紫金龙中原阿片碱Protopine单体的提取富集工艺及其应用的制作方法

本发明涉及一种紫金龙中原阿片碱protopine单体的提取富集工艺及其应用，属于中药技术领域。

背景技术：

紫金龙，dactylicapnosscandens(d.don)hutch.，为紫金龙属植物紫金龙的干燥根。秋季采收。切片晒干。紫金龙味苦、性凉，有镇痛、止血、消炎、降压之功效，曾被《中国药典》1977年版收载。药理学实验证实生物碱是其具有镇痛等药理作用的主要活性成分，其中紫堇定、异紫堇定、原阿片碱和青藤碱等异喹啉类生物碱是其中的主要成分。

紫金龙中紫堇定、异紫堇定的含量较高，均大于1%，而紫金龙中原阿片碱的含量约占0.1%，原阿片碱，protopine，是一种化学物质，分子式为c20h19o5n，分子量为353.37。原阿片碱具有镇痛、抑制血小板聚集、松驰平滑肌、抗心律失常、抗肿瘤、抗肝损伤等作用，同时还有较强的抗胆碱酯酶（抗ache）活性和对心血管的显著作用。

经临床研究发现，紫金龙主要有效活性成分为原阿片碱，从目前文献报道可知，现有原阿片碱的合成方法产率较低，一些合成路线成本较高，不适于大量原阿片碱的获取，因此，对原阿片碱进行提取富集工艺研究是有必要而且非常重要的。

目前原阿片碱的提取富集方法一般通过对延胡索药材采取醇提来获取，研究发现延胡索总碱提取的最佳工艺为：乙醇浓度50%，乙醇用量7倍，超声提取45min。该提取工艺操作简单，重复性好。而延胡索中含有延胡索乙素和原阿片碱，延胡索乙素的含量约为0.06%，原阿片碱含量约为0.03%，并且延胡索乙素的极性略大于原阿片碱，二者之间存在分离困难的问题。另外，由于醇提液在浓缩过程中冷凝出来的溶液并非相应比例的醇溶液，故醇回收液每次使用均需调节醇浓度，存在操作麻烦，成本高，溶剂耗费量大的问题。综上所述，目前原阿片碱无规范的制备工艺流程，生产周期长，试剂浪费严重且难以保证原阿片碱的得率和纯度，从而极大地限制了原阿片碱在医药方面的应用。通过文献调研尚未见从紫金龙中提取分离高纯度原阿片碱的报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，提供一种紫金龙中原阿片碱protopine单体的提取富集工艺，该工艺过程稳定、环境友好、简便易行，分离制得了纯度≥80%的原阿片碱，极大提高了紫金龙的药用利用价值；进一步地，本发明提供一种紫金龙中原阿片碱protopine单体的提取富集工艺，该法可有效地将紫堇定、异紫堇定与原阿片碱分离，制得纯度≥95%的原阿片碱，原阿片碱纯度高，得率＞55%。本发明还提供一种紫金龙中原阿片碱protopine单体在止咳平喘制剂、镇痛制剂、抗心律失常制剂或抗肿瘤制剂中的应用，极大地丰富了原阿片碱在医药方面的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

紫金龙中原阿片碱protopine单体的提取富集工艺，包括如下步骤：取适量紫金龙药材干品，粉碎，放于提取罐中，加入相当于紫金龙药材干品重量10~20倍量的水溶液，搅拌并浸渍过夜，次日弃去浸渍液，在药渣中加入相当于紫金龙药材干品重量8~13倍量的9~10%的酸水溶液，热回流提取2~5次，每次提取时间为1~3h，提取温度为70~80℃，合并酸水提取液，浓缩至提取浓缩液的密度为1.08~1.15时，停止浓缩，过滤，滤液中加入阳离子交换树脂吸附总生物碱，吸附次数为至少2次，每次吸附时阳离子交换树脂的加入量相当于紫金龙药材干品的1/20~1/10，每次至少吸附0.5h，磁力搅拌吸附，搅拌速率为300~500rpm，合并吸附后的阳离子交换树脂，水洗抽滤以去除表面杂质并使水洗流出液呈中性后，将阳离子交换树脂转移至烧杯中，加入相当于阳离子交换树脂干重20~50倍量的10~30%的碳酸钠水溶液，超声提取3~4次，超声提取温度控制在50~70℃，超声频率为20~40khz，每次超声时间不少于40min，合并超声提取液，过滤后滤液经反渗透膜浓缩，当浓缩至药液体积为阳离子交换树脂干重的0.5~1倍量后，停止浓缩，浓缩液加强碱调节ph至10~11，0℃冷藏至少5h后，离心，弃去上清液，离心沉淀水洗至中性后干燥，得原阿片碱粗品a，将阿片碱粗品a用相当于阿片碱粗品a重量的15~20倍量的氯仿搅拌溶解至少30min，然后过滤，滤液干燥，得阿片碱粗品b，将原阿片碱粗品b用氯仿和异丙醇的复合溶剂溶解，氯仿和异丙醇的体积比为1：（1~3），复合溶剂的加入量相当于原阿片碱粗品b的4~5倍量，溶解后，过滤，滤液中逐滴加入纯乙醇，边加边搅拌，纯乙醇的加入量相当于原阿片碱粗品b的10~15倍量，滴加完毕后，放于0~5℃冰箱冷藏过夜，次日取出，抽滤析出晶体，纯乙醇抽洗去除表面杂质，然后干燥，得原阿片碱protopine单体，其纯度不低于80%。

优选地，紫金龙药材干品的粉碎粒度为100~200目。

优选地，酸水溶液包括醋酸水溶液。

优选地，阳离子交换树脂为强酸型阳离子交换树脂。

进一步优选地，强酸型阳离子交换树脂包括731、732、d001、d002、d006中的任意一种。

优选地，阿片碱粗品b在复合溶剂的溶解方法为采用超声溶解，超声溶解温度高于60℃，超声频率为5~10khz。

优选地，强碱包括naoh或者koh。

优选地，将纯度不低于80%原阿片碱protopine单体用相当于原阿片碱protopine单体重量的1~2倍量的乙醇浸润后，加入ods吸附剂拌样，ods吸附剂的加入量相当于原阿片碱protopine单体的1~1.5倍量，放于40~50℃烘箱烘干后，粉碎，得ods拌样样品并装柱，柱填料为空白ods吸附剂，空白ods吸附剂的装柱量相当于ods拌样样品的2~4倍量，柱子的径高比为1：（4~5），装柱后，利用氯仿：异丙醇：甲醇=1：（2~2.5）：（1~1.5）洗脱5~8个柱体积，洗脱液浓缩至原阿片碱protopine单体重量的7~10倍量后，-20~-10℃冰箱冷藏8~10h，析出结晶，过滤，结晶干燥，得精制原阿片碱protopine单体，其纯度不低于95%。

紫金龙中原阿片碱protopine单体在止咳平喘制剂、镇痛制剂、抗心律失常制剂或抗肿瘤制剂中的应用。

本发明的有益效果是：

1.本发明的工艺适合紫金龙中原阿片碱的提取富集纯化，并且原阿片碱纯度高达80%以上，进一步精制后可达95%以上，整个工艺的操作步骤简单易行，收率高，成本低。

2.本发明工艺过程稳定，大量使用的试剂均安全无毒，全程采用的溶剂毒性较低，对环境友好，无环境污染，适合大批量工业生产。

3.本发明首次采用复合溶剂对原阿片碱进行重结晶，并采用ods填料对原阿片碱进行进一步的精制，可有效去除紫金龙中的微量杂质成分紫堇定、异紫堇定等，大大提高原阿片碱纯度，整个工艺可操作性强，重现性强，为以后紫金龙中原阿片碱大规模工业化生产提供技术参数。

附图说明

图1为本发明中原阿片碱的标准曲线图；

图2为本发明中精制原阿片碱protopine单体的色谱图。

具体实施方式

下面对本发明作更进一步的说明。

实施例1：

1.仪器和试剂：圆底烧瓶；冷凝管；烧杯；抽滤漏斗；小型玻璃色谱柱（径高比为1：4），恒温磁力搅拌器（df-101s，巩义市予华仪器有限责任公司）；分析天平（梅特勒-托利多）；旋转蒸发仪（re-52aa，上海亚荣生化仪器厂）；超声仪（ds-8510dt，上海生析超声仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（hh-4，常州国华电器有限公司）；反渗透膜组件及装置（bw30-365，美国陶氏膜公司）；高效液相色谱仪（岛津）；冰箱（bcd-206stpq，海尔）；甲醇；乙醇；异丙醇；三氯甲烷；碳酸钠；醋酸；氢氧化钠；氢氧化钾；所用试剂均为分析纯；731阳离子交换树脂（上海开平树脂有限公司）；ods填料（ymc公司）；原阿片碱标准品（购自中国食品药品检定研究院）。

2.色谱条件

色谱柱：shimadzuvp-ods(150×4.6mm，5μm)；流动相为0.6%冰乙酸水溶液（含0.06%三乙胺）-乙腈（81∶19）；检测波长280nm；流速：1ml/min；柱温35℃。

3.原阿片碱对照品溶液的配制：精密称取对照品原阿片碱5mg置100ml容量瓶中，加氯仿溶解，稀释至刻度，摇匀，即得，其中每ml含原阿片碱0.05mg。

4.标准曲线的绘制：

线性关系考察：精密吸取原阿片碱对照品溶液（0.05mg/ml）5、10、15、20、25μl，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积y为纵坐标，以进样量x（μg）为横坐标，进行回归分析，得回归方程y=1214.1x-6.697，r²=0.9997，如图1所示，表明原阿片碱在0.25~1.25μg间线性关系良好。

5.紫金龙药材的含量测量：取紫金龙药材干品粉末（过250目筛）约1g，精密称定，为1.0091g，置50ml具塞三角瓶中，加1ml的9%醋酸水溶液浸润，再加入氯仿20ml，封闭，超声2h，滤过，挥干氯仿，残渣加甲醇溶解定容于10ml容量瓶中，得紫金龙药材供试品溶液。

取紫金龙药材供试品溶液5μl，注入高效液相色谱仪，检测，得紫金龙药材干品中原阿片碱的百分含量为0.1318%。

紫金龙中原阿片碱protopine单体的提取富集工艺，包括如下步骤：取1kg紫金龙药材dactylicapnosscandens(d.don)hutch.干品，粉碎至100目左右，放于圆底烧瓶中，加入10l纯水，搅拌并浸渍过夜，次日弃去浸渍液，在药渣中加入8l的9%醋酸水溶液，热回流提取2次，每次提取时间为1h，提取温度为70℃，合并醋酸水提取液，浓缩至提取浓缩液的密度为1.08左右时，停止浓缩，过滤，滤液中加入731阳离子交换树脂吸附总生物碱，吸附次数为2次，每次吸附时731阳离子交换树脂的加入量为50g，每次吸附0.5h，磁力搅拌吸附，搅拌速率为300rpm，合并吸附后的731阳离子交换树脂，水洗抽滤以去除731阳离子交换树脂表面杂质并使水洗流出液呈中性后，将731阳离子交换树脂转移至烧杯中，加入2l的10%碳酸钠水溶液，超声提取3次，超声提取温度控制在50℃，超声频率为20khz，每次超声时间为40min，合并超声提取液，过滤后滤液经反渗透膜浓缩，当浓缩至药液体积为50ml左右后，停止浓缩，浓缩液加naoh强碱调节ph至10，0℃冷藏5h后，离心，弃去上清液，离心沉淀水洗至中性后干燥，得原阿片碱粗品a，称重，其重量为2.57g，将阿片碱粗品a用38ml氯仿搅拌溶解30min，然后过滤，滤液干燥，得阿片碱粗品b，称重，原阿片碱粗品b的重量为2.04g，将原阿片碱粗品b用氯仿和异丙醇的复合溶剂溶解，复合溶剂的加入量为8~9ml，氯仿和异丙醇的体积比为1：1，溶解后，过滤，阿片碱粗品b在复合溶剂的溶解方法为采用超声溶解，超声溶解温度为65℃，超声频率为5khz，滤液中逐滴加入纯乙醇，边加边搅拌，纯乙醇的加入量为10ml，滴加完毕后，放于0~5℃冰箱冷藏过夜，次日取出，抽滤析出晶体，纯乙醇抽洗去除表面杂质，然后干燥，得原阿片碱protopine单体1.53g，其纯度为86.14%。将纯度为86.14%的原阿片碱protopine单体用1.5ml乙醇浸润后，加入1.5g的ods吸附剂拌样，拌样后放于40℃烘箱烘干，粉碎，得ods拌样样品并装柱，柱填料为6g空白ods吸附剂，柱子的径高比为1：4，装柱后，利用氯仿：异丙醇：甲醇=1：2：1洗脱5个柱体积，洗脱液浓缩至10ml左右，于-20℃冰箱冷藏8h，析出结晶，过滤，结晶干燥，得精制原阿片碱protopine单体0.76g，如图2所示，其纯度为98.64%，得率为57%。

紫金龙中原阿片碱protopine单体在止咳平喘制剂、镇痛制剂、抗心律失常制剂或抗肿瘤制剂中的应用。

实施例2：

紫金龙中原阿片碱protopine单体的提取富集工艺，包括如下步骤：取1kg实施例1所用的紫金龙药材干品，粉碎，粉碎粒度为200目左右，粉碎后的紫金龙药材放于圆底烧瓶中，加入20l纯水溶液，搅拌并浸渍过夜，次日弃去浸渍液，在药渣中加入13l的10%的醋酸水溶液，热回流提取5次，每次提取时间为3h，提取温度为80℃，合并醋酸水提取液，浓缩至提取浓缩液的密度为1.15左右时，停止浓缩，过滤，滤液中加入d001阳离子交换树脂吸附总生物碱，吸附次数为3次，每次吸附时d001阳离子交换树脂的加入量为100g，每次吸附1h，磁力搅拌吸附，搅拌速率为500rpm，合并吸附后的d001阳离子交换树脂，水洗抽滤以去除d001阳离子交换树脂表面杂质并使水洗流出液呈中性后，将d001阳离子交换树脂转移至烧杯中，加入15l的30%的碳酸钠水溶液，超声提取4次，超声提取温度控制在70℃，超声频率为40khz，每次超声时间为60min，合并超声提取液，过滤后滤液经反渗透膜浓缩，当浓缩至药液体积为300ml后，停止浓缩，浓缩液加koh强碱调节ph至11，0℃冷藏7h后，离心，弃去上清液，离心沉淀水洗至中性后干燥，得原阿片碱粗品a，称重，原阿片碱粗品a的重量为3.04g，将阿片碱粗品a用60ml氯仿搅拌溶解70min，然后过滤，滤液干燥，得阿片碱粗品b，称重，原阿片碱粗品b的重量为2.75g，将原阿片碱粗品b用氯仿和异丙醇的复合溶剂溶解，氯仿和异丙醇的体积比为1：3，复合溶剂的用量为11~12ml，溶解后，过滤，阿片碱粗品b在复合溶剂的溶解方法为采用超声溶解，超声溶解温度为80℃，超声频率为10khz，滤液中逐滴加入40ml纯乙醇，边加边搅拌，滴加完毕后，放于5℃冰箱冷藏过夜，次日取出，抽滤析出晶体，纯乙醇抽洗去除表面杂质，然后干燥，得原阿片碱protopine单体1.64g，其纯度为80.37%。将纯度为80.37%原阿片碱protopine单体用3.5ml乙醇浸润后，加入2.5g的ods吸附剂拌样，然后放于50℃烘箱烘干后，粉碎，得ods拌样样品并装柱，柱填料为16g空白ods吸附剂，柱子的径高比为1：5，装柱后，利用氯仿：异丙醇：甲醇=1：2.5：1.5洗脱8个柱体积，洗脱液浓缩至16ml后，于-10℃冰箱冷藏10h，析出结晶，过滤，结晶干燥，得精制原阿片碱protopine单体0.83g，其纯度为96.05%，得率为60%。

紫金龙中原阿片碱protopine单体在止咳平喘制剂、镇痛制剂、抗心律失常制剂或抗肿瘤制剂中的应用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。