一种基于INHA基因检测高山美利奴羊繁殖力的方法与流程

本发明涉及基因工程
技术领域：
，具体涉及一种基于inha基因检测高山美利奴羊繁殖力的方法。
背景技术：
：高山美利奴羊新品种是世界首例能适应海拔2400～4070m高山寒旱生态区和羊毛纤维直径19.1～21.5μm为主体的毛肉兼用型美利奴羊新品种，为提高细毛羊综合品质提供了优秀种质资源(岳耀敬等，2014)。在放牧条件下高山美利奴成年母羊产羔率为110％～120％，繁殖率低，养殖成本高，极大限制了细毛羊产业的发展。目前，国内外细毛羊的重要发展方向之一是在保持细羊毛纤维直径在21.5μm以下的基础上集中培育多胎细毛羊新品种(系)(夏新山，2007)。探讨高山美利奴羊多胎性状的主效基因，可以为高山美利奴羊多胎品系的分子标记辅助育种提供依据，可以加强高山美利奴羊多胎品系早期选择、提高选种准确性、缩短培育周期、加快培育进程。inha是编码抑制素(inhibin,inh)α亚基的基因，抑制素是一种亚基二聚体，由α亚基和β亚基组成，α亚基上有糖基化位点，是抑制素inh的生物活性中心(burgeretal，1988)。抑制素是由睾丸支持细胞和卵巢颗粒细胞分泌的糖蛋白激素，能够抑制垂体促卵泡素的合成与分泌(马晓丽等，2014)，可以抑制雄性精子的发生过程(sarvamangalaetal，2009)，抑制素影响卵泡的募集和发育(myersetal，2009)，前人研究表明，抑制素显著影响绵羊和山羊的产羔数(储明星等，2007；jaegeretal，1994；王瑞芳等，2008；董李学等，2010；索峰等，2012；田秀娥等，2010；hiendlederetal，1996)，由此可见，抑制素确实能显著影响绵羊的繁殖性状。2014年完成和公布了绵羊新一代从头测序的基因组信息(jiangyuetal，2014)。绵羊inha基因位于第2号染色体，包含1个内含子和2个外显子，外显子总长为1109bp，编码360个氨基酸。但是现有技术并未报道该基因的何处位点能够影响高山美利奴羊的繁殖能力。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种基于inha基因检测高山美利奴羊繁殖力的方法，通过检测高山美利奴羊inha基因第1外显子在206bp处的碱基，来判断高山美利奴羊的繁殖力。本发明提供了一种基于inha基因检测高山美利奴羊繁殖力的方法，检测高山美利奴羊inha基因第1外显子在206bp处的碱基；当碱基为t时，基因型为tt；当碱基为a时，基因型为ta或aa；所述基因型aa的高山美利奴羊繁殖力大于基因型ta，所述基因型ta的高山美利奴羊繁殖力大于基因型tt。优选的，所述检测的方法包括：以高山美利奴羊的基因组dna为模版，用inha引物对进行pcr扩增，得到inha基因；检测所述inha基因第1外显子在206bp处的碱基。优选的，所述inha引物对包括inha上游引物和inha下游引物；所述inha上游引物具有seqidno.1所示的核苷酸序列；所述inha下游引物具有seqidno.2所示的核苷酸序列。优选的，所述pcr扩增使用的体系每25μl包括：2×taqmastermix12.5μl，浓度为10um的inha上游引物1μl，浓度为10um的inha下游引物1μl，基因组dna溶液1μl，ddh2o9.5μl。优选的，所述基因组dna溶液的浓度大于20ng/μl。优选的，所述pcr扩增的程序包括：94℃5min；94℃30s，61℃30s，72℃30s，共34个循环；72℃延伸10min。本发明提供了一种基于inha基因检测高山美利奴羊繁殖力的方法，检测高山美利奴羊inha基因第1外显子在206bp处的碱基；当碱基为t时，基因型为tt；当碱基为a时，基因型为ta或aa；所述基因型aa的高山美利奴羊繁殖力大于基因型ta，所述基因型ta的高山美利奴羊繁殖力大于基因型tt。本发明实施例的结果显示：通过检测高山美利奴羊inha基因第1外显子在206bp处的碱基，能够判断高山美利奴羊的繁殖力。附图说明图1为本发明高山美利奴羊inha基因pcr电泳检测，其中1～8泳道为高山美利奴羊inha基因pcr产物；m:dl2000dnamarker；图2为本发明inha基因exon1-t206a位点测序结果，其中，a为aa基因型，b为tt基因型，c为ta基因型。具体实施方式本发明提供了一种基于inha基因检测高山美利奴羊繁殖力的方法，其特征在于，检测高山美利奴羊inha基因第1外显子在206bp处的碱基；当碱基为t时，基因型为tt；当碱基为a时，基因型为ta或aa；所述基因型aa的高山美利奴羊繁殖力大于基因型ta，所述基因型ta的高山美利奴羊繁殖力大于基因型tt。在本发明中，所述检测的方法优选包括：以高山美利奴羊的基因组dna为模版，用inha引物对进行pcr扩增，得到inha基因；检测所述inha基因第1外显子在206bp处的碱基。本发明对所述高山美利奴羊的基因组dna的提取方法没有特殊限定，采用常规提取动物基因组dna即可。在本发明中，所述基因组dna溶液的浓度大于20ng/μl，所述基因组dna溶液的od260/oa280值在1.7～1.9之间。在本发明中，所述inha引物对优选包括inha上游引物和inha下游引物；所述inha上游引物具有seqidno.1所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：5'-tgttcctggatgccttggg-3'；所述inha下游引物具有seqidno.2所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：5'-gaaccgggcactctggata-3'。在本发明中，所述inha引物对优选参考绵羊inha基因序列(genbank登录号：nc_019459.2)，利用primerpremier5.0和oligo7软件软件设计得到，包含突变位点exon1-t206a。在本发明中，所述inha引物对扩增得到的片段长度优选为390bp。在本发明中，所述pcr扩增使用的体系优选每25μl包括：2×taqmastermix12.5μl，浓度为10um的inha上游引物1μl，浓度为10um的inha下游引物1μl，基因组dna溶液1μl，ddh2o9.5μl。在本发明中，所述pcr扩增的程序优选包括：94℃5min；94℃30s，61℃30s，72℃30s，共34个循环；72℃延伸10min。本发明对检测所述inha基因第1外显子在206bp处的碱基的方法没有特殊限定，采用常规检测的方法即可。下面结合具体实施例对本发明所述的一种基于inha基因检测高山美利奴羊繁殖力的方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。实施例11材料和方法1.1材料1.1.1样品采集甘肃省绵羊繁殖技术推广站采集94只高山美利奴羊(单胎母羊45只、双胎母羊49只)血样，每只羊静脉采血10ml于加入edta-k2抗凝剂的采血管中，血样采集完毕后迅速震荡混匀，放入含有冰袋的采样箱中暂存，运回实验室后于-20℃冰箱冷冻保存，用以dna的提取。1.1.2主要试剂及仪器edta-k2真空采血管购自江苏宇力医疗器械有限公司；血液基因组提取试剂盒购自美国omega公司；nanodrop2000分光光度计美国thermofisherscientific公司dl2000marker、琼脂糖、核酸染料均购自北京索莱宝科技有限公司；2×taqpcrmastermix购自天根生化科技(北京)有限公司；核酸蛋白检测仪购于quawell公司；电泳仪购于北京六一仪器厂；pcr仪购自biorad公司。1.2方法1.2.1血液基因组dna的提取采用美国omega公司的血液基因组提取试剂盒，从血样中提取基因组dna，将提取出的dna置于紫外分光光度计下检测浓度与纯度，浓度＞20ng/μl、od260/od280在1.7-1.9之间即满足实验需要，存放于-20℃保存备用。1.2.5引物设计参考绵羊inha基因序列(genbank登录号：nc_019459.2)，利用primerpremier5.0和oligo7软件软件设计一对特异性引物，包含突变位点exon1-t206a。引物序列：f：5'-tgttcctggatgccttggg-3'；r：5'-gaaccgggcactctggata-3'。扩增片段长度390bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。1.2.6pcr扩增与测序pcr扩增体系25μl：2×taqmastermix12.5μl，上、下游引物各1μl，模板1μl，ddh2o9.5μl。pcr扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共34个循环；72℃延伸10min。pcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，采用直接测序法进行测序，由上海生工生物工程股份有限公司完成测序。利用生物分析软件mega6.0等对pcr产物测序结果进行比对，分析测序峰图，完成分型。1.2.7统计分析根据基因分型结果，统计各位点不同基因型的个体数。利用popgen32软件计算exon1-t206a基因频率、基因型频率、有效等位基因数(ne)、位点杂合度(he)和位点纯合度(ho)、hardy-weinberg平衡检验，利用pic计算软件计算多态信息含量。利用ibmspssstatistics22对高山美利奴羊不同基因型的产羔数进行最小二乘平均值及标准误计算分析，结果以“平均值±标准误”表示。2结果2.1pcr扩增及测序结果用1.5％琼脂糖凝胶检测高山美利奴羊inha基因扩增产物(见图1)，条带清晰无杂带，特异性良好，pcr产物片段大小为390bp符合预期大小，可以进行下一步实验。pcr产物经纯化并测序后所得到的峰图及序列见图2。由图2可知，inha基因第1外显子在206bp处发生t-a突变，存在tt、ta、aa三种基因型。2.2统计分析结果从群体遗传学角度对高山美利奴羊inha基因外显子上检测到的t206asnp位点的基因型和等位基因频率进行分析。由表1可见，在t206a位点上，tt基因型频率最高，为优势基因型，a等位基因频率为81％，表现为优势等位基因。通过对t206a位点的遗传结构进行分析，发现该snp位点的纯合度、杂合度均相差较大；对于t206a位点，由χ2适应性检验表明，snp位点处于hardy-weinberg平衡状态(p>0.05)(表1)。该位点期望杂合度为0.30，多态信息含量(polymorphisminformationcontent，简称pic)为0.26，0.25＜pic＜0.50，属于中度多态。表1高山美利奴羊inha基因exon1-t206a突变多态性2.3不同基因型与繁殖性能的关联分析采用ibmspssstatistics22软件对高山美利奴羊不同基因型与产羔数进行最小二乘平均值及标准误计算分析，aa基因型高山美利奴羊平均产羔数比at基因型多0.28只，差异不显著(p＞0.05)；比tt基因型多0.6只，差异极显著(p＜0.01)；at基因型高山美利奴羊平均产羔数比tt基因型多0.32只，差异极显著(p<0.01)，a等位基因与高山美利奴羊高产羔数呈极显著正相关。结果表明，高山美利奴羊inha基因exon1-t206a突变显著提高产羔数，该突变基因是控制细毛羊多胎性能的主效基因或者是与之存在紧密连锁的遗传标记。结果见表2。表2不同基因型高山美利奴羊产羔数的最小二乘平均值及标准误基因型样本数最小二乘平均值及标准误genotypeno.leastsquaresmean±standarderrortt621.40a±0.06ta291.72b±0.09aa32.00b±0.28由以上实施例可以得出，当高山美利奴羊inha基因第1外显子在206bp处的碱基为t时，基因型为tt；当碱基为a时，基因型为ta或aa；基因型aa的高山美利奴羊繁殖力大于基因型ta，基因型ta的高山美利奴羊繁殖力大于基因型tt。通过检测高山美利奴羊inha基因第1外显子在206bp处的碱基，能够判断高山美利奴羊的繁殖力。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所<120>一种基于inha基因检测高山美利奴羊繁殖力的方法<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tgttcctggatgccttggg19<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gaaccgggcactctggata19当前第1页12