一种幽门螺旋杆菌的培养方法与流程

本发明涉及病原微生物离体培养及快速繁殖的方法，尤其是涉及一种幽门螺旋杆菌深层扩大培养的方法。

背景技术：

幽门螺旋杆菌寄生是一种革兰氏阴性菌，1983年首次从慢性活动性胃炎患者的胃粘膜活检组织中分离成功，是目前所知能够在人胃中生存的唯一微生物种类。

幽门螺旋杆菌主要分布在胃粘膜组织中，67%-80%的胃溃疡和95%的十二指肠溃疡是由幽门螺旋杆菌引起的，幽门螺旋杆菌病的不良预后是胃癌。

感染幽门螺旋杆菌一般采用抗生素三联或者四联疗法，但该疗法容易使幽门螺旋杆菌产生耐药，停药之后复发率高。因此，替换性的治疗或预防策略，如疫苗预防或免疫治疗的研究越来越受到重视。

我公司顺应社会的发展，积极开展幽门螺旋杆菌的治疗方法的研究。经研究发现将幽门螺旋杆菌破碎、提纯，制备成抗原，注射入蛋鸡体内进行免疫，免疫的蛋鸡生产的鸡蛋黄中就含有幽门螺旋杆菌抗体，口服可杀灭幽门螺旋杆菌。该治疗方法无副作用，不会产生耐药性，安全。但是，该方法需要大量的幽门螺旋杆菌，而幽门螺旋杆菌是一种革兰氏阴性杆菌，螺旋形、微需氧、对生长条件要求十分苛刻，一般都采用血平板进行培养，该方法需要大量的微需氧袋或者微需氧室，难以大量培养，而且，采用血平板培养的成本较高，无法满足公司生产的需要。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种幽门螺旋杆菌的培养方法。

本发明采用的技术方案为：

一种幽门螺旋杆菌的培养方法，包括如下步骤：

1、冷冻管b的制备：

（1）称取布氏肉汤加适量蒸馏水配制成溶液，装入抽滤装置中，高温蒸汽灭菌，得液体培养基a；取保存幽门螺旋杆菌的冷冻管a，自然融化后，将幽门螺旋杆菌接种至液体培养基a中，加入血清，将抽滤装置内抽真空，而后再向抽滤装置内冲入含5%o2的混合气体，培养24-96小时，每天换气2-5次，得菌液；

（2）将步骤（1）所得的菌液及等体积浓度为20-60g/100ml的甘油保护剂于灭菌的保存管中，-60~-80℃冷冻保藏，制备成冷冻管b；该步骤中甘油保护剂的添加可防止冷冻过程中细胞冻伤。

2、放大培养：

（1）称取布氏肉汤加适量蒸馏水配制成溶液，装入抽滤装置中，高温蒸汽灭菌，得液体培养基b；取冷冻管b，自然融化，将冷冻管b内的菌体转接至液体培养基b中，加入血清，将抽滤装置内抽真空，而后再向抽滤装置内充入含5%o2的混合气体，培养24-96小时，每天换气2-5次，得菌液。

（2）将步骤2-（1）所得的菌液按照步骤2-（1）的步骤重复培养若干次得目标菌体。

优选地，步骤（1）中，所述幽门螺旋杆菌是保藏号为atcc43504的幽门螺旋杆菌。

优选地，步骤1-（1）、2-（1）和2-（2）中，所述抽滤装置包括抽滤瓶，抽滤瓶的瓶口采用胶塞封口，再用多层纱布包扎；所述抽滤瓶的抽滤口可拆卸设有胶管，所述胶管的自由端安装有微型无菌过滤器，所述胶管上还可拆卸设有夹子。

优选地，所述纱布至少设置六层。

优选地，步骤1-（1）、2-（1）和2-（2）中，所述混合气体为由5%o2、15%co2和80%n2组成的混合气体。

优选地，所述步骤1-（1）、2-（1）和2-（2）中，液体培养基a、液体培养基b中布氏肉汤加量均为2.8%，血清加量均为1-10ml/100ml。

优选地，所述步骤1-（1）、2-（1）和2-（2）中，血清于56℃水浴锅中，水浴加热30min，去除补体。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明提供了一种全新的幽门螺旋杆菌的培养方法，本发明简便易行、生产成本较低。本发明提供的幽门螺旋杆菌的培养方法是一种深层液体培养方法，本发明中所采用的抽滤装置是为了满足本发明实验要求进行改造的培养容器，本发明中的抽滤装置能够使对培养条件要求苛刻的幽门螺旋杆菌处于适宜的培养环境快速繁殖。具体来说，本发明对常用的抽滤瓶进行改造，设备简单易行，本发明通过对培养瓶抽取真空，再置换入幽门螺旋杆菌所需的含5%氧气的混合气体，使得本发明培养容器内自成微需氧系统，不受外界氧环境的限制，保证了菌体的培养环境，菌体生长好，本发明只要有恒温室和摇瓶机，就可以放大培养，有效满足了为大量生产提供菌种使用的需求；而且，本发明采用价格便宜的瓶装混合气体代替价格较高而且一次性使用的微需氧袋，培养成本明显下降；此外，本发明只需使用国产的培养基进行二级液体深层培养，相比常规的血平板培养，成本低廉。此外，经检测，采用本发明所述的培养方法培养所得的菌体浓度在600nm下od值为0.1-2.0，即1ml含有幽门螺旋杆菌0.2×10⁹-4.0×10⁹个，显然，本发明所述的培养方法能够取得菌体培养的高产。

附图说明

图1为本发明抽滤装置的结构示意图。

图中：1、抽滤瓶，2、纱布，3、胶管，4、夹子，5、微型无菌过滤器。

具体实施方式

实施例1：

幽门螺旋杆菌的培养方法，包括如下步骤：

1、冷冻管b的制备：

（1）称取布氏肉汤1.4g，加蒸馏水配制成50ml溶液，装入100ml的抽滤瓶1中，高温蒸汽灭菌，得液体培养基a；取保存的幽门螺旋杆菌冷冻管，自然融化后移液枪吸取2ml菌液接种至灭菌的液体培养基a中，加入血清4ml，塞上胶塞，包扎六层纱布2，而后将胶管3上设有的夹子4打开，用真空泵将抽滤瓶1内抽至真空，再通过微型无菌过滤器5充入含有5%氧气的混合气体至混合气体充满抽滤瓶1，培养48小时，每天换气3次；

（2）将步骤（1）培养的菌液，加入50ml灭菌的等体积浓度为40%甘油保护剂，混合均匀，用移液枪分装与无菌螺口保存管中，放入-60~-80℃冷冻保藏，制备成冷冻管b；其中，等体积浓度为40%甘油保护剂是通过下述方法制备的：称取天津科密欧试剂公司生产的分析纯无水甘油40g，加入蒸馏水配制成100ml，高温蒸汽灭菌；

2、放大培养：

（1）称取布氏肉汤0.56g，用蒸馏水配制成20ml溶液，装入50ml抽滤瓶1中，高温蒸汽灭菌得液体培养基b；取步骤1-（2）中制备的冷冻管b，自然融化后移液枪吸取2ml菌液接种至灭菌的液体培养基b，加入血清2ml，塞上胶塞，包扎六层纱布2，将胶管3上设有的夹子4打开，用真空泵将抽滤瓶1内抽至真空，再通过微型无菌过滤器充入含有5%氧气的混合气体至混合气体充满抽滤瓶1，培养48小时，每天换气3次，得菌液；

（2）称取布氏肉汤1.4g，用蒸馏水配制成50ml溶液，装入100ml抽滤瓶1中，高温蒸汽灭菌得液体培养基b，取步骤2-（1）培养的菌液，移液枪吸取5ml接种至该步骤中制备的液体培养基b中，加入血清4ml，塞上胶塞，包扎六层纱布2，将胶管上设有的夹子4打开，用真空泵将抽滤瓶1内抽至真空，再通过微型无菌过滤器5充入含有5%氧气的混合气体至混合气体充满抽滤瓶1，培养96小时，每天换气3次得目标菌体；收获的菌体在600nm下检测od值为1.23，即1ml含有幽门螺旋杆菌2.46×10⁹个。

实施例2：

幽门螺旋杆菌的培养方法，包括如下步骤：

1、该实施例2中冷冻管b的制备步骤与实施例1中冷冻管b的制备步骤相同；

2、放大培养：

（1）称取布氏肉汤0.56g，用蒸馏水配制成20ml溶液，装入50ml抽滤瓶1中，高温蒸汽灭菌得液体培养基b，取步骤1-（2）中制备的冷冻管b，自然融化后移液枪吸取2ml菌液接种至该步骤制备的液体培养基b，加入血清1.5ml，塞上胶塞，包扎七层纱布2，而后将胶管3上设有的夹子4打开，用真空泵将抽滤瓶1内抽至真空，再通过微型无菌过滤器5充入含有5%氧气的混合气体至混合气体充满抽滤瓶1，培养48小时，每天换气2次，得菌液；

（2）称取布氏肉汤2.8g，用蒸馏水配制成100ml溶液，装入250ml抽滤瓶1中，高温蒸汽灭菌得液体培养基b，取步骤2-（1）中培养的菌液，移液枪吸取5ml接种至该步骤中制得的液体培养基b中，加入血清6ml，塞上胶塞，包扎七层纱布2，而后将胶管3上设有的夹子4打开，用真空泵将抽滤瓶1内抽至真空，再通过微型无菌过滤器5充入含有5%氧气的混合气体，培养24小时，每天换气2次，得目标菌体；收获的菌体，在600nm下检测od值为0.554，即1ml含有幽门螺旋杆菌1.108×10⁹个。

实施例3：

幽门螺旋杆菌的培养方法，包括如下步骤：

1、该实施例2中冷冻管b的制备步骤与实施例1中冷冻管b的制备步骤相同；

2、放大培养：

（1）称取布氏肉汤0.56g，用蒸馏水配制成20ml溶液，装入50ml抽滤瓶1中，高温蒸汽灭菌，制得液体培养基b；取步骤1-（2）中制备的冷冻管b，自然融化后移液枪吸取2ml菌液接种至该步骤中制得的液体培养基b中，加入血清1.5ml，塞上胶塞，包扎八层纱布2，而后将胶管3上设有的夹子4打开，用真空泵将抽滤瓶1内抽至真空，再通过微型无菌过滤器5充入含有5%氧气的混合气体至混合气体充满抽滤瓶1，培养48小时，每天换气2次，得菌液；

（2）称取布氏肉汤5.6g，配制成200ml溶液，装入500ml抽滤瓶1中，高温蒸汽灭菌，制得液体培养基b，取步骤2-（1）中培养的菌液，移液枪吸取10ml接种至该步骤中制得的液体培养基b中，加入血清4ml，塞上胶塞，包扎八层纱布2，而后将胶管3上设有的夹子4打开，用真空泵将抽滤瓶1内抽至真空，再通过微型无菌过滤器5充入含有5%氧气的混合气体至混合气体充满抽滤瓶1，培养48小时，每天换气3次，得目标菌体；收获的菌体，在600nm下检测od值为0.651，即1ml含有幽门螺旋杆菌1.302×10⁹个。

实施例4：

该幽门螺旋杆菌的培养方法，包括如下步骤：

1、该实施例2中冷冻管b的制备步骤与实施例1中冷冻管b的制备步骤相同；

2、放大培养：

（1）称取布氏肉汤1.4g，用蒸馏水配制成50ml溶液，装入100ml抽滤瓶1中，高温蒸汽灭菌，制得液体培养基b；取步骤1-（2）中制备的冷冻管b，自然融化后移液枪吸取2.5ml菌液接种至该步骤中制得的液体培养基b中，加入血清4ml，塞上胶塞，包扎九层纱布2，而后将胶管3上设有的夹子4打开，用真空泵将抽滤瓶1内抽至真空，再通过微型无菌过滤器5充入含有5%氧气的混合气体至混合气体充满抽滤瓶1，培养48小时，每天换气2次，得菌液；

（2）称取布氏肉汤14g，用蒸馏水配制成500ml溶液，装入1000ml抽滤瓶1中，高温蒸汽灭菌，制得液体培养基b；取步骤1-（2）中制备的冷冻管b，用移液枪吸取45ml接种至该步骤中制得的液体培养基b，加入血清50ml，塞上胶塞，包扎九层纱布2，而后将胶管3上设有的夹子4打开，用真空泵将抽滤瓶1内抽至真空，再通过微型无菌过滤器5充入含有5%氧气的混合气体至混合气体充满抽滤瓶1，培养96小时，每天换气2次得目标菌体；收获的菌体，在600nm下检测od值为1.095，即1ml含有幽门螺旋杆菌2.19×10⁹个。

本申请实施例一至四中所使用的混合气体均为由5%o2、15%co2和80%n2组成的混合气体。