，光周期为16h/8h；

在培养室培养20d后，提取西瓜基因组总dna，进行目的基因的pcr检测，以验证目的基因是否有效地插入西瓜中，转基因西瓜阳性植株检测电泳图如图2所示，pcr检测的反应程序为：98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，4℃保温，采用25μl反应体系，pcr反应体系为：

所述kan-f和kan-r为以提取的dna作为模板设计的卡那霉素基因区域正向引物和反向引物：

kan-f：5’-tgaagatgaacaaagccctgaa-3’

kan-r：5’-gcagaaggcaatgtcataccact-3’

将得到的产物进行胶回收得目的片段kan-w，目的片段kan-w与t载体pmd-18t进行连接，构建得到重组载体2，反应条件为4℃过夜，采用10μl反应体系，反应体系如下：

将构建的重组载体2(10ng以下)转化至大肠杆菌dh5a菌株的感受态细胞中，筛选阳性克隆，进行dna测序，以确认西瓜阳性植株。

实施例3

本实施例与实施例2的区别仅在于：

用te缓冲液将实施例1构建的dhpart27rnaifadp1p4-glaga20ox载体配制成浓度为80ng/μl的水溶液；

利用花粉管通道转化法，在西瓜自花授粉后1h，将70μl的dhpart27rnaifadp1p4-glaga20ox载体水溶液涂抹柱头，待西瓜长成熟，采收西瓜籽。

实施例4

本实施例与实施例2的区别仅在于：

用te缓冲液将实施例1构建的dhpart27rnaifadp1p4-glaga20ox载体配制成浓度为120ng/μl的水溶液；

利用花粉管通道转化法，在西瓜自花授粉后3h，将30μl的dhpart27rnaifadp1p4-glaga20ox载体水溶液涂抹柱头，待西瓜长成熟，采收西瓜籽。

待实施例2-4的转化成功的转基因矮化西瓜在20℃～30℃条件下生长50天后，转基因西瓜植株矮化,株型紧凑、丰满，茎秆更为健壮，已结果实，而同样生长50天的野生型西瓜植株高,茎秆又细又弱，未结果实，其中，实施例2的转基因西瓜植株和野生型西瓜植株的对照如图3所示；

待实施例2-4的转化成功的转基因矮化西瓜在自然条件下生长成熟后，观察植株高度及果实大小，与生长同样天数的野生型西瓜相比，转基因矮化西瓜比普通西瓜明显变小，转基因矮化西瓜的质量约为普通西瓜质量的1/3-1/2，转基因矮化西瓜特别适合于用作礼品型西瓜，其中，实施例2的转基因西瓜和野生型西瓜的对照如图4所示。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

序列表

<120>rna干扰载体、构建方法及其创制矮化西瓜新品种的方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>seqidno.1

<211>963

<212>dna

<213>西瓜(watermelon)

<400>seqidno.1

atgtcagaagaatcatcgattgagatgtatgaagaactaccagtgatggacatggattat60

tgtgaagaagtgagcgaatcgaggcgattgagtctgtacaaggcttgcaacgaatggggg120

catttctacatcagaaaccatggcgtttcgaaggagctttatcggaaattgagagccgtc180

accgatgaactgatgttgaggaggttgccggaagaggggaaactgaaagtaggagtttct240

tggtacactcctagatttatattgtcgccttacattgagagcttcaagttttcgggacca300

aacttctccgcctctgcctccgacttagggtttacggaacaagtcttcggtccccgcgtc360

actcaactcagcaatctactcaatgaatatggaagtataatgacagaactatcaagaaaa420

ataatgaagctattactaaagatcatgggagataattttgagagcaaattctatgagtca480

gagttcagtaagtgcaatggctacataagaataaatagatatgctcctcgaaactccaac540

gaagaaatagaagcgtttggaaagcacaccgatataagttgtgtgacgattctgttccaa600

gacgaaatcgggggccttcaaatgaaatcgaaacgaagagatgagtggatagatgtaaaa660

cctctagagaatgctcttttggtgaacattggggattttatgcaagcttggagtaatgaa720

aggctaagatcagctgagcatagagttgttttgaaacaaaatgtgaagagattctctttg780

gctttcttttggacatttggggatgatgatagggaagtatatgcctcacgtgaggttgtt840

ggagaaggaaatacgaggctttataagccattttcaactaaagaatatagggcgtttagg900

gaaaataattatgggaaaattgttggaaccccaatcagagaatttgccggaattgtagaa960

tga963

<210>seqidno.2

<211>215

<212>dna

<213>西瓜(watermelon)

<400>seqidno.2

aagcttaaaacctctagagaatgctcttttggtgaacattggggattttatgcaagcttg60

gagtaatgaaaggctaagatcagctgagcatagagttgttttgaaacaaaatgtgaagag120

attctctttggctttcttttggacatttggggatgatgatagggaagtatatgcctcacg180

tgaggttgttggagaaggaaatacgaggctctaga215

<210>seqidno.3

<211>215

<212>dna

<213>西瓜(watermelon)

<400>seqidno.3

ggtaccaaaacctctagagaatgctcttttggtgaacattggggattttatgcaagcttg60

gagtaatgaaaggctaagatcagctgagcatagagttgttttgaaacaaaatgtgaagag120

attctctttggctttcttttggacatttggggatgatgatagggaagtatatgcctcacg180

tgaggttgttggagaaggaaatacgaggcctcgag215