本发明属于土壤修复
技术领域：
，具体涉及一种高活性微生物土壤修复剂的制备方法。
背景技术：
：我国人口众多，人均可耕种土地面积不足1.35亩，占世界人均耕地面积的一半不到，而土壤是粮、油等生产的基础，是近14亿人民的衣食所依，这对如此少的可耕种土地带来了巨大压力。作物的生长发育会消耗土壤中大量的养分，而随着作物果实等的采收，土壤中可供作物吸收利用的养分含量越来越少，土壤肥力下降，生产力降低。为保证农作物的产量，氮磷钾化肥的投入量不断增加，并在一定年限内起到增产效果，但随着化肥使用年限的增加，土壤呈现出板结、孔隙度降低、有机质含量减少、土壤养分含量不均匀、土壤养分流失率高等退化现象，严重影响着作物的正常生长发育，导致作物产量和品质下降。另外为防止病害的侵染，使用大量的杀菌剂、杀虫剂，都对土壤造成巨大的污染。微生物修复是利用土著或者外源微生物群，在适宜的环境条件下，促进或强化微生物降解功能，从而达到降低有毒污染物活性或降解成无毒物质的生物修复技术。与物理化学和植物土壤修复技术相比，因具有：（1）经过修复的土壤环境的物理、化学和生物学性质基本保持不变，甚至会优于原有土壤的性质；（2）最大限度地降低污染物的浓度；（3）处理形式多样，可就地处理；（4）环境影响小；（5）修复成本费用低；（6）应用限制较小等优点，微生物修复技术广泛地应用于污染土壤的修复中。但是在实际的使用中，由于受到土著微生物竞争、酸碱度、温度、氧气、营养成分等诸多环境因素的影响和制约，直接将微生物施加到土壤中，外源微生物的作用会变得微乎其微，现今关于此类问题的解决多是采用固定技术将微生物进行固定，从而保障微生物的活性，但是也仅仅是提高了微生物的耐受性，保证微生物本身的活性，而对于提高微生物的活性并没有显著性的改善，修复效果也没有得到实质性的突破。《微生物土壤修复剂的制备方法》（申请号为201410210911.7）中公开了一种微生物土壤修复剂的制备方法。该微生物土壤修复剂具有对土壤中有机磷农药的降解效果显著、有效地改良了土壤肥力结构和食品的安全性，切产品的产量和质量菌有不同程度的提高等优点，但是并不一定是用于所有的土壤，在土著微生物菌种、酸碱度、氧气等差异显著的土壤中，并不一定能很好的保障微生物的修复能力。《盐碱土壤修复微生物菌剂及其制备方法》（申请号为201810557707.0）中公开了一种盐碱土壤修复微生物菌剂及其制备方法。本发明采用微生物固定化载体吸附和包埋微生物发酵液，使微生物逐渐缓释到盐碱土壤，提高微生物耐受性，并利用he-ne激光诱变育种，提高微生物对不良因素的抵抗能力，进而提高微生物活性和修复能力。但是对于微生物的活性的改善不够显著，并且无法保障微生物在土壤中高效持久的发生作用。技术实现要素：本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种高活性微生物土壤修复剂的制备方法，其最终制备的微生物土壤修复剂，适用于各种污染性质的土壤，能够持久有效的降解污染物，降低其在环境中的可迁移性与生物可利用性，改良土壤肥力，提高作物的产量和品质，极具市场推广应用价值。本发明是通过以下技术方案实现的：一种高活性微生物土壤修复剂的制备方法，包括如下步骤：（1）包埋型高活性微生物的制备：a.将伯克霍尔德氏菌cgmccno：6269接种到改良lb液体培养基中，经活化培养得种子液；b.取5~10μl种子液接种到200~400ml改良lb液体培养基中，经摇菌培养得伯克霍尔德氏菌菌液，在摇菌培养的同时进行特定频率的声波处理；c.先将操作b中所得的伯克霍尔德氏菌菌液置于离心机中进行离心，收集沉淀风干至含水率3~7%后得菌粉备用；d.将瓜尔胶和寡糖按照重量比为2~3；0.7~0.9共同投入到摩尔浓度为3~9mol/l的三（羟甲基）氨基甲烷溶液中，不断搅拌直至瓜尔胶和寡糖完全溶解；e.先将操作c所得的菌粉和操作d所得的溶液按照重量比为0.8~1；2~3共同投入搅拌罐内，以150~180rpm的转速搅拌混匀后，用一次性滴管吸取溶液，然后滴入到质量分数为10~12%的氯化钙溶液中，形成凝胶球后放入6~10℃的环境中，低温放置1~1.5h后取出凝胶球，再用去离子水反复冲洗去除未包埋的伯克霍尔德氏菌，滤干即得包埋型高活性微生物；（2）原料称取：称取相应重量份的步骤（1）所得的包埋型高活性微生物34~42份、腐殖酸23~27份、活性炭16~20份、煤灰12~16份、沸石6~9份备用；（3）成品制备：将步骤（2）中称取的所有原料投入搅拌罐内，以700~900rpm的转速进行搅拌，搅拌的同时进行特定频率的微波活化处理，搅拌处理1~2h即可。进一步的，所述步骤（1）操作a或操作b中改良lb液体培养基的制备，包括如下步骤：1）称取相应重量份的胰蛋白胨7~9份、酵母提取物3~5份、氯化钠3~5份、复合粉3~4份、纯化水120~160份备用；2）先将步骤（1）称取的纯化水置于玻璃烧杯中，利用磁力搅拌器进行搅拌，同时进行加热，然后等到纯化水中的温度升至70~80℃时，将步骤1）中称取的胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、复合粉依次加入烧杯中，边搅拌边加入，再继续加热保持混合液中的温度为95~99℃，保持95~99℃搅拌处理20~30min后停止加热；3）将步骤2）所得的混合液置于高温高压灭菌锅内进行灭菌处理，灭菌温度为118~124℃，灭菌的时间为23~29min，取出冷却至室温即可。进一步的，所述步骤1）中复合粉的制备方法是将碳酸铈和纳米碳管按照重量比2.3~2.7；0.7~0.9共同浸入改性液中进行浸泡，浸泡时保持改性液中的温度为70~80℃，改性的同时用频率为45~55khz的超声波进行处理，50~70min后取出离心得滤渣备用；所述改性液中各成分及其对应重量份为：10~20份甘油、7~9份氨水、0.4~0.6份甲基丙烯酸甲酯、4~5份硅烷偶联剂、2~4份硫酸铵、70~80份无菌水。进一步的，所述步骤（1）操作a中伯克霍尔德氏菌的接种量为每1~3ml改良lb液体培养基中接种1~3μl伯克霍尔德氏菌菌种。进一步的，所述步骤（1）操作a中种子液的od600值为0.3~0.7。进一步的，所述步骤（1）操作b中伯克霍尔德氏菌菌液的od600值为0.9~1.3。进一步的，所述步骤（1）操作b中声波处理时声波的频率为13~19khz。进一步的，所述步骤（1）操作c中离心机的转速为5000~8000rpm。进一步的，所述步骤（3）中微波活化处理时微波的频率控制为20~30ghz。本发明提供了一种高活性微生物土壤修复剂的制备方法，在现有微生物土壤修复剂的制备方法上进行了很大程度的改进，首先是对微生物的处理，本发明采用包埋技术将微生物菌种进行包埋，再与其他原料进行混合使用，可以有效的保证微生物高效持久稳定的对土壤进行修复，在包埋型高活性微生物的制备过程中，选取接种于改良的lb培养基中，进行一个活化培养，本发明所配制的改良lb培养基中添加了一种复合粉，会在菌体培养的过程中，提高菌体的选择性，有利于纯化菌体，并且能够吸附死菌和菌体代谢产物，为菌体的繁殖提供优质的环境，提高菌体的活性，然后对所得的种子液进行摇菌培养，在菌体培养的过程中，进行声波处理，单一的频率的声波对菌液的繁殖有一定的促进作用，申请人在大量的实验中发现，采用频率为13~19khz的声波，能够极大的改善伯克霍尔德氏菌的生长特性，进一步提伯克霍尔德氏菌的活性，为后续的操作奠定很好的基础，将得到的菌粉进行包埋，包埋后的菌体不受土著微生物竞争、酸碱度、温度、氧气、营养成分等诸多环境因素的影响和制约，适用于各种污染性质的土壤，改变污染物在土壤中的存在形态或同土壤的结合方式，降低其在环境中的可迁移性与生物可利用性，降低土壤中有害物质的浓度。在原料中还添加有腐殖酸、活性炭、煤灰、沸石，辅料中含有的na、k、ca等矿质元素以碳酸盐或氧化物的形式存在，有助于改善土壤性质，并且辅料赋予修复剂以孔洞结构，能吸附土壤或沉积物中的无机离子等，降低土壤养分流失，提高土壤养分利用率，这种孔洞结构为微生物提供了良好的栖息环境，有利于微生物的生长，促进植物对营养元素的吸收，进一步提高微生物的修复效果，在成品的制备中，进行了微波活化，提高各原料成分之间的相容性，形成性能稳定的成品。本发明相比现有技术具有以下优点：本发明最终制备的微生物土壤修复剂，适用于各种污染性质的土壤，能够持久有效的降解污染物，降低其在环境中的可迁移性与生物可利用性，改良土壤肥力，提高作物的产量和品质，极具市场推广应用价值。具体实施方式实施例1一种高活性微生物土壤修复剂的制备方法，包括如下步骤：（1）包埋型高活性微生物的制备：a.将伯克霍尔德氏菌cgmccno：6269接种到改良lb液体培养基中，经活化培养得种子液；b.取5μl种子液接种到200ml改良lb液体培养基中，经摇菌培养得伯克霍尔德氏菌菌液，在摇菌培养的同时进行特定频率的声波处理；c.先将操作b中所得的伯克霍尔德氏菌菌液置于离心机中进行离心，收集沉淀风干至含水率3%后得菌粉备用；d.将瓜尔胶和寡糖按照重量比为2；0.7共同投入到摩尔浓度为3mol/l的三（羟甲基）氨基甲烷溶液中，不断搅拌直至瓜尔胶和寡糖完全溶解；e.先将操作c所得的菌粉和操作d所得的溶液按照重量比为0.8；2共同投入搅拌罐内，以150rpm的转速搅拌混匀后，用一次性滴管吸取溶液，然后滴入到质量分数为10%的氯化钙溶液中，形成凝胶球后放入6℃的环境中，低温放置1h后取出凝胶球，再用去离子水反复冲洗去除未包埋的伯克霍尔德氏菌，滤干即得包埋型高活性微生物；（2）原料称取：称取相应重量份的步骤（1）所得的包埋型高活性微生物34份、腐殖酸23份、活性炭16份、煤灰12份、沸石6份备用；（3）成品制备：将步骤（2）中称取的所有原料投入搅拌罐内，以700rpm的转速进行搅拌，搅拌的同时进行特定频率的微波活化处理，搅拌处理1h即可。进一步的，所述步骤（1）操作a或操作b中改良lb液体培养基的制备，包括如下步骤：1）称取相应重量份的胰蛋白胨7份、酵母提取物3份、氯化钠3份、复合粉3份、纯化水120份备用；2）先将步骤（1）称取的纯化水置于玻璃烧杯中，利用磁力搅拌器进行搅拌，同时进行加热，然后等到纯化水中的温度升至70℃时，将步骤1）中称取的胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、复合粉依次加入烧杯中，边搅拌边加入，再继续加热保持混合液中的温度为95℃，保持95℃搅拌处理20min后停止加热；3）将步骤2）所得的混合液置于高温高压灭菌锅内进行灭菌处理，灭菌温度为118℃，灭菌的时间为23min，取出冷却至室温即可。进一步的，所述步骤1）中复合粉的制备方法是将碳酸铈和纳米碳管按照重量比2.3；0.7共同浸入改性液中进行浸泡，浸泡时保持改性液中的温度为70℃，改性的同时用频率为45khz的超声波进行处理，50min后取出离心得滤渣备用；所述改性液中各成分及其对应重量份为：10份甘油、7份氨水、0.4份甲基丙烯酸甲酯、4份硅烷偶联剂、2份硫酸铵、70份无菌水。进一步的，所述步骤（1）操作a中伯克霍尔德氏菌的接种量为每1ml改良lb液体培养基中接种1μl伯克霍尔德氏菌菌种。进一步的，所述步骤（1）操作a中种子液的od600值为0.3。进一步的，所述步骤（1）操作b中伯克霍尔德氏菌菌液的od600值为0.9。进一步的，所述步骤（1）操作b中声波处理时声波的频率为13khz。进一步的，所述步骤（1）操作c中离心机的转速为5000rpm。进一步的，所述步骤（3）中微波活化处理时微波的频率控制为20ghz。实施例2一种高活性微生物土壤修复剂的制备方法，包括如下步骤：（1）包埋型高活性微生物的制备：a.将伯克霍尔德氏菌cgmccno：6269接种到改良lb液体培养基中，经活化培养得种子液；b.取7.5μl种子液接种到300ml改良lb液体培养基中，经摇菌培养得伯克霍尔德氏菌菌液，在摇菌培养的同时进行特定频率的声波处理；c.先将操作b中所得的伯克霍尔德氏菌菌液置于离心机中进行离心，收集沉淀风干至含水率5%后得菌粉备用；d.将瓜尔胶和寡糖按照重量比为2.5；0.8共同投入到摩尔浓度为6mol/l的三（羟甲基）氨基甲烷溶液中，不断搅拌直至瓜尔胶和寡糖完全溶解；e.先将操作c所得的菌粉和操作d所得的溶液按照重量比为0.9；2.5共同投入搅拌罐内，以165rpm的转速搅拌混匀后，用一次性滴管吸取溶液，然后滴入到质量分数为11%的氯化钙溶液中，形成凝胶球后放入8℃的环境中，低温放置1.25h后取出凝胶球，再用去离子水反复冲洗去除未包埋的伯克霍尔德氏菌，滤干即得包埋型高活性微生物；（2）原料称取：称取相应重量份的步骤（1）所得的包埋型高活性微生物38份、腐殖酸25份、活性炭18份、煤灰14份、沸石7.5份备用；（3）成品制备：将步骤（2）中称取的所有原料投入搅拌罐内，以800rpm的转速进行搅拌，搅拌的同时进行特定频率的微波活化处理，搅拌处理1.5h即可。进一步的，所述步骤（1）操作a或操作b中改良lb液体培养基的制备，包括如下步骤：1）称取相应重量份的胰蛋白胨8份、酵母提取物4份、氯化钠4份、复合粉3.5份、纯化水140份备用；2）先将步骤（1）称取的纯化水置于玻璃烧杯中，利用磁力搅拌器进行搅拌，同时进行加热，然后等到纯化水中的温度升至75℃时，将步骤1）中称取的胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、复合粉依次加入烧杯中，边搅拌边加入，再继续加热保持混合液中的温度为97℃，保持97℃搅拌处理25min后停止加热；3）将步骤2）所得的混合液置于高温高压灭菌锅内进行灭菌处理，灭菌温度为121℃，灭菌的时间为26min，取出冷却至室温即可。进一步的，所述步骤1）中复合粉的制备方法是将碳酸铈和纳米碳管按照重量比2.5；0.8共同浸入改性液中进行浸泡，浸泡时保持改性液中的温度为75℃，改性的同时用频率为50khz的超声波进行处理，60min后取出离心得滤渣备用；所述改性液中各成分及其对应重量份为：15份甘油、8份氨水、0.5份甲基丙烯酸甲酯、4.5份硅烷偶联剂、3份硫酸铵、75份无菌水。进一步的，所述步骤（1）操作a中伯克霍尔德氏菌的接种量为每2ml改良lb液体培养基中接种2μl伯克霍尔德氏菌菌种。进一步的，所述步骤（1）操作a中种子液的od600值为0.5。进一步的，所述步骤（1）操作b中伯克霍尔德氏菌菌液的od600值为1.1。进一步的，所述步骤（1）操作b中声波处理时声波的频率为16khz。进一步的，所述步骤（1）操作c中离心机的转速为6500rpm。进一步的，所述步骤（3）中微波活化处理时微波的频率控制为25ghz。实施例3一种高活性微生物土壤修复剂的制备方法，包括如下步骤：（1）包埋型高活性微生物的制备：a.将伯克霍尔德氏菌cgmccno：6269接种到改良lb液体培养基中，经活化培养得种子液；b.取10μl种子液接种到400ml改良lb液体培养基中，经摇菌培养得伯克霍尔德氏菌菌液，在摇菌培养的同时进行特定频率的声波处理；c.先将操作b中所得的伯克霍尔德氏菌菌液置于离心机中进行离心，收集沉淀风干至含水率7%后得菌粉备用；d.将瓜尔胶和寡糖按照重量比为3；0.9共同投入到摩尔浓度为9mol/l的三（羟甲基）氨基甲烷溶液中，不断搅拌直至瓜尔胶和寡糖完全溶解；e.先将操作c所得的菌粉和操作d所得的溶液按照重量比为1；3共同投入搅拌罐内，以180rpm的转速搅拌混匀后，用一次性滴管吸取溶液，然后滴入到质量分数为12%的氯化钙溶液中，形成凝胶球后放入10℃的环境中，低温放置1.5h后取出凝胶球，再用去离子水反复冲洗去除未包埋的伯克霍尔德氏菌，滤干即得包埋型高活性微生物；（2）原料称取：称取相应重量份的步骤（1）所得的包埋型高活性微生物42份、腐殖酸27份、活性炭20份、煤灰16份、沸石9份备用；（3）成品制备：将步骤（2）中称取的所有原料投入搅拌罐内，以900rpm的转速进行搅拌，搅拌的同时进行特定频率的微波活化处理，搅拌处理2h即可。进一步的，所述步骤（1）操作a或操作b中改良lb液体培养基的制备，包括如下步骤：1）称取相应重量份的胰蛋白胨9份、酵母提取物5份、氯化钠5份、复合粉4份、纯化水160份备用；2）先将步骤（1）称取的纯化水置于玻璃烧杯中，利用磁力搅拌器进行搅拌，同时进行加热，然后等到纯化水中的温度升至80℃时，将步骤1）中称取的胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、复合粉依次加入烧杯中，边搅拌边加入，再继续加热保持混合液中的温度为99℃，保持99℃搅拌处理30min后停止加热；3）将步骤2）所得的混合液置于高温高压灭菌锅内进行灭菌处理，灭菌温度为124℃，灭菌的时间为29min，取出冷却至室温即可。进一步的，所述步骤1）中复合粉的制备方法是将碳酸铈和纳米碳管按照重量比2.7；0.9共同浸入改性液中进行浸泡，浸泡时保持改性液中的温度为80℃，改性的同时用频率为55khz的超声波进行处理，70min后取出离心得滤渣备用；所述改性液中各成分及其对应重量份为：20份甘油、9份氨水、0.6份甲基丙烯酸甲酯、5份硅烷偶联剂、4份硫酸铵、80份无菌水。进一步的，所述步骤（1）操作a中伯克霍尔德氏菌的接种量为每3ml改良lb液体培养基中接种3μl伯克霍尔德氏菌菌种。进一步的，所述步骤（1）操作a中种子液的od600值为0.7。进一步的，所述步骤（1）操作b中伯克霍尔德氏菌菌液的od600值为1.3。进一步的，所述步骤（1）操作b中声波处理时声波的频率为19khz。进一步的，所述步骤（1）操作c中离心机的转速为8000rpm。进一步的，所述步骤（3）中微波活化处理时微波的频率控制为30ghz。对比实施例1本对比实施例1与实施例2相比，用等质量份的市售的普通的lb液体培养基取代步骤（1）中操作a和操作b中的改良lb液体培养基，除此外的方法步骤均相同。对比实施例2本对比实施例2与实施例2相比，省去步骤（1）中操作b中的超声波处理，除此外的方法步骤均相同。对比实施例3本对比实施例3与实施例2相比，省去步骤（1）中操作d和操作e的整个操作过程，除此外的方法步骤均相同。对比实施例4本对比实施例4与实施例2相比，省去步骤（2）中的腐殖酸、活性炭、煤灰、沸石，除此外的方法步骤均相同。对比实施例5本对比实施例5与实施例2相比，省去步骤（3）中的微波活化处理，除此外的方法步骤均相同。对照组1申请号为201410210911.7公开的微生物土壤修复剂的制备方法。对照组2申请号为201810557707.0公开的盐碱土壤修复微生物菌剂及其制备方法。为了对比本发明效果，选取辽宁省葫芦岛渤海湾盐碱地土壤作为试验地，土壤性质：ph9.54，含盐量17.5‰，有机质含量7.35g/kg，益生菌含量5.6×105cfu/g。首先将选取的试验地随机划分成等面积的8块，然后分别用实施例、对比实施例1、对比实施例2、对比实施例3、对比实施例4、对比实施例5的方法制备高活性微生物土壤修复剂，对照组1的方法制备的微生物土壤修复剂，以及对照组2的方法制备的盐碱土壤修复微生物菌剂修复对应的土壤，修复30天后测定每组土壤的理化性质。具体实验对比数据如下表1所示：表1ph值含盐量（‰）有机质含量（g/kg）益生菌含量（cfu/g）实施例27.135.612.684.8×1010对比实施例17.458.910.424.3×109对比实施例27.215.712.464.4×1010对比实施例38.4514.610.952.1×109对比实施例47.377.411.356.8×109对比实施例57.256.311.644.1×1010对照组18.6315.58.533.2×109对照组27.347.213.233.7×1010由上表1可以看出，本发明最终制备的微生物土壤修复剂能够显著改善盐碱土壤的理化性质，适用于各种污染性质的土壤，能够持久有效的降解污染物，降低其在环境中的可迁移性与生物可利用性。为了进一步对比本发明效果，以含有重金属（以镉为例）和有机污染物（以芘为例）污染的土壤作为大白菜种植试验田，供试土壤性质：可提取态镉的含量为0.08mg/kg，芘的含量为154.78mg/kg。将试验田共分为9个处理组，分别为实施例2、对比实施例1、对比实施例2、对比实施例3、对比实施例4、对比实施例5、对照组1、对照组2、空白对照组，每个处理组白菜种植方法相同，均采用条播方式种植，每亩用种量200g，供试品种为津绿80，分别用实施例2、对比实施例1、对比实施例2、对比实施例3、对比实施例4、对比实施例5的方法制备高活性微生物土壤修复剂，对照组1的方法制备的微生物土壤修复剂，以及对照组2的方法制备的盐碱土壤修复微生物菌剂修复对应的土壤，修复方法相同。其中空白对照组不进行任何处理，等到蔬菜成熟统计蔬菜的亩产量，并检测土壤的理化性质。具体实验对比数据如下表2所示：表2产量（t/亩）可提取态镉的去除率（%）芘的去除率（%）实施例26.671.498.6对比实施例14.652.465.7对比实施例26.270.796.6对比实施例33.545.564.6对比实施例44.364.887.7对比实施例56.468.693.6对照组14.253.568.6对照组23.446.353.7空白对照组1.912.356.3由上表2可以看出，本发明最终制备的微生物土壤修复剂，适用于各种污染性质的土壤，能够持久有效的降解污染物，降低其在环境中的可迁移性与生物可利用性，改良土壤肥力，提高作物的产量和品质，极具市场推广应用价值。当前第1页12