叶酸类稳定复合物及其制备方法与流程

本发明属于有机中间体合成领域，具体涉及叶酸类稳定复合物及其制备方法。

背景技术：

众所周知，叶酸可预防胎儿神经管畸形，但准确地说，叶酸须在人体内经过一系列复杂代谢转变成(6s)-5-甲基四氢叶酸才能发挥作用。(6s)-5-甲基四氢叶酸分子中含有1个-nh2、4个-nh-、2个＝n-及2个-cooh，化学名称为(6s)-n-[4-[2-氨基-4-羟基-5,6,7,8-四氢-5-甲基-6-蝶啶基]甲氨基]苯甲酰基]-l-谷氨酸，简称为(6s)-5-甲基四氢叶酸、l-5-甲基四氢叶酸，cas：31690-09-2，是叶酸类药物中最具生物活性和功能的形式、参与甲基化过程以及dna合成，可直接被人体利用，是人体血浆和细胞内游离叶酸唯一存在形式，也是唯一可穿透血脑屏障的叶酸类药物，可用作食品添加剂和药物，临床用于预防新生儿神经管缺陷、重度抑郁、防治阿尔茨海默病、治疗和预防巨幼红细胞性贫血及风湿性关节炎，治疗重度抑郁和重度阿尔茨海默病，另外，国家卫生计生委2017年第13号公告6s-5-甲基四氢叶酸钙作为食品营养强化剂。5-甲酰四氢叶酸，cas号:58-05-9，是抗肿瘤药甲氨蝶呤的解毒剂。

人体自身不能合成叶酸，只能从体外富含叶酸的食物如大豆、菠菜等或外界直接摄取的叶酸经叶酸还原酶的还原和vb12的催化下还原为一碳单位(如甲基)载体的四氢叶酸，随后甲基化形成(6s)-5-甲基四氢叶酸等四氢叶酸衍生物，其中(6s)-5-甲基四氢叶酸是叶酸在体内主要的活性代谢产物，参与了多项生化过程，作为甲基供体参与核苷酸的合成及影响dna的生物合成。人体中，叶酸缺乏或某些药物抑制叶酸还原酶，叶酸转化为四氢叶酸将减少，女性怀孕四氢叶酸需求量增高，这些人群体内已有四氢叶酸不能传递足够量一碳单位满足合成嘌呤核苷酸和胸腺嘧啶核苷酸所需，因此，须从体外及时补充(6s)-5-甲基四氢叶酸。化学合成获得的5-甲基四氢叶酸为(6s)-5-甲基四氢叶酸与(6r)-5-甲基四氢叶酸的外消旋体，其中，(6r)构型无生化活性，摄入人体后由肾脏排出^[7]，而(6s)构型是叶酸的主要自然形式，但无论叶酸、5-甲酰四氢叶酸，还是5-甲基四氢叶酸、(6s)-5-甲基四氢叶酸或其盐均不稳定、极易氧化而降低药效，如(6s)-5-甲基四氢叶酸初级氧化产物5-甲基-二氢叶酸或4-羟基-5-甲基-四氢叶酸对t淋巴细胞增殖具有显著的抑制作用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种叶酸类稳定复合物及其制备方法。

实现本发明目的的技术解决方案是：一种叶酸类稳定复合物及其制备方法，包括如下步骤：氮气保护下，在反应容器中依次加入海藻酸钠、蒸馏水、叶酸类化合物，使其完全溶解成溶液或形成均匀糊状物，用一定管径的滴管或针头吸入后，移至可溶性钙盐水溶液的液面上方一定高度，逐滴加入，钙化1h后，形成微黄色复合物颗粒，减压抽滤、洗涤、真空干燥即的所述的叶酸类稳定复合物。

进一步的，叶酸类化合物包括5-甲基四氢叶酸、(6s)-5-甲基四氢叶酸、5-甲酰基四氢叶酸。

进一步的，可溶性钙盐为氯化钙、葡萄酸钙、酒石酸钙、柠檬酸钙、乳酸钙中任意一种。

进一步的，可溶性钙盐水溶液的质量分数为1％～7％，海藻酸钠与可溶性钙盐质量比为1:4～1:8。

进一步的，海藻酸钠、叶酸类化合物及蒸馏水的质量比为1:4:45～1:8:41。

进一步的，氮气保护下，在25-35℃下，在反应容器中依次加入海藻酸钠、蒸馏水、叶酸类化合物，搅拌或超声波使其完全溶解成溶液或形成均匀糊状物。

进一步的，滴管的管径为1.0mm-2.5mm。

进一步的，滴管距离液面的高度为7-10cm。

与现有技术相比，本发明以海藻酸钠与叶酸类化合物为原料，滴加到可溶性钙盐水溶液中获得在室温、光照、氧气下稳定的(6s)-5-甲基四氢叶酸-海藻酸钠-葡萄酸钙复合物，使得(6s)-5-甲基四氢叶酸固定于复合物的体型网状结构中而与外界氧气及水隔绝，以解决(6s)-5-甲基四氢叶酸在运输和保存过程中不稳定的问题。

附图说明

图1为叶酸类化合物-海藻酸钠-氯化钙复合物制备过程示意图。

图2为5-甲酰四氢叶酸复合物(a)实物图、(6s)-5-甲基四氢叶酸复合物实物图(b)及叶酸类化合物-海藻酸钠-钙盐结构示意图。

图3为5-甲酰四氢叶酸-海藻酸钙-氯化钙复合物的ir对比谱。

图4为5-甲酰四氢叶酸的hplc谱。

图5为5-甲酰四氢叶酸-海藻酸钠-氯化钙hplc谱。

图6为(6s)-5-甲基四氢叶酸-海藻酸钠-葡萄糖酸钙复合物的ir对比谱。

图7为(6s)-5-甲基四氢叶酸hplc谱。

图8为(6s)-5-甲基四氢叶酸-海藻酸钠-葡萄糖酸钙复合物的hplc谱。

具体实施方式

天然高分子化合物海藻酸钠是一种从海带中提取的天然多糖碳水化合物，无毒，具备药物制剂辅料的稳定性、溶解性、成膜性、粘性和安全性，具浓缩溶液、形成凝胶和成膜性，可降低血脂肪、血糖、胆固醇及作食品增稠剂。海藻酸钠分子式为(c6h7o6na)n，是β-d-甘露糖醛酸(m单元)与α-l-古洛糖醛酸(g单元)借助β-1,4-糖苷键连接且由不同比例的gm、mm和gg片段组成的共聚物，分子中含有多个-oh和-cooh。

葡萄糖酸钙分子式为(c5h11o5coo)2ca，作为补钙药物，可促进骨髓、牙齿钙化、维护神经肌肉正常兴奋性、降低毛细血管通透性，还能治疗高钾血症、高镁血症。

5-甲酰四氢叶酸、(6s)-5-甲基四氢叶酸及海藻酸钠结构式如下所示。

本发明以海藻酸钠分子中-cooh、-oh上含孤对电子的o原子作配原子、以钙盐中ca²⁺(ii)为中心离子，形成配位数为4的配合物，再与叶酸类化合物分子中-nh2、-nh-、＝n-及-cooh以氢键等分子间作用力结合而交联成网状结构，从而形成稳定的叶酸类化合物-海藻酸钠-钙盐复合物，使叶酸类化合物在一定程度上隔绝氧气、光照和湿度的影响，有效防止其降解，提高了其对光照、湿度、氧气的化学稳定性，适于工业化生产。叶酸类化合物-海藻酸钠-钙盐复合物，不仅使叶酸类化合物包裹于体型网状结构，与外界氧气、水隔离而提高叶酸类化合物稳定性，而且，复合物中的钙元素可补充人体所必需，同时，海藻酸钠与叶酸类化合物通过氢键结合有望达到药效彼此增强的协同作用。

叶酸类化合物-海藻酸钠-钙盐复合物中叶酸类化合物含量的测定方法如下：

方法一：用hplc测定制备复合物过滤后的滤液及复合物洗涤液中叶酸类化合物的含量，以求得制备复合物过程中叶酸类化合物的损失量，再根据叶酸类化合物的投入量及烘干后复合物的质量，计算得复合物中叶酸类化合物的含量，公式如formula1。

方法二：将烘干后的复合物在研钵中碾碎后加入到乙腈：水(含2％hac)＝1:9的混合液中，超声溶解，用针管吸出，过膜后进行hplc测试，面积归一法，叶酸类化合物-海藻酸钙-钙盐复合物中叶酸类化合物的含量。

hplc(c18色谱柱)测定条件：

(1)5-甲酰四氢叶酸测试条件：进样量10μl，检测波长280nm，流动相为乙腈：水(含2％hac)＝1:9，流速1ml/min，柱温30℃，5-甲酰四氢叶酸的出峰停留时间为2.1min。

(2)(6s)-5-甲基四氢叶酸测试条件：进样量10μl，检测波长254nm，流动相为nah2po4-na2hpo4缓冲液(ph＝6.3):乙腈＝90:10，检测波长254nm，柱温40℃，(6s)-5-甲基四氢叶酸的出峰保留时间为3.0min。

一、制备过程

实例1

250ml三口烧瓶用氮气置换内部空气3次，氮气保护依次加入海藻酸钠0.5g

(0.0023mol)、3g(0.0063mol)5-甲酰四氢叶酸及96.5g蒸馏水，边加热边搅拌使其形成均匀糊状物后，静置除去气泡，用针管径为2.5mm的滴管吸入(针管内液体不可有气泡)，滴管移至100g质量分数为2％氯化钙水溶液的液面上方7.0cm处，逐滴加入氯化钙水溶液中立即形成微黄色的颗粒，钙化1.0h后，滤液回收套用，用ph＝10的nh4cl-nh3·h2o作缓冲溶液、铬黑t为指示剂，用edta标准溶液滴定滤液中ca²⁺，用hplc测定滤液中5-甲酰四氢叶酸含量，无水乙醇洗涤3次，hplc测定洗涤液中5-甲酰四氢叶酸含量，干燥，得类球型5-甲酰四氢叶酸-海藻酸钠-氯化钙复合物，平均粒径d＝2.36mm/粒，颗粒平均质量4.86mg/粒，复合物中5-甲酰四氢叶酸含量为68.6％。5-甲酰四氢叶酸-海藻酸钠-氯化钙复合物的制备过程图示见图1。

实例2

250ml三口烧瓶用氮气置换内部空气3次，氮气保护依次加入海藻酸钠1g(0.0046mol)、5g(0.0105mol)5-甲酰四氢叶酸及94g蒸馏水，边加热边搅拌使其形成均匀糊状物后，静置除去气泡，用针管径为1.0mm的滴管吸入(针管内液体不可有气泡)，滴管移至100g质量分数为1％氯化钙水溶液的液面上方9.0cm处，逐滴加入葡萄酸钙水溶液中立即形成微黄色的颗粒，钙化1.0h后，回收滤液，hplc测定滤液中5-甲酰四氢叶酸，留存循环套用，用无水乙醇洗涤3次，干燥，得类球型5-甲酰四氢叶酸-海藻酸钠-氯化钙复合物，平均粒径d＝1.12mm/粒，颗粒平均质量0.66mg/粒，复合物中5-甲酰四氢叶酸含量为69.8％。

实例3

250ml三口烧瓶用氮气置换内部空气3次，氮气保护依次加入海藻酸钠0.4g

(0.00184mol)、2.4g(0.00504mol)5-甲酰四氢叶酸及97.2g蒸馏水，边加热边搅拌使其形成均匀糊状物后，静置除去气泡，用针管径为1.2mm的滴管吸入(针管内液体不可有气泡)，滴管移至100g浓度为3％葡萄酸酸钙水溶液的液面上方8.0cm处，逐滴加入葡萄酸钙水溶液中立即形成微黄色的颗粒，钙化1.0h后，回收滤液，hplc测定滤液中5-甲酰四氢叶酸，留存循环套用，用无水乙醇洗涤3次，干燥，得类球型5-甲酰四氢叶酸-海藻酸钠-氯化钙复合物，平均粒径d＝2.91mm/粒，颗粒平均质量55.81mg/粒，复合物中5-甲酰四氢叶酸含量为70.1％。

实例4

250ml三口烧瓶用氮气置换内部空气3次，氮气保护下，加入海藻酸钠2.0g、8.0g(6s)-5-甲基四氢叶酸及90g蒸馏水，边加热边搅拌使其形成均匀糊状物后，用内径为1.2mm的滴管吸入(滴管内液体不可有气泡)，滴管移至100g质量分数为2％葡萄酸钙水溶液液面上方8.0cm处，逐滴加入葡萄酸钙水溶液中立即形成微黄色的颗粒，钙化1.0h后，回收滤液，循环套用，复合物用无水乙醇洗涤3次，干燥，得类球型(6s)-5-甲基四氢叶酸-海藻酸钠-葡萄酸钙复合物，平均粒径d＝2.38mm/粒，颗粒平均质量5mg/粒，复合物中(6s)-5-甲基四氢叶酸含量为64.7％。(6s)-5-甲基四氢叶酸-海藻酸钠-氯化钙复合物的制备过程图示见图1。

实例5：

250ml三口烧瓶用氮气置换内部空气3次，氮气保护依次加入海藻酸钠2.0g、10.0g(6s)-5-甲基四氢叶酸及88g蒸馏水，边加热边搅拌使其形成均匀糊状物后，用针管径为1.0mm的滴管吸入，针管不可有气泡，滴管移至100g浓度为1％葡萄酸酸钙水溶液的液面上方9.0cm处，逐滴加入葡萄酸钙水溶液中立即形成微黄色的颗粒，钙化1.0h后，回收滤液，hplc测定滤液中(6s)-5-甲基四氢叶酸，留存循环套用，用无水乙醇洗涤3次，干燥，得类球型(6s)-5-甲基四氢叶酸-海藻酸钠-葡萄酸钙复合物，平均粒径d＝1.11mm/粒，颗粒平均质量0.64mg/粒，(6s)-5-甲基四氢叶酸量为70.0％。

实例6：

250ml三口烧瓶用氮气置换内部空气3次，氮气保护依次加入海藻酸钠0.6g、3.6g(6s)-5-甲基四氢叶酸及25.8g蒸馏水，边加热边搅拌使其形成均匀糊状物后，用管径为2.5mm的滴管吸入，滴管不可有气泡，移至30g浓度为3％葡萄酸钙水溶液的液面上方7.0cm处，逐滴加入，立即形成微黄色颗粒，钙化1.0h后，回收滤液，hplc测定未包封的(6s)-5-甲基四氢叶酸，留存循环套用，用无水乙醇洗涤3次，干燥，得类球状颗粒(6s)-5-甲基四氢叶酸-海藻酸钠-葡萄酸钙复合物，平均粒径d＝2.93mm/粒，颗粒平均质量55.89mg/粒，hplc测定复合物(6s)-5-甲基四氢叶酸含量为70.3％。

实例1-3所述的5-甲酰四氢叶酸稳定复合物即5-甲酰四氢叶酸-海藻酸钠-氯化钙复合物，其复合物实物图如图2a所示。实例4-6所述的(6s)-5-甲基四氢叶酸稳定复合物即(6s)-5-甲基四氢叶酸-海藻酸钠-葡萄酸钙复合物，其复合物实物图如图2b所示。叶酸类化合物-海藻酸钠-钙盐复合物结构示意如图2c所示。

二、测试及其表征

15-甲酰四氢叶酸-海藻酸钠-氯化钙复合物表征

ir，σmax/cm^-1：3420cm^-1(芳杂环n-h、羧基o-h伸缩振动)，2851cm^-1(醛基c-h伸缩振动)，1677cm^-1(酰胺键c＝o伸缩振动)；1586cm^-1、1531cm^-1、1452cm^-1(苯环、吡嗪环等杂环骨架伸缩振动)；1388cm^-1(羧基c-o面外弯曲振动)；1038cm^-1(苯环1,4-取代c-h面内弯曲振动)，776cm^-1(ch2平面摇摆振动)，5-甲酰四氢叶酸-海藻酸钙氯化钙复合物的特征吸收峰与5-甲酰四氢叶酸的特征吸收峰基本吻合。ir如图3所示。

从图4、图5的hplc谱图可见，5-甲酰四氢叶酸出峰液相色谱保留时间为2.121min，相同测试条件下，5-甲酰四氢叶酸-海藻酸钠-氯化钙复合物的液相色谱保留时间为2.119min。

2(6s)-5-甲基四氢叶酸-海藻酸钙-葡萄糖酸钙复合物的稳定性

根据药典对(6s)-5-甲基四氢叶酸-海藻酸钠-葡萄糖酸钙复合物进行了稳定性实验，主要考察光照、温度、湿度、氧气等因素对该复合物中(6s)-5-甲基四氢叶酸含量的影响。

2.1光照的影响

将(6s)-5-甲基四氢叶酸-海藻酸钠-葡萄糖酸钙复合物放置在自然光以及避光下进行试验，放置24h、48h、72h、96h后，对该复合物中(6s)-5-甲基四氢叶酸的含量进行测定，结果如表1。

表1光照对复合物中(6s)-5-甲基四氢叶酸含量的影响

从表1中所看到，当该复合物在光照的条件下进行实验时，(6s)-5-甲基四氢叶酸的含量随着光照时间的延长而呈下降趋势，避光条件其有效含量基本维持不变。这可能是因为(6s)-5-甲基四氢叶酸本身对光较敏感，遇光较为不稳定，造成(6s)-5-甲基四氢叶酸含量的急剧下降，所以，该复合物需避光保存。

2.2温度的影响

将(6s)-5-甲基四氢叶酸-海藻酸钙-葡萄糖酸钙复合物避光放置在室温25℃、40℃、60℃下分别静置24h、48h、72h、96h进行试验，测定该复合物中(6s)-5-甲基四氢叶酸的含量，结果如下表2。

表2温度对复合物中含量的影响

从上述表2中得出结果当温度超过25℃时，该复合物中(6s)-5-甲基四氢叶酸的有效含量呈下降趋势。可能的原因是温度过高，使其复合物结构中的水分失去，使其结构招到破坏，致使(6s)-5-甲基四氢叶酸与空气接触，从而使得该复合物中(6s)-5-甲基四氢叶酸的有效含量下降。所以，该复合物适合于低温时保存。

2.3湿度的影响

将(6s)-5-甲基四氢叶酸-海藻酸钙-葡萄糖酸钙复合物放置于干燥皿中，干燥皿中放置饱和的nacl溶液于不同相对湿度的环境下进行实验，放置24h、48h、72h、96h后，对该复合物中(6s)-5-甲基四氢叶酸含量的进行测定，结果如表3所示。

表3湿度对复合物中(6s)-5-甲基四氢叶酸含量的影响

从表3中可以看出，随着时间的延长，在不同相对湿度环境下的该复合物中(6s)-5-甲基四氢叶酸的含量基本维持不变，由此表明，湿度不影响该复合物中(6s)-5-甲基四氢叶酸的有效含量。

2.4氧气的影响

将6s)-5-甲基四氢叶酸-海藻酸钙-葡萄糖酸钙复合物分两批置于相对湿度60％，25℃惰性气体环境和氧气环境下24小时后对比氧气对(6s)-5-甲基四氢叶酸的有效含量的影响。结果如表4所示。

表4氧气对复合物中(6s)-5-甲基四氢叶酸海藻酸含量的影响

表4所示，两批分别置于氧气环境下和氮气环境下的复合物，在有效含量上基本维持不变，结果表明该复合物的稳定性不受氧气制约。

通过对温度、光照、湿度、氧气考察的最优结果，对此特分别制备了3批(6s)-5-甲基四氢叶酸-海藻酸钙-葡萄糖酸钙复合物避光放置在室温25℃下静置1个月进行试验其稳定性。用高效液相色谱对复合物中(6s)-5-甲基四氢叶酸含量的测定、复合物的性状，结果如表5所示。

表5(6s)-5-甲基四氢叶酸-海藻酸钙-葡萄糖酸复合物的稳定性

注：a为复合物中(6s)-5-甲基四氢叶酸的含量

b为复合物中(6s)-5-甲基四氢叶酸的含量随着时间变化的减少量

综上所述，(6s)-5-甲基四氢叶酸-海藻酸钙-葡萄糖酸钙复合物的稳定性不受氧气的影响，而温度高于25℃、光照72h后(6s)-5-甲基四氢叶酸海藻酸钙复合物中(6s)-5-甲基四氢叶酸的含量会下降，性状由饱满变成扁平状。

从图6可以看出，3386cm^-1是羧酸(-cooh)中o-h伸缩振动峰；2964cm^-1是-ch3中的c-h伸缩振动峰；1606cm^-1为酰胺键中c＝o伸缩振动峰；1427cm^-1是5位上的甲基与氮原子相连时的弯曲振动的特征吸收峰；1315cm^-1c-h基团面内伸缩振动；1048cm^-1为苯环面外伸缩振动；756cm^-1为ch2平面摇摆振动。(6s)-5-甲基四氢叶酸-海藻酸钠-葡萄糖酸钙复合物中的特征吸收峰基本与(6s)-5-甲基四氢叶酸的特征吸收峰基本相吻合。

(6s)-5-甲基四氢叶酸-海藻酸钠-葡萄糖酸钙复合物研磨碾碎，加蒸馏水超声溶解，利用hplc谱确认该复合物中(6s)-5-甲基四氢叶酸的出峰时间和含量。从图7可知，(6s)-5-甲基四氢叶酸的出峰时间为3.072min。

图8为(6s)-5-甲基四氢叶酸-海藻酸钠-葡萄糖酸钙复合物的hplc谱，该复合物的出峰时间为3.061min，两图出峰时间基本吻合。