博落回二氢苯并菲啶氧化酶基因优化序列及其应用的制作方法

本发明涉及一种博落回二氢苯并菲啶氧化酶基因优化序列及其应用，属于基因工程与生物工程技术领域。

技术背景

药用植物是我国传统医学中具有防病治病的疗效而作为药物来源的植物，在我国医学中具有非常重要的地位。许多药用植物的有效成分就是它的次生代谢产物，由于其独特的疗效以及毒副作用小等特点引起了广泛关注。我国野生药用植物资源种类丰富，但是由于近年来自然环境的破坏加上对药用植物供不应求而致使的过度开采和滥用，导致我国的药用植物资源濒临枯竭。野生资源已经不能满足人们的需求，而人工栽培中又存在活性成分减少以及品种退化的问题，所以利用生物技术来调控药用植物的次生代谢能够有效的改善植物的代谢途径、提高植物的抗病性、抗逆性、其有效成分含量、药物的药效、产量以及品质，对于优化药用植物种质资源以及可持续发展具有重要的意义。

博落回(macleayacordata(willd.)r.br.)属于罂粟科博落回属植物，别名又叫号筒杆、落回、山号筒、山梧桐、三钱三等，生长于丘陵、低山、林边、草地、路旁，是一种野生草本植物。博落回主要分布于中国、东亚、北美洲和欧洲。博落回属植物包括博落回和小果博落回(m.microcarpa(maxim)fedde)两个种，作为一种传统中草药最早见于《本草拾遗》，在民间作为一种杀蛆青草药而广泛使用。随着研究的不断深入，发现博落回具有抑菌、抗炎、调节畜禽类肠道菌群等多重药理作用，博落回开始作为一种药源植物得到越来越广泛的应用。

国内外许多有关博落回化学成分的研究表明，博落回属植物的化学成分中，生物碱是最主要的次生代谢产物，其中主要包括了原阿片碱、血根碱、白屈菜红碱、小檗碱、别隐品碱、黄连碱、二氢血根碱、二氢白屈菜红碱等等。这些生物碱都具备各种用途以及多种药理作用，属于异喹啉类生物碱。研究表明，其中最主要的血根碱、白屈菜红碱以及小檗碱具有广谱抑菌的作用。另外，博落回中还有一些其他的物质如糖类、三萜化合物、甾体、挥发油、黄酮及其苷、氨基酸、蛋白质等等。因此博落回不仅具有较高的生态以及药用价值，而且具备较高的经济效益，近年来作为饲料添加剂收到广泛的关注，博落回的需求量逐年增长。然而，随着野生资源的不断开采，使得博落回资源的野生储备量逐年递减。

生物转化(biotransformation)也叫生物催化(biocatalysis)，是指利用微生物全细胞或提取酶作为催化剂对外源底物进行结构修饰或定向合成而获得有价值产物的生理生化反应，其本质是生物体系中酶的催化反应。这种特定的酶催化反应具有以下特点：(1)具有高度的立体选择性。(2)反应条件温和，生产安全，不造成环境污染和后处理简单。(3)目标明确，副产物少，成本低。(4)微生物转化可以减少反应步骤。生物转化体系中以微生物转化体系应用得最为广泛。微生物分布广泛，种类繁多，易培养，周期短，在生长过程中产生丰富的酶系，利用微生物及其产生的酶进行生物转化可以生成许多有价值的化合物，且微生物的酶系所催化的反应很多是传统化学合成很难进行的反应。随着微生物的基因操作方法日渐成熟，利用现代分子生物学的手段，不仅能提高生物转化的转化率，而且能将几种不同的基因构建于同一个工程菌中，能同时进行几步转化反应，给微生物转化带来更美好的前景。

近年来，国内外对于血根碱生物合成途径的研究有过很多报道。罂粟，唐松草(thalictrumaquilegifolium)，黄唐松草(thalictrumflavum)，拟南芥，日本黄连(coptisjaponica)和花菱草等植物中都有血根碱生源合成途径的相关功能酶基因。来自不同物种的功能基因异源表达效果不一样。d.smolke团队比较了花菱草、蓟罂粟(a.mexicana)和罂粟的华紫堇碱合酶(cheilanthifolinesynthase,cfs)基因与拟南芥、花菱草、罂粟以及酵母的cpr基因的表达情况，得出花菱草的cfs基因与拟南芥的cpr基因在酵母中有最好的表达效果，催化产生最高浓度的华紫堇碱。而迄今为止，未有学者对不同物种的p6h基因表达情况有所报道。

而如何提高外源基因的异源表达高效性是微生物合成研究中的一个亟待解决的重要问题。影响外源基因在酵母表达系统中高效表达的因素有很多，其中酵母对密码子的偏爱性，目的基因的密码子序列对产物的表达量有很大影响。在编码氨基酸的所有61个密码子中有25个是酵母所偏爱的，含有酵母本身所偏爱密码子的基因在酵母中往往有较高的表达。通过优化基因的密码子序列，可以提高宿主细胞内trna的丰度，同时也有利于翻译的二级结构的形成，从而使得产物表达量有所提高。

本发明拟提供一种博落回二氢苯并菲啶氧化酶(dbox)基因进行密码子优化后的基因优化序列及其在制备血根碱中的应用。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种博落回二氢苯并菲啶氧化酶(dbox)基因优化序列及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种博落回二氢苯并菲啶氧化酶(dbox)基因优化序列，所述优化序列为对二氢苯并菲啶氧化酶(dbox)基因mc6408进行密码子优化后得到，记为mc6408opt，其包含如seqidno.1所示的核苷酸序列；mc6408包含如seqidno.3所示的核苷酸序列。

进一步地，

所述优化序列mc6408opt表达的氨基酸包含如seqidno.2所示的氨基酸序列。

本发明还提供一种含有上述博落回普罗托品-6-羟基化酶(p6h)基因优化序列mc6408opt的重组表达载体。

进一步地，所述重组表达载体的质粒选自pyes2。

本发明还提供一种含有上述博落回二氢苯并菲啶氧化酶(dbox)基因优化序列mc6408opt或上述重组表达载体的酵母工程菌株。

进一步地，

所述酵母工程菌株的宿主菌选自酵母菌株ivf。

进一步地，

本发明还提供上述博落回二氢苯并菲啶氧化酶(dbox)基因优化序列mc6408opt、上述重组表达载体或上述酵母工程菌在制备血根碱中的应用。

本发明还提供一种采用上述博落回二氢苯并菲啶氧化酶(dbox)基因优化序列mc6408opt、上述重组表达载体或上述酵母工程菌制备血根碱的方法，具体包括如下步骤：

(1)将上述含有博落回二氢苯并菲啶氧化酶(dbox)基因优化序列mc6408opt与辅酶基因构建到表达载体pyes2上，然后转入酵母工程菌中，获得含有二氢苯并菲啶氧化酶(dbox)基因优化序列mc6408opt的重组表达载体的酵母工程菌株；

(2)以ph＝8.0的te缓冲溶液作为前体溶液，加入10μmol/l～2mmol/l原阿片碱作为底物，前体饲喂步骤(1)构建的酵母工程菌；温度30°下，发酵培养24小时；

(3)收集培养后的酵母工程菌，裂解菌体、分离纯化，即得。

本发明的有益效果：

本发明将博落回中参与合成血根碱与白屈菜红碱的功能基因mc6408，根据酵母菌偏爱的密码子，进行密码子优化后，然后将得到的优化序列mc6408opt，整合到酿酒酵母中进行异源表达实现血根碱与白屈菜红碱的微生物转化，与未经优化的功能基因相比，能极大提高其酶催化效率，提高催化产物二氢血根碱及血根碱的含量，降低血根碱的生产成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为博落回中血根碱和白屈菜红碱的合成途径；

图2为密码子优化前后的功能基因mc6408、mc6408opt的催化效率比较图。

具体实施方式

为了更好地阐述该发明的内容，下面通过具体实施例对本发明进一步的验证。特在此说明，实施例只是为更直接地描述本发明，它们只是本发明的一部分，不能对本发明构成任何限制。

如附图1所示的博落回中血根碱和白屈菜红碱的合成途径，二氢苯并菲啶氧化酶(dbox)基因参与了血根碱(san)和白屈菜红碱(che)生物合成的步骤，其能催化二氢白屈菜红碱(dhche)生成白屈菜红碱(che)以及催化二氢血根碱(dhsan)生成血根碱(san)。二氢苯并菲啶氧化酶(dbox)属于黄素蛋白氧化酶基因。

在本申请人之前的研究中，以其他物种(罂粟、花菱草)已公开在ncbi的合成血根碱与白屈菜红碱的黄素蛋白氧化酶相关基因序列为参照基因，在博落回denovo全基因组序列中进行blast比对，找到2个同源性较高的基因序列(编号为mc6407、mc6408，参照专利：

cn106047904a，博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的黄素蛋白氧化酶基因及其应用)，并进行了酵母异源表达验证。

本发明对其中一个基因序列mc6408(其核苷酸序列如seqidno.3所示)，根据酿酒酵母偏爱的密码子，进行密码子优化后，得到基因优化序列mc6408opt，其核苷酸序列、氨基酸序列分别如seqidno.1、seqidno.2所示。

根据图1博落回中血根碱和白屈菜红碱生物合成途径图，二氢苯并菲啶氧化酶(dbox)既可以催化二氢白屈菜红碱(dhche)生成白屈菜红碱(che)又可以催化二氢血根碱(dhsan)生成血根碱(san)，为了研究的方便、不重复，本发明实施例加入原阿片碱标准品作为前体物质同时加入普罗托品-6-羟基化酶(p6h)基因mc11229基因序列(其核苷酸序列如seqidno.6所示)以及辅酶基因cucpr(其核苷酸序列、氨基酸序列分别如seqidno.4、seqidno.5所示)来研究优化后的二氢苯并菲啶氧化酶(dbox)基因序列mc6408opt的相关性能。由于cpr基因是p450基因在氧化底物中的一个辅酶基因，加入cpr有利于提高氧化反应效率。

基于已知的血根碱和白屈菜红碱生物合成途径，以直接前体物质二氢白屈菜红碱(dhche)或二氢血根碱(dhsan)作为前体物质研究优化后的二氢苯并菲啶氧化酶(dbox)基因序列mc6408opt的酶催化效率也是可行的。

1、引物设计

根据infusion引物的设计原则设计各基因的引物，由上海生物工程股份有限公司合成，引物序列见下表1：

表1pcr引物序列与产物长度

2、博落回cdna的制备：用多糖多酚植物总rna提取试剂盒提取博落回总rna，并使用反转录试剂盒将其反转录为cdna。

3、提取载体质粒

取3支经高压灭菌后的10ml离心管，分别加入5ml含100mg/lamp的lb液体培养基，再分别加入200μl标签为pyes2-ura、pyes2-leu和pyes2-trp的大肠杆菌菌液，放于台式恒温振荡仪中37℃，200rpm过夜培养。按质粒提取试剂盒说明书提取质粒测定含量。

4、基因克隆

mc6408opt、mc6408基因的扩增：以博落回cdna为模板，分别选用mc6408opt-trp-f、mc6408opt-trp–r；mcmc6408-trp-f、mcmc6408-trp–r；mc11229-ura-f、mc11229-ura-r；cucpr-leu-f、cucpr-leu-r引物(引物序列见上表1)进行pcr扩增。pcr反应体系如下表2：

表2基因克隆pcr反应体系

轻轻混匀，短暂离心5sec。扩增条件：98℃预变性30sec，98℃10sec，58℃30sec，72℃2min(30个循环)，72℃2min，4℃保持。扩增完成后，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，目的条带用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收，并测定含量。

5、制备线性载体

取3支经高压灭菌后的10ml离心管，分别加入5ml含100mg/lamp的lb液体培养基，再分别加入200μl标签为pyes2-ura、pyes2-leu和pyes2-trp的大肠杆菌菌液，放于台式恒温振荡仪中37℃，200rpm过夜培养。按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒测定含量。

用限制性内切酶kpni-hf、xbal/sph-hf将载体质粒pyes2-ura、pyes2-leu、pyes2-trp回收产物分别进行双酶切，反应体系如下表3～表5：

表3载体质粒pyes2-ura双酶切反应体系

表4载体质粒pyes2-leu双酶切反应体系

表5载体质粒pyes2-trp双酶切反应体系

置于37℃反应30min，反应完成后在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测并测定含量。

6、构建表达载体

进入以下网站：

http://www.clontech.com/us/support/xxclt_onlinetoolsload.jsp？citemid＝http://bioinfo.clontech.com/infusion/molarratio.do&section＝16260&xxheight＝750，根据载体和目的基因的片段大小，计算出载体和基因所需的浓度。再根据上述所测得的基因和载体的含量，计算出相应的体积，加入infusion酶充分混匀后，置于50℃反应20min。再将连接产物转入大肠杆菌感受态dh5α，涂板于含100mg/lamp的lb筛选平板上，37℃倒置培养过夜。

7、构建重组质粒

将基因序列mc6408opt构建到表达载体上，并以优化前的基因序列mc6408为参照，按照同样的方法构建重组表达载体，获得重组质粒pyes2-trp+mc6408、pyes2-trp+mc6408opt，同时构建重组质粒pyes2-leu+cucpr、pyes2-ura+mc11229；

以pyes2-detect-f、pyes2-detect-r为上下引物对上述重组质粒pcr扩增，pcr反应体系如下表6：

表6重组质粒pcr扩增反应体系

扩增条件：94℃预变性5min，94℃30sec，58℃30sec，72℃2min，(35个循环)，72℃5min，4℃保持。经测序确认没有突变。

9、构建重组酵母菌并进行酵母工程菌发酵培养

将重组表达载体pyes2-ura+mc6408、pyes2-his+mc6408opt分别与pyes2-leu+cucpr转入酵母(ivf，购自thermofisherscientific公司)中，获得酵母工程菌株mcy-3084(pyes2+mc11229+cucpr+mc6408)、mcy-3085(pyes2+mc11229+cucpr+mc6408opt)，同时还将pyes2-trp质粒单独转入酵母(ivf)菌株中，获得酵母工程菌株mcy-3060，作为空白对照；然后再分别在组氨酸(his)与leu双缺陷以及trp、leu与ura三缺陷的sd/dropout选择培养基上培养48h，得到直径约lmm的单菌落。

以ph＝8.0的te缓冲溶液作为前体溶液，加入10μmol/l～2mmol/l原阿片碱作为底物，前体饲喂酵母工程菌；温度30°下发酵培养24小时。

10、样品的制备：收集培养后的酵母工程菌，裂解菌体、用甲醇抽提化合物，即得样品。

11、将制备好的样品用uplc-q-tof进行检测，结果如下表1和图2所示。

本发明以mcy-3060作为空白对照，在相同条件下饲喂原阿片碱后未产生二氢血根碱和血根碱，证明酵母本身不会对实验产生影响。mcy-3084、mcy-3085均检测到了血根碱，含量结果经spss19.0软件分析，p＜0.05，样品之间差异显著，实验结果具有统计学意义。具体结果见表7：

表7优化前后的基因血根碱含量测定结果

上表:7的结果以及附图2表明，工程菌mc11229+cucpr+mc6408opt催化产生的血根碱含量比mc11229+cucpr+mc6408高，优化后的基因mc6408opt相比优化前的基因mc6408使得催化产物的含量得到了提高。具体地，优化后的mc11229+cucpr+mc6408opt酵母工程菌使得血根碱的含量从51.770ng﹒ml-1提高到了56.361ng﹒ml-1，提高了8.9％。

以上所述为本发明的具体实施方式，但不能对本发明构成任何限制，因此需特别指出，凡是以本发明为基础，做出的任何修改与改进均落在本发明保护范围之内。

序列说明：seqidno.1、seqidno.2分别为mc6408opt的核苷酸序列和氨基酸序列；seqidno.3为mc6408的核苷酸序列；

seqidno.4、seqidno.5分别为cucpr的核苷酸序列和氨基酸序列；

seqidno.6为mc11229的核苷酸序列；

seqidno.7-16分别为引物mc6408opt-trp-f、mc6408opt-trp-r、mc6408-trp-f、mc6408-trp-r、pyes2-detect-f、pyes2-detect-r、cucpr-leu-f、cucpr-leu-r、mc11229-ura-f、mc11229-ura-r的核苷酸序列。

sequencelisting

<110>湖南美可达生物资源股份有限公司

<120>博落回二氢苯并菲啶氧化酶基因优化序列及其应用

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