本发明涉及一株产蛋白酶的芽孢杆菌及其在堆肥中的应用，属环境生物技术领域。
背景技术：
截止2015年6月底，我国已有城镇污水处理厂3802座，日处理生活污水能力达1.6亿立方米。伴随污水处理过程，随之产生的剩余污泥约为污水处理量的0.3％-0.5％，我国每天产生剩余污泥约为4000万吨(按80％的含水率计)，并以8％-10％的年增长率持续递增。污水处理剩余污泥中含有丰富的植物营养物质，如城市污泥中含氮约2％-7％，磷1％-5％，钾0.1％-0.8％。消化污泥中钾含量较少，但其氮、磷含量与厩肥差不多。活性污泥的氮、磷含量为厩肥的4-5倍。此外，污泥中还含有硫、铁、钙、钠、镁、锌、铜、钼等微量元素、丰富的有机物与腐殖质。利用污泥堆肥，既有较好肥效，又能使土壤形成团粒结构，起到改良土壤的作用，同时实现了污泥的资源化利用。
然而，污水处理厂每天产出大量剩余污泥堆放在厂区，定期运送到垃圾填埋场填埋或将剩余污泥自然风干脱水后，焚烧供热。一方面，这些处理处置方式不仅成本较高，而且在过程中容易使污泥中的有害成分对环境造成二次污染。另一方面，污泥含有丰富的可利用有机物，以蛋白质为例，我国污水处理厂剩余污泥的蛋白质含量为35-60％，其中包括微生物蛋白质和胞外聚合物蛋白质两部分。微生物占活性污泥干重的40％以上，包括细菌和微型动物，细菌占微生物的90-95％，而蛋白质占细菌干重的50-60％，微型动物中蛋白质含量近80％。胞外蛋白质占总污泥蛋白质约40％。
针对剩余污泥的性质和组成，筛选蛋白质的新型降解菌、与其他微生物菌种复配获得复合微生物菌剂，对加快堆肥化进程、提高堆肥化效率与改善堆肥卫生环境具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一株产蛋白酶的bacillushisashiistrainb207，已于2018年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2018473，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。该菌株的发酵培养条件为：温度30℃-60℃，通气量0.5-1vvm，搅拌转速200-600r/min，溶解氧大于10％，ph值6.5-7.5。
本发明的第二个目的是提供含有所述bacillushisashiistrainb207的微生物菌剂，菌剂中bacillushisashiistrainb207的数量≥3.0×108cfu/g。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中bacillushisashiistrainb207的数量≥3.0×108cfu/ml。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂还含有纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillusfusiformis)、库德里阿兹威氏毕赤酵母(pichiakudriavzevii)、蔬菜芽孢杆菌(bacillusoleronius)和bacillusthermolactisstrainb209；所述bacillusthermolactisstrainb209，已于2018年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2018474，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
在本发明的一种实施方式中，所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillusfusiformis)可选用lysinibacillusfusiformisatcc7055；所述库德里阿兹威氏毕赤酵母(pichiakudriavzevii)可选用pichiakudriavzeviiatcc24210，所述蔬菜芽孢杆菌(bacillusoleronius)可选用bacillusoleroniusdsm9356。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中bacillushisashiistrainb207、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、库德里阿兹威氏毕赤酵母、蔬菜芽孢杆菌与bacillusthermolactisstrainb209的活菌数之比为700-860:3.5-6:1-2.5:700-860:1600-2200，微生物菌剂的活菌总数为1.0×109-1.0×1010cfu/ml或cfu/g。
本发明的第三个目的是提供一种制备上述微生物菌剂的方法，所述方法是将bacillushisashiistrainb207、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、库德里阿兹威氏毕赤酵母、蔬菜芽孢杆菌与bacillusthermolactisstrainb209分别接种至培养基中，获得bacillushisashiistrainb207、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、库德里阿兹威氏毕赤酵母、蔬菜芽孢杆菌与bacillusthermolactisstrainb209的发酵液；将获得的发酵液按照比例混合，添加发酵液质量0.1～10％的载体辅料，获得液态微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述载体辅料包括但不限于褐煤、沸石、石粉中的一种或几种。
在本发明的一种实施方式中，所述复合微生物菌剂的制备方法是将bacillushisashiistrainb207、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、库德里阿兹威氏毕赤酵母、蔬菜芽孢杆菌与bacillusthermolactisstrainb209发酵液按比例混合，添加粉碎秸秆、炭化秸秆、麸皮中的一种或几种，热风干燥后，得到固态复合微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述bacillushisashiistrainb207、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、库德里阿兹威氏毕赤酵母、蔬菜芽孢杆菌与bacillusthermolactisstrainb209分别接种至高温灭菌后的营养肉汤培养基中，接种量为发酵培养基体积的3％-10％(v/v)，静置培养20-40h；所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌的培养温度为28-37℃；所述bacillushisashiistrainb207、蔬菜芽孢杆菌与bacillusthermolactisstrainb209的培养温度为30-60℃；当活菌数≥1×108cfu/ml时，获得所述bacillushisashiistrainb207、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、蔬菜芽孢杆菌与bacillusthermolactisstrainb209的发酵液。
在本发明的一种实施方式中，所述营养肉汤培养基为高温灭菌后的营养肉汤培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述营养肉汤培养基的成分包含牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，水1000ml。
在本发明的一种实施方式中，将库德里阿兹威氏毕赤酵母接种至高温灭菌后的马铃薯葡萄糖培养基中，接种量为发酵培养基体积的3％-10％(v/v)，静置培养20-30h，培养温度为20-30℃；当活菌数大于或等于1×108cfu/ml时，获得所述库德里阿兹威氏毕赤酵母的发酵液。
在本发明的一种实施方式中，所述马铃薯葡萄糖培养基为120℃高温灭菌后的马铃薯葡萄糖培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述马铃薯葡萄糖培养基的成分包含马铃薯浸粉6.0g，葡萄糖20.0g，水1000ml。
本发明的第四个目的是提供所述微生物菌剂的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是促进食品厂污水处理剩余污泥与秸秆混合堆肥。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括如下步骤：
(1)将所述复合微生物菌剂和堆肥原料按照0.1-0.5：100的比例进行混合；
(2)将混合物堆制堆肥，测量堆体温度，按照温度变化进行翻堆。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)将所述混合物堆制堆肥，每天早上8:00和下午6:00测量堆体温度，当温度高于55℃时，每天翻堆一次，随着堆制时间的延长，堆体温度开始下降，当温度低于40℃时，停止翻堆，堆制结束。
本发明还要求保护所述bacillushisashiistrainb207在食品、化工、生物、环境领域的应用。
有益效果：
(1)本发明公开了一株可降解蛋白质的bacillushisashiistrainb207。该菌株产蛋白酶，发酵26h后酶活可达119.8u/ml，具有较好的蛋白质降解能力。
(2)本发明提供的这种堆肥复合微生物菌剂，可用于食品厂污水处理剩余污泥与秸秆混合堆制堆肥，较好实现食品厂污水处理剩余污泥与秸秆混合堆肥的资源化利用。
(3)本发明提供的这种复合微生物菌剂，堆制1.5d后，可使堆肥原料中蛋白质的降解率达95.2％-98.9％，而对照实验中蛋白质降解率为58.2％。
(4)本发明提供的这种微生物菌剂在堆制堆肥时优势明显，可有效缩短堆体升温时间，使得堆体达到高温55℃所需时间由对照实验的56h缩短至12-24h，缩短堆肥周期。
(5)本发明提供的这种微生物菌剂在堆制堆肥时优势明显，可有效提高堆体的最高温度，使得堆体达到的最高温度由对照实验的58℃提高至61-67℃，堆肥卫生条件良好。
(6)本发明提供的这种微生物菌剂在堆制堆肥时优势明显，可改善堆肥的无害化效果，堆肥结束时，粪大肠菌群数与蛔虫卵死亡率分别为64-90个/g与95.9％-99.0％％，而对照实验分别为210个/g与88.9％。
生物材料保藏
bacillushisashiistrainb207，已于2018年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2018473，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
bacillusthermolactisstrainb209，已于2018年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2018474，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
具体实施方式
(1)蛋白质含量的检测方法：采用凯氏定氮法进行检测，即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量，进而得到蛋白质含量。蛋白质的降解率为r(％)：
r＝[(m1-m2)/m1/*100％
其中，m1为起始原料中蛋白质的质量(mg)，m2为堆制一段时间后物料中蛋白质的质量(mg)。
(2)粪大肠菌群数的检测方法：采用肥料中粪大肠菌群数的检测方法(gb/t19524.1-2004)进行检测。
(3)蛔虫卵死亡率的检测方法：采用肥料中粪大肠菌群数的检测方法(gb/t19524.2-2004)进行检测。具体实施方式中，纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、库德里阿兹威氏毕赤酵母和蔬菜芽孢杆菌选用商业化菌株：lysinibacillusfusiformisatcc7055、pichiakudriavzeviiatcc24210、bacillusoleroniusdsm9356，但不受限于上述菌株。
实施例1bacillushisashiistrainb207的筛选
(1)将食品厂污水处理的剩余污泥与玉米秸秆按质量比1.5：1的比例混合，接种5％(w/w)的江苏省无锡市某区夏季腐叶，混合物料的含水率为55％，c/n比为25，混合均匀后堆制堆肥，每天早上8:00和下午6:00测量堆体温度，当温度高于55℃时，每天翻堆一次，随着堆制时间的延长，堆体温度开始下降，当温度低于40℃时，停止翻堆，取样；
(2)以步骤(1)制备的堆肥样品为菌株筛选的样品，称取堆肥样品10g，放入装有90ml灭菌水的三角烧瓶中，120r/min摇床震荡1h，得到10-1稀释液，并依次制成10-4、10-5和10-6的三种堆肥样品稀释液，分别吸取上述三种稀释液100μl均匀涂布于营养琼脂培养基、高氏一号琼脂培养基和马铃薯琼脂培养基平板上，分别置于45℃的培养箱中倒置培养1～7d，然后反复划线分离，直至获得纯菌株；
(3)采用明胶鉴别培养基培养各纯菌株，若明胶液化，表示可产蛋白酶，并可据明胶液化程度判断菌株的产蛋白酶能力，液化程度越重产蛋白酶能力越强，将获得的产蛋白质酶能力最强的菌株进行菌株鉴定。
实施例2bacillushisashiistrainb207的鉴定
在营养琼脂培养基平板上于55℃培养过夜后，形成米黄色，边缘清晰的扁平及圆形的菌落，用光学显微镜观察呈革兰氏染色阳性，呈单个或成对细胞排列，杆状，产芽孢，可利用碳水化合物产酸。
采用16srdna测序进行分类学分子鉴定，将测序结果(1493bp)在ncbi中进行blast比对，发现其16srdna碱基序列与hisashii芽孢杆菌(bacillushisashiistrain)的相似性最高，为99％。
综合上述形态特征、生理生化特征及遗传性特征，可鉴定该产蛋白酶菌株为hisashii芽孢杆菌(bacillushisashiistrain)，将其命名为hisashii芽孢杆菌b207，并于2018年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctccno.m2018473。
将菌株接种至营养琼脂培养基平板上，45℃培养26h，然后接种至营养肉汤培养基中，45℃培养26h，将发酵液离心，采用福林酚法测定蛋白酶活力，经测定，蛋白酶酶活为119.8u/ml。
将食品厂污水处理剩余污泥与玉米秸秆按1.5：1比例混合，混合物料的含水率为55％，c/n比为30，将0.3％(按质量计)bacillushisashiistrainb207的发酵液与物料混合均匀后，堆制堆肥，每天早上8:00和下午6:00测量两个堆体的温度，当温度高于55℃时，每天翻堆一次，随着堆制时间的延长，堆体温度开始下降，当温度低于40℃时，停止翻堆，取样测定。结果显示，堆制1.5d后，原料中蛋白质含量降低了90.2％。
实施例3bacillushisashiistrainb207活化与培养
将bacillushisashiistrainb207接种至营养琼脂培养基平板上，45℃培养26h。营养琼脂培养基的组成为牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g。
将活化好的菌种接种于装有100ml液体培养基的250ml摇瓶中，45℃条件下，160r/min振荡培养26h。摇瓶培养基组成为牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，ph为7.0。
将摇瓶培养液按体积比3％-10％接种至3l发酵罐中，搅拌转速为200-600r/min，通气量为0.5-1.0vvm，溶解氧大于10％，30℃-60℃条件下发酵培养20-30h。发酵罐培养基组成为牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，乙酸钠30g，磷酸二氢钾2.0g，氯化钠5.0g，ph为7.0。
实施例4含bacillushisashiistrainb207的液态复合微生物菌剂的制备
堆肥复合微生物菌剂由bacillushisashiistrainb207发酵液与其他菌株发酵液复配而成，具体制备方法如下：
(1)bacillushisashiistrainb207、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、蔬菜芽孢杆菌与bacillusthermolactisstrainb209的发酵液为将bacillushisashiistrainb207、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、蔬菜芽孢杆菌与bacillusthermolactisstrainb209分别接种至高温灭菌后的营养肉汤培养基中，接种量为发酵培养基体积的3％-10％(v/v)，培养20-30h；所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌的培养温度为28-37℃；所述bacillushisashiistrainb207、蔬菜芽孢杆菌与bacillusthermolactisstrainb209的培养温度为30-60℃；当活菌数大于或等于1×108cfu/ml时，获得所述bacillushisashiistrainb207、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、蔬菜芽孢杆菌与bacillusthermolactisstrainb209的发酵液；
(2)库德里阿兹威氏毕赤酵母的发酵液为将库德里阿兹威氏毕赤酵母接种至高温灭菌后的马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，接种量为发酵培养基体积的3％-10％(v/v)，培养20-30h，培养温度为20-30℃；当活菌数大于或等于1×108cfu/ml时，获得所述库德里阿兹威氏毕赤酵母的发酵液；
(3)将获得的bacillushisashiistrainb207、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、库德里阿兹威氏毕赤酵母、蔬菜芽孢杆菌与bacillusthermolactisstrainb209的发酵液按一定比例混合，使各菌种的活菌数之比为700～860:3.5～6:1～2.5:700～860:1600～2200，添加发酵液质量0.1～10％的市售的载体辅料褐煤、沸石、石粉中的一种或几种，获得活菌总数为1.0×109～1.0×1010cfu/ml的液态复合微生物菌剂。
实施例5含bacillushisashiistrainb207的固态复合微生物菌剂的制备
将获得的bacillushisashiistrainb207、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、库德里阿兹威氏毕赤酵母、蔬菜芽孢杆菌与bacillusthermolactisstrainb209的发酵液按照一定的比例混合，添加市售粉碎秸秆、炭化秸秆、麸皮中的一种或几种，热风干燥后，得到包含bacillushisashiistrainb207的固态复合微生物菌剂。
实施例6堆肥复合微生物菌剂的应用
将食品厂污水处理剩余污泥与玉米秸秆按1.5：1比例混合，混合物料的含水率为55％，c/n比为30，将含bacillushisashiistrainb207、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、库德里阿兹威氏毕赤酵母、蔬菜芽孢杆菌与bacillusthermolactisstrainb209的活菌数之比为800:4:1.8:780:2000的液态复合微生物菌剂与混合物料按照质量配比为0.3：100的比例混合，菌剂添加量为0.3％，混合均匀后，堆制堆肥，每天早上8:00和下午6:00测量两个堆体的温度，当温度高于55℃时，每天翻堆一次，随着堆制时间的延长，堆体温度开始下降，当温度低于40℃时，停止翻堆，取样，测定堆肥各项质量指标。结果表明，堆体达到最高温度所需时间为15h，最高温度为66℃；堆置1.5d后，蛋白质降解率为95.9％；堆肥结束时，混合物料的碳氮比为17.6，粪大肠菌群数与蛔虫卵死亡率分别为77个/g与98.2％。
实施例7堆肥复合微生物菌剂的应用
将食品厂污水处理剩余污泥与玉米秸秆按2.5：1比例混合，混合物料的含水率为55％，c/n比为25，将bacillushisashiistrainb207、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、库德里阿兹威氏毕赤酵母、蔬菜芽孢杆菌与bacillusthermolactisstrainb209的活菌数之比为700:3.5:1:700:1600的液态复合微生物菌剂与混合物料按照质量配比为0.5：100的比例混合，菌剂添加量为0.5％，混合均匀后，堆制堆肥，每天早上8:00和下午6:00测量两个堆体的温度，当温度高于55℃时，每天翻堆一次，随着堆制时间的延长，堆体温度开始下降，当温度低于40℃时，停止翻堆，取样，测定堆肥各项质量指标。结果表明，堆体温度迅速升高，达到最高温度所需时间为24h，最高温度为61℃；堆置1.5d后，蛋白质降解率为95.2％；堆肥结束时，混合物料的碳氮比为18.1，粪大肠菌群数与蛔虫卵死亡率分别为89个/g与95.9％。
实施例8堆肥复合微生物菌剂的应用
将食品厂污水处理剩余污泥与玉米秸秆按2.5：1比例混合，混合物料的含水率为55％，c/n比为25，将bacillushisashiistrainb207、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、库德里阿兹威氏毕赤酵母、蔬菜芽孢杆菌与bacillusthermolactisstrainb209的活菌数之比为780:4:1.8:760:1900的液态复合微生物菌剂与混合物料按照质量配比为0.5：100的比例混合，菌剂添加量为0.5％，混合均匀后，堆制堆肥，每天早上8:00和下午6:00测量两个堆体的温度，当温度高于55℃时，每天翻堆一次，随着堆制时间的延长，堆体温度开始下降，当温度低于40℃时，停止翻堆，取样，测定堆肥各项质量指标。结果表明，堆体温度迅速升高，达到最高温度所需时间为12h，最高温度为67℃；堆置1.5d后，蛋白质降解率为98.9％；堆肥结束时，混合物料的碳氮比为12.6，粪大肠菌群数与蛔虫卵死亡率分别为64个/g与99.0％。
实施例9堆肥复合微生物菌剂的应用
将食品厂污水处理剩余污泥与玉米秸秆按2.0：1比例混合，混合物料的含水率为55％，c/n比为27，将bacillushisashiistrainb207、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、库德里阿兹威氏毕赤酵母、蔬菜芽孢杆菌与bacillusthermolactisstrainb209的活菌数之比为860:6:2.5:860:2200的固态复合微生物菌剂与混合物料按照质量配比为0.1：100的比例混合，菌剂添加量为0.1％，混合均匀后堆制堆肥，每天早上8:00和下午6:00测量两个堆体的温度，当温度高于55℃时，每天翻堆一次，随着堆制时间的延长，堆体温度开始下降，当温度低于40℃时，停止翻堆，取样，测定堆肥各项质量指标。结果表明，堆体温度迅速升高，达到最高温度所需时间为24h，最高温度为61℃；堆置1.5d后，蛋白质降解率为95.2％；堆肥结束时，混合物料的碳氮比为18.9，粪大肠菌群数与蛔虫卵死亡率分别为90个/g与95.9％。
对比例1
将食品厂污水处理剩余污泥与玉米秸秆按1.5：1比例混合，混合物料的含水率为55％，c/n比为30，将不含bacillushisashiistrainb207的上述液态复合微生物菌剂与混合物料按照质量配比为0.3：100的比例混合，菌剂添加量为0.3％，其中，纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、库德里阿兹威氏毕赤酵母、蔬菜芽孢杆菌与bacillusthermolactisstrainb209的活菌数之比为4:1.8:780:2000，混合均匀后，堆制堆肥，每天早上8:00和下午6:00测量两个堆体的温度，当温度高于55℃时，每天翻堆一次，随着堆制时间的延长，堆体温度开始下降，当温度低于40℃时，停止翻堆，取样，测定堆肥各项质量指标。结果表明，堆体达到最高温度所需时间为56h，最高温度为58℃；堆置1.5d后，蛋白质降解率为58.2％；堆肥结束时，混合物料的碳氮比为21.5，粪大肠菌群数与蛔虫卵死亡率分别为210个/g与88.9％。
对比例2
具体实施方式同实施例6，区别在于，bacillushisashiistrainb207、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、库德里阿兹威氏毕赤酵母、蔬菜芽孢杆菌与bacillusthermolactisstrainb209的活菌数之比有差异，具体如表1所示。结果表明，堆体达到最高温度所需时间延长至45-52h，最高温度为54-56℃；堆置1.5天后，蛋白质降解率仅为52.1-62.4％；堆肥结束时，混合物料的碳氮比为20.0-23.4，粪大肠菌群数与蛔虫卵死亡率分别为210-670个/g与66.8-79.6％。
表1
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。