一种新型赖氨酸特异性内切酶及其制备方法与流程

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种新的赖氨酸特异性内切酶及其制备方法。

背景技术：

赖氨酸特异性内切酶(lysylendopeptidase,ec3.4.21.50)又称赖氨酰肽链内切酶、无色杆菌蛋白酶i、赖氨酸内肽酶、赖氨酰内切酶、赖氨酸c端内切酶、lys-c内切酶，是一种丝氨酸蛋白酶，最初由masaki等人从土壤细菌中发现并分离得到的。赖氨酸特异性内切酶具有高度特异性，可特异性切割肽链中赖氨酸残基和s-氨乙基半胱氨酸残基羧基端的肽键。

赖氨酸特异性内切酶还具有以下显著特点：1)比牛胰蛋白酶的活性高10倍；2)具有广泛的ph耐受性(ph8.5-10.5)；3)更强的表面活性剂耐受性，如在含4mol/l尿素或0.1％sds的溶液中保持全酶活性；4)比胰蛋白酶具有更高的底物特异性，胰蛋白酶可以识别和切割赖氨酸和精氨酸，而赖氨酸特异性内切酶通常只识别和切割赖氨酸，因此能显著提高酶切转化率和产物纯度。由于这些特点，赖氨酸特异性内切酶在蛋白序列分析(如质谱分析)、蛋白组学研究(如肽图谱分析)和生物制药(如胰岛素原的酶切)、lys-x化合物酶催化合成等领域具有重要应用价值。

而目前所使用的赖氨酸特异性内切酶存在着以下的问题和缺点：

1.利用野生菌表达赖氨酸特异性内切酶时表达水平太低，无法满足工业化需求。虽然使用野生经诱变选育得到的突变菌株在一定程度上提高表达水平，但是突变菌株稳定性不高，存在回复突变的风险。cn103865836a“一株产酶溶杆菌突变菌株及其制备方法”中公开了一株通过自然选育得到产酶溶杆菌菌株l.enzymogenspgjzc30后再经太空诱变育种得到的表达量最高的突变菌株l.enzymogenstgjzc-041。该菌株使用50l发酵罐发酵培养3天，表达量为1.3u/ml，经纯化后获得390mg的lys-c，即产量为7.8mg/l。

2.为了克服野生菌表达水平低的缺点，人们使用大肠杆菌等工程菌株制备重组赖氨酸特异性内切酶，但是产量没有明显提高，重组赖氨酸特异性内切酶的比活反而有所降低。us5248599a和ep0387646b1公布了一种使用重组大肠杆菌制备赖氨酸特异性内切酶的方法。该方法使用大肠杆菌表达赖氨酸特异性内切酶酶原，并利用大肠杆菌自身修饰加工系统使酶原自我激活，形成具有活性的成熟酶，1l发酵液可获得1.6mg的重组赖氨酸特异性内切酶纯品。cn105950593a“一种赖氨酸特异性内切酶的原核重组表达与制备方法”公布了一种利用大肠杆菌制备重组赖氨酸特异性内切酶的方法。该方法使用重组大肠杆菌表达重组赖氨酸特异性内切酶酶原，产物以包涵体形式存在，经过变性、复性、激活、硫酸铵沉淀、亲和层析、超滤和过凝胶过滤层析获得重组赖氨酸特异性内切酶纯品。每1l发酵体系获得的包涵体经变性可获得1888mg的酶原，经纯化可获得36.61mg的重组赖氨酸特异性内切酶纯品，回收率为1.9％。

3.在生物制药领域使用传统的赖氨酰特异性内切酶时，无法使用高灵敏方法检测药物中赖氨酸特异性内切酶的残留量。采用高效液相色谱法检测中间体以及原料药中赖氨酸特异性内切酶残留量，其检测限只能达到μg级别，且不能检测到赖氨酸特异性内切酶自身降解条带；蛋白电泳法能检测到赖氨酸特异性内切酶自身降解条带，但检测限也只能达到μg级别；赖氨酸特异性内切酶elisa检测试剂盒开发成本高，且目前尚无商业化的elisa试剂盒可以用于检测赖氨酸内肽酶的残留。

因而，开发一种新型的赖氨酸特异性内切酶是非常有必要的。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种赖氨酸特异性内切酶及其制备方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种赖氨酸特异性内切酶，该酶的结构为：赖氨酸特异性内切酶核心-连接肽-组氨酸标签。

作为上述赖氨酸特异性内切酶的进一步改进，赖氨酸特异性内切酶为选自铜绿假单胞来源的、无色杆菌来源的或产酶溶杆菌来源的其中一种赖氨酸特异性内切酶；

作为上述赖氨酸特异性内切酶的进一步改进，连接肽为柔性连接肽，选自ggggs、ggggsggggs、ggggsggggsggggs、ggsgggsggggs、ggsgggsggggsgggggs中的一种；

作为上述赖氨酸特异性内切酶的进一步改进，组氨酸标签为4-8个连续的组氨酸，优选为6个；

作为上述赖氨酸特异性内切酶的进一步改进，该酶的氨基酸序列如seqidno：4所示。

一种上述赖氨酸酰内切酶的制备方法：

1)构建含有该赖氨酸特异性内切酶编码基因的重组载体；

2)将重组载体导入大肠杆菌宿主细胞，得到重组大肠杆菌细胞；

3)对重组大肠杆菌细胞进行发酵培养，加入诱导剂，收集经诱导表达后的重组大肠杆菌细胞；

4)高压均质破碎步骤3)得到的重组大肠杆菌细胞，得到含有新型赖氨酸特异性内切酶的细胞悬液；

5)对含有新型赖氨酸特异性内切酶的细胞悬液进行纯化、冷冻干燥，得到赖氨酸特异性内切酶粉末。

其中，步骤1)中所述重组载体包含t7启动子或t7lac启动子、编码权利要求1所述的赖氨酸特异性内切酶的多核苷酸分子以及位于所述多核苷酸分子下游的t7终止子，其中所述多核苷酸分子位于所述启动子的下游；

其中，步骤3)中所述诱导剂为0.3mm的iptg；

其中，步骤5)中所述纯化的方法为高压均质、镍柱亲和层析。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种新型赖氨酸特异性内切酶，该酶的c末端带有组氨酸标签，可通过his标签elisa检测试剂盒检测样品中纳克级残留的酶，特别适用于生物制药领域；酶核心肽和组氨酸标签之间通过合适的柔性连接肽连接，既保留了组氨酸标签的功能，又保证新型赖氨酸特异性内切酶具有野生型赖氨酸特异性内切酶全酶活性。

本发明还提供了该新型赖氨酸特异性内切酶的制备方法，该方法具有高产量的有益效果，经7.5l发酵罐培养时，表达量可以达到18000au/l，1l发酵液经纯化后获得857mg新型赖氨酸特异性内切酶纯品，高于目前文献报道水平。

附图说明

图1是pgbcets质粒图谱；

图2是赖氨酸特异性内切酶发酵样品电泳图，该图中箭头所示为新型赖氨酸特异性内切酶，为29.2kda，第二泳道为蛋白质分子量标准品，从上往下依次为200kda，116kda，97.2kda，66.4kda，44.3kda，29kda，20.1kda，14.3kda，6.5kda；

图3是用his标签elisa检测试剂盒检测赖氨酸特异性内切酶结果；

图4是用野生型赖氨酸特异性内切酶和新型赖氨酸特异性内切酶酶切门冬胰岛素前体效果对比图，该图中a为野生型赖氨酸特异性内切酶制备的门冬胰岛素中间体，b为新型赖氨酸特异性内切酶制备的门冬胰岛素中间体，峰1为门冬胰岛素前体，峰2为门冬胰岛素中间体。

具体实施方式

本发明通过构建基因工程菌株并进行高密度发酵，得到含有新型赖氨酸特异性内切酶的发酵液，再对其酶活进行检测分析。

1)构建基因工程菌株：

人工合成新型赖氨酸特异性内切酶的编码基因，用限制性内切酶ndei和ecori(购自neb公司)进行酶切，用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(购自tiangen)回收基因片段，然后与经ndei和ecori酶切的表达载体pgbcets(图1)进行连接，转化大肠杆菌top10获得转化子，用通用引物t7promoterprimer和t7terminatorprimer进行测序鉴定，得到重组表达载体。用氯化钙法将重组表达载体转化到大肠杆菌bl21(de3)中，获得新型赖氨酸特异性内切酶基因工程菌株。

2)高密度发酵：

将该基因工程菌株接种到含有3lm9培养基(4g/l葡萄糖，1mm硫酸镁，0.5g/l氯化钠，1g/l氯化铵，3g/l磷酸二氢钾，6g/l七水磷酸氢二钠)的7.5l发酵罐中，在37℃，ph7.0条件下进行培养，甘油耗尽后补加质量体积分数为50％的甘油溶液，当溶氧低于15％时，增加搅拌速率和通气量，培养20h后加入214.47mgitpg进行诱导表达，诱导20h下罐。

3)酶活检测分析：

本法系根据赖氨酰特异性内切酶在一定的条件下，可特异性切割底物，使得底物中的对硝基苯胺被切割下来，而游离的对硝基苯胺在可见光下显色，在一定的浓度范围内其颜色与对硝基苯胺的浓度成正比，采用比色法测定供试品中赖氨酰特异性内切酶的酶活。酶活定义：30℃，ph9.5条件下，每分钟催化底物生成1μmol对硝基苯胺的酶量为1au。按照如下方法进行检测：

空白标记为a1，发酵破碎液标记为a2。分别往a1和a2中加入0.2mol/lamp(2-amino-2-menthyl-1,3-propanediol)buffer溶液2.6ml，2.5mmol/l底物溶液(bz-lys-pna)0.3ml，在30℃水浴锅中预热5min。往a1中加入0.1ml的180mmol/ltris-hcl缓冲液，往a2中加入发酵破碎液0.1ml，迅速混匀后，于30℃水浴锅中反应25min。立即往a1和a2中加入1ml的45％的乙酸，终止反应。a1作为空白对照调零，在405nm处测吸光值。

该方法的酶活的计算公式为：

其中，a表示供试品吸光值，b表示空白吸光值，9.62表示对硝基苯胺毫摩尔消光系数，c表示供试品稀释倍数。

实施例1

人工合成新型赖氨酰特异性内切酶(seqidno：1)的编码基因，其中，不添加柔性连接肽，按上述方法构建基因工程菌株、高密度培养、酶活检测分析。检测得到样品中赖氨酸特异性内切酶酶活为8600au/l。

实施例2

人工合成新型赖氨酰特异性内切酶(seqidno：2)的编码基因，其中，柔性连接肽选择为ggggs，按上述方法构建基因工程菌株、高密度培养、酶活检测分析。检测得到样品中赖氨酸特异性内切酶酶活为10300au/l。

实施例3

人工合成新型赖氨酰特异性内切酶(seqidno：3)的编码基因，其中，柔性连接肽选择为ggggsggggs，按上述方法构建基因工程菌株、高密度培养、酶活检测分析。检测得到样品中赖氨酸特异性内切酶酶活为18600au/l。

实施例4

人工合成新型赖氨酰特异性内切酶(seqidno：4)的编码基因，其中，柔性连接肽选择为ggggsggggsggggs，按上述方法构建基因工程菌株、高密度培养、酶活检测分析。检测得到样品中赖氨酸特异性内切酶酶活为19200au/l。

实施例5

人工合成新型赖氨酰特异性内切酶(seqidno：5)的编码基因，其中，柔性连接肽选择为ggsgggsggggs，按上述方法构建基因工程菌株、高密度培养、酶活检测分析。检测得到样品中赖氨酸特异性内切酶酶活为17400au/l。

实施例6

人工合成新型赖氨酰特异性内切酶(seqidno：6)的编码基因，其中，柔性连接肽选择为ggsgggsggggsggggs，按上述方法构建基因工程菌株、高密度培养、酶活检测分析。检测得到样品中赖氨酸特异性内切酶酶活为17600au/l。

实施例7

制备新型赖氨酸特异性内切酶：

将新型赖氨酸特异性内切酶(seqidno：3)基因工程菌株接种到含9l发酵培养基的20l发酵罐中，按上述高密度发酵方法进行发酵培养，当表达量达到最高时下罐。将发酵液用高压均质机在90mpa压力下均质处理一次，上样至uniida-80ni层析柱，用缓冲液(20mmpbs，0.5mnacl，500mm咪唑，ph7.6，余量为水)进行洗脱，收集获得新型赖氨酸特异性内切酶纯品，经真空冷冻干燥后得到新型赖氨酸特异性内切酶冻干粉。按实施例1所述方法，检测新型赖氨酸特异性内切酶的比活性为2.53au/mg。

实施例8

制备野生型赖氨酸特异性内切酶：

将野生型赖氨酸特异性内切酶基因工程菌(seqidno：7)株接种到含9l发酵培养基的20l发酵罐中，按实施例1所述方法进行发酵培养，当表达量达到最高时下罐。将发酵液用高压均质机在90mpa压力下均质处理一次，经疏水层析获得野生型赖氨酸特异性内切酶纯品，经真空冷冻干燥后得到野生型赖氨酸特异性内切酶冻干粉。按实施例1所述方法，检测野生型赖氨酸特异性内切酶的比活性为2.44au/mg。

实施例9

用his标签elisa试剂盒检测赖氨酸特异性内切酶：

分别取50mg野生型赖氨酸特异性内切酶(实验组b)和50mg新型赖氨酸特异性内切酶(实验组c)，用10mm磷酸盐缓冲液配制成0.5mg/ml的蛋白溶液，采用10倍梯度稀释法稀释得到50ng/ml的蛋白溶液。用组氨酸标签elisa试剂盒进行检测，用酶标仪在450nm下检测吸光值，取10mm磷酸盐缓冲液作为空白对照组同法检测(实验组a)，结果见图3。其结果表明野生型赖氨酸特异性内切酶(实验组b)和空白对照组(实验组a)响应值相当，而新型赖氨酸特异性内切酶(实验组c)有明显响应值。因此，可以组氨酸标签elisa试剂盒检测新型赖氨酸特异性内切酶，而无法检测野生型赖氨酸特异性内切酶。

实施例10

赖氨酸特异性内切酶制备门冬胰岛素时残留量的检测：

将门冬胰岛素前体蛋白溶解在25mmtris-hcl，1mmedta，ph8.5的溶液中，然后按每克前体蛋白加入2au野生型赖氨酸特异性内切酶和新型赖氨酸特异性内切酶，室温(25℃)酶切24h，用高效液相色谱仪分析反应体系中反应底物(冬胰岛素前体蛋白)和产物(门冬胰岛素中间体)，结果见图4。向反应体系中加入稀盐酸调节ph至5.0，10℃静置3h。以8000rpm，10℃，10min的条件离心，收集沉淀物，真空冷冻干燥获得门冬胰岛素中间体粉末。分别用野生型赖氨酸特异性内切酶和新型赖氨酸特异性内切酶进行转肽反应，脱脂、deae离子交换树脂纯化、c8精纯化，真空冷冻干燥获得门冬胰岛素粉末。

分别取磷酸盐缓冲液、经野生型赖氨酸特异性内切酶制备的门冬胰岛素和经新型赖氨酸特异性内切酶制备的门冬胰岛素。使用金斯瑞生物科技有限公司的histagelisadetectionkit(按说明书操作)检测三种样品中的酶残留量，发现用野生型赖氨酸特异性内切酶制备的门冬胰岛素组与磷酸盐缓冲液组无响应值，而用新型赖氨酸特异性内切酶制备的门冬胰岛素实验组有明显响应值。计算1g门冬胰岛素中新型赖氨酸特异性内切酶的残留量为6.2ng。

以上仅为本发明的具体实施例，但本发明的技术特征并不局限于此。本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

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<110>珠海冀百康生物科技有限公司

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