一种副溶血弧菌氟喹诺酮类药物耐药性检测方法与流程

本发明涉及病原菌检测技术领域，具体涉及一种副溶血弧菌氟喹诺酮类药物耐药基因检测方法。

技术背景

氟喹诺酮类药物对g-杆菌，包括绿脓杆菌均有良好抗菌作用，对g+球菌也具一定抗菌活性。国内外研究表明，由于氟喹诺酮药物长期和大量使用，副溶血弧菌对氟喹诺酮类药物的耐药性十分严重，严重影响了临床疗效。已经发现的氟喹诺酮耐药基因有：gyra,gyrb,parc,pare等。我国副溶血弧菌耐药性检测传统方法是通过测定副溶血弧菌的最低抑菌浓度或抑菌圈大小测定副溶血弧菌的耐药性，必须经过繁琐的副溶血弧菌分离、纯化、繁殖、扩增等步骤，检测周期长，最快也要48h左右。不利于临床上及时的选药治疗。同时，药敏试验是在体外用药物试探性的检验副溶血弧菌的表型耐药特性，不能检测副溶血弧菌的隐型耐药性。

技术实现要素：

本发明提供一种副溶血弧菌氟喹诺酮类药物耐药性检测方法。

本发明的具体步骤如下：

（1）收集副溶血弧菌活菌体1.0~1.2g，用7~8ml去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，10000~12000rpm离心10~15min后收集上清液，得到模板。

（2）将该模板与氟喹诺酮类药物耐药基因检测引物gyra-f、gyra-r、gyrb-f、gyrb-r、pare-f和pare-r共同混合后，进行pcr扩增，该pcr扩增的反应体系中包括超纯水、pcr缓冲液、终浓度均为0.3~0.5mmol/l的dntp、终浓度为0.3~0.5mmol/l的gyra-f、终浓度为0.3~0.5mmol/l的gyra-r、终浓度为0.5~0.8mmol/l的gyrb-f、终浓度为0.5~0.8mmol/l的gyrb-r、终浓度为0.5~0.6mmol/l的pare-f、终浓度为0.5~0.6mmol/l的pare-r和终浓度为0.02~0.03u/ul的taqdna聚合酶，其中gyra-f、gyra-r、gyrb-f、gyrb-r、pare-f和pare-r分别如seqid1、seqid2、seqid3、seqid4、seqid5和seqid6，上述pcr缓冲液的10倍母液中包括10~20mm氯化钾、ph8.3的12mmtris-hcl和0.01~0.02%氯化钠，20~30mmmgcl2；

（3）步骤（2）的pcr扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳并测序。

在本发明的一个优选实施方案中，所述pcr扩增的反应体系中包括超纯水、pcr缓冲液、终浓度均为0.4mmol/l的dntp、终浓度为0.4mmol/l的gyra-f、终浓度为0.4mmol/l的gyra-r、终浓度为0.7mmol/l的gyrb-f、终浓度为0.7mmol/l的gyrb-r、终浓度为0.5mmol/l的pare-f、终浓度为0.5mmol/l的pare-r和终浓度为0.02u/ul的taqdna聚合酶。

在本发明的一个优选实施方案中，所述pcr缓冲液的10倍母液中包括15mm氯化钾、ph8.3的12mmtris-hcl和0.01%氯化钠，30mmmgcl2。

在本发明的一个优选实施方案中，所述pcr扩增的反应条件如下：90~93℃预变性8~10min，然后进入如下循环：90~93℃变性40s~50s、50~53℃退火40~50s、72~74℃延伸50s~1min，共30~35个循环，循环结束后于72℃延伸5~10min，2~4℃保存。

进一步优选的，所述pcr扩增的反应条件如下：93℃预变性10min，然后进入如下循环：93℃变性50s、53℃退火50s、72℃延伸1min，共35个循环，循环结束后于72℃延伸10min，4℃保存。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（3）的电泳条件为：2%琼脂糖凝胶，80v电压，时间40min。

本发明的特点是：

1、本发明的检测方法敏感、特异、快速，可以检测极微量的目的基因，而不需费时的副溶血弧菌培养；

2、本发明的检测方法在同一反应体系中加入多对引物对多个氟喹诺酮耐药基因同时进行扩增，在检测基因过程中可设立内部对照；可指示出模板的数量；可同时扩增几个目的基因：消耗的时间和试剂少，减少准备时间提高效率；可大量地进行样品和目的基因的检测。

附图说明

图1为本发明实施例1中检测的电泳结果，可见600bp左右、850bp左右、700bp左右的条带，分别指示grya基因、gryb基因、pare基因。

具体实施方式

实施例1

（1）lb培养基摇瓶培养增殖副溶血弧菌，摇瓶培养条件为30℃，18h，120rpm，摇瓶培养结束后离心收集副溶血弧菌活菌体1.0g，用8ml去离子水重悬，反复冻融5次破碎细胞，12000pm离心10min后收集上清液，得到模板；

（2）将该5ul模板与氟喹诺酮类药物耐药基因检测引物gyra-f、gyra-r、gyrb-f、gyrb-r、pare-f和pare-r（引物浓度分别为25mmol/l，用1mmtris-hcl--0.1mmedta缓冲液稀释）共同混合后，进行pcr扩增，该pcr扩增的反应体系中包括超纯水、pcr缓冲液、终浓度均为0.4mmol/l的dntp、终浓度为0.4mmol/l的gyra-f、终浓度为0.4mmol/l的gyra-r、终浓度为0.7mmol/l的gyrb-f、终浓度为0.7mmol/l的gyrb-r、终浓度为0.5mmol/l的pare-f、终浓度为0.5mmol/l的pare-r和终浓度为0.02u/ul的taqdna聚合酶，其中gyra-f、gyra-r、gyrb-f、gyrb-r、pare-f和pare-r分别如seqid1、seqid2、seqid3、seqid4、seqid5和seqid6，上述pcr缓冲液的10倍母液中包括15mm氯化钾、ph8.3的12mmtris-hcl和0.01%氯化钠，30mmmgcl2；

上述pcr扩增的反应体系为50ul，反应条件如下：93℃预变性10min，然后进入如下循环：93℃变性50s、53℃退火50s、72℃延伸1min，共35个循环，循环结束后于72℃延伸10min，4℃保存；

（3）步骤（2）的pcr扩增结束后，取5ulpcr产物，与1ulloadingbuffer混匀后，点样于2%琼脂糖凝胶电泳板孔中，80v电压，电泳40min，于紫外荧光成相仪下拍照判定，电泳结果如图1所示，结果可见600bp左右、850bp左右、700bp左右的条带，分别指示grya基因、gryb基因、pare基因。

将经过纯化的pcr产物50ul和20ul三基因的上下游引物一起进行dna测序。

技术特征：

1.一种副溶血弧菌氟喹诺酮类药物耐药基因检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）收集副溶血弧菌活菌体1.0~1.2g，用7~8ml去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，10000~12000rpm离心10~15min后收集上清液，得到模板；

（2）将该模板与氟喹诺酮类药物耐药基因检测引物gyra-f、gyra-r、gyrb-f、gyrb-r、pare-f和pare-r共同混合后，进行pcr扩增，该pcr扩增的反应体系中包括超纯水、pcr缓冲液、终浓度均为0.3~0.5mmol/l的dntp、终浓度为0.3~0.5mmol/l的gyra-f、终浓度为0.3~0.5mmol/l的gyra-r、终浓度为0.5~0.8mmol/l的gyrb-f、终浓度为0.5~0.8mmol/l的gyrb-r、终浓度为0.5~0.6mmol/l的pare-f、终浓度为0.5~0.6mmol/l的pare-r和终浓度为0.02~0.03u/ul的taqdna聚合酶，其中gyra-f、gyra-r、gyrb-f、gyrb-r、pare-f和pare-r分别如seqid1、seqid2、seqid3、seqid4、seqid5和seqid6，上述pcr缓冲液的10倍母液中包括10~20mm氯化钾、ph8.3的12mmtris-hcl和0.01~0.02%氯化钠，20~30mmmgcl2；

（3）步骤（2）的pcr扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳并送交测序。

2.如权利要求1所述的一种副溶血弧菌氟喹诺酮类药物耐药基因检测方法，其特征在于：所述步骤（1）为：收集副溶血弧菌活菌体1.0~1.2g，用7~8ml去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，10000~12000rpm离心10~15min后收集上清液，得到模板。

3.如权利要求1所述的一种副溶血弧菌氟喹诺酮类药物耐药基因检测方法，其特征在于：所述pcr扩增的反应体系中包括超纯水、pcr缓冲液、终浓度均为0.4mmol/l的dntp、终浓度为0.4mmol/l的gyra-f、终浓度为0.4mmol/l的gyra-r、终浓度为0.7mmol/l的gyrb-f、终浓度为0.7mmol/l的gyrb-r、终浓度为0.5mmol/l的pare-f、终浓度为0.5mmol/l的pare-r和终浓度为0.02u/ul的taqdna聚合酶。

4.如权利要求1所述的一种副溶血弧菌氟喹诺酮类药物耐药基因检测方法，其特征在于：所述pcr缓冲液的10倍母液中包括15mm氯化钾、ph8.3的12mmtris-hcl和0.01%氯化钠，30mmmgcl2。

5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的一种副溶血弧菌氟喹诺酮类药物耐药基因检测方法，其特征在于：所述pcr扩增的反应条件如下：90~93℃预变性8~10min，然后进入如下循环：90~93℃变性40s~50s、50~53℃退火40~50s、72~74℃延伸50s~1min，共30~35个循环，循环结束后于72℃延伸5~10min，2~4℃保存。

6.如权利要求5所述的一种副溶血弧菌氟喹诺酮类药物耐药基因检测方法，其特征在于：所述pcr扩增的反应条件如下：93℃预变性10min，然后进入如下循环：93℃变性50s、53℃退火50s、72℃延伸1min，共35个循环，循环结束后于72℃延伸10min，4℃保存。

7.如权利要求1所述的一种副溶血弧菌氟喹诺酮类药物耐药基因检测方法，其特征在于：所述步骤（3）的电泳条件为：2%琼脂糖凝胶，80v电压，时间40min。

技术总结
本发明涉及一种副溶血弧菌氟喹诺酮类药物耐药性检测方法，其步骤如下：（1）收集副溶血弧菌活菌体1.0~1.2g，用7~8mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，离心后收集上清液，得到模板；（2）将该模板与氟喹诺酮类药物耐药基因检测引物GyrA‑F、GyrA‑R、GyrB‑F、GyrB‑R、ParE‑F和ParE‑R共同混合后，进行PCR扩增；（3）步骤（2）的PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳并测序。本发明的检测方法敏感、特异、快速，可以检测极微量的目的基因，不需经过费时的副溶血弧菌培养。

技术研发人员：黄升谋
受保护的技术使用者：湖北文理学院
技术研发日：2018.11.21
技术公布日：2020.05.29