一株有效吸附氯氰菊酯的乳酸片球菌的制作方法

本发明涉及利用微生物进行环境或食品中污染物减除的领域，具体涉及一株从四川传统家庭自制泡菜中分离筛选出的对氯氰菊酯具有较高吸附能力的乳酸片球菌。

背景技术：

拟除虫菊酯类农药是一类人工合成的高效低毒仿生型杀虫剂，主要用于果蔬、棉花、茶叶、谷物等作物及家庭中多种害虫的防治。氯氰菊酯(cypermethrin，cy)是常用的拟除虫菊酯农药之一，对光、热稳定，自然降解速率慢，常温下稳定期可达两年以上。氯氰菊酯会对鱼、虾、蟹、贝、家蚕、蜜蜂等非靶标生物造成极大危害，且对高等哺乳动物的生殖、神经、免疫和血液等方面有不同程度的毒副作用。

目前氯氰菊酯残留问题严重，美国波士顿城市低收入公共住房的室内灰尘和空气中氯氰菊酯的检出率为24%；果蔬及其制品、茶叶、中草药、食用菌、水产品中多有氯氰菊酯检出；2006年到2009年间，厦门共有18.7%的果蔬样品中检出氯氰菊酯；多途径的暴露使得氯氰菊酯残留问题受到越来越多的重视。

微生物吸附法是利用其本身的化学结构特性来吸附有毒有害物质的生物处理方法。因其种类繁多、来源广泛、绿色、高效、经济等优点，受到了学者的广泛关注。目前有少数学者对微生物吸附有机磷杀虫剂和除草剂进行了研究，涉及的微生物有芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、大肠杆菌等，但未见有乳酸菌用于拟除虫菊酯类农药吸附的相关报道。乳酸菌作为一种广泛存在于发酵食品和人体肠道中的益生菌，具有许多生理功能。近年来，研究表明乳酸菌对真菌毒素、重金属、苯并芘、塑化剂等有毒有害物质均有较好的吸附能力。乳酸菌作为食品级微生物，有望成为具有吸附氯氰菊酯能力的功能菌，用于去除环境、食品中残留的氯氰菊酯，或用于开发药品及保健品。因此，有必要筛选获得吸附拟除虫菊酯类农药乳酸菌并用于农药的减除。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明目的在于提供一株可有效吸附氯氰菊酯的乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)d15及其应用。

本发明所提供的菌株为乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)菌株号d15，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏号为cgmccno.16133，保藏日期为2018年07月19日。

本发明提供吸附菌株的分离、筛选、鉴定。

取泡菜样品按1:10的比例于无菌均质袋中匀浆，取1ml匀浆用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，取适宜稀释度样液100ml涂布于含caco3的mrs培养基平板，37℃培养24~48h。挑取有溶钙圈的具有乳酸菌典型菌落特征的菌落进行多次平板划线纯化，保存备用。

将上述获得的乳酸菌进行高效吸附氯氰菊酯菌株的体外筛选，取斜面菌种一环接入5ml的mrs液体培养基中，于37℃培养16~24h，然后按2%接种量于37℃进行扩培20~24h。将菌液于8000r/min、4℃离心10min，弃去上清液，收集菌体，用无菌水洗涤离心2次并重悬，调整菌体浓度为1.0×10¹⁰cfu/ml。

取1ml上述菌悬液于8000r/min、4℃离心10min，弃去上清液，加入1ml浓度为10mg/l的cy溶液，混匀。将混合液于37℃振荡培养12h，12000r/min离心15min，取上清液用高效液相色谱法(hplc)测定cy浓度，以不含乳酸菌细胞的10mg/lcy溶液作为空白对照，计算吸附率。

所述hplc检测方法为：agilent1260-lc液相色谱仪，反相岛津inertsustainc18色谱柱规格为内径×长度=4.6mm×250mm、粒径=5μm，乙腈:超纯水=85:15为流动相，流速为1.0ml/min，柱温为25℃，进样量为10μl，检测器为二极管阵列检测器，检测波长210nm。

cy吸附率的计算公式为：

式中：c0为空白对照中cy的浓度(mg/l)；c为吸附体系中吸附后cy残留的浓度(mg/l)。

菌株形态鉴定：肉眼观察菌落形态为圆形，凸起，边缘整齐，表面湿润的乳白色菌落，在含caco3的mrs平板上形成溶钙圈。与光学显微镜下观察菌株细胞特征，其细胞呈球状，革兰氏染色阳性。对照《伯杰氏细菌鉴定手册》进行生理生化鉴定，接触酶、氧化酶、明胶液化试验、硝酸盐还原试验、硫化氢产生试验等为阴性，能利用多种碳水化合物产酸，在45℃能生长、能水解精氨酸。初步判定菌株d15为乳酸片球菌。

菌株d15分子遗传学鉴定。

菌株d15经16srdna序列测定，获得如下序列：

gggggcgtgctataatgcagtcgaacgaacttccgttaattgatcatgaggtgcttgcactgaatgagattttaacacgaagtgagtggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccagaagcaggggataacacctggaaacagatgctaataccgtataacagagaaaaccgcctggttttcttttaaaagatggctctgctatcacttctggatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgatgatgcgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaagctctgttgttaaagaagaacgtgggtgagagcaactgttcacccagtgacggtatttaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggtcttttaagtctaatgtgaaagccttcggctcaaccgaagaagtgcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgattactaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgcattaagtaatccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaagaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttctgccaacctaagagattaggcgttcccttcggggacagaatgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattactagttgccagcattcagttgggcactctagtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggacgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagtcgcgaaaccgcgaggtttagctaatctcttaaaaccattctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagccggtggggtaacc

该菌株的16srdna基因测序结果与genbank数据库中序列进行blast同源性对比，该菌株序列与pediococcusacidilactici菌株基因序列高度同源，得到登录号为kf364634，结合形态学和生理生化指标，最终将菌株d15鉴定为乳酸片球菌。

本发明所提供的高效吸附cy的菌株是从四川传统家庭自制泡菜中分离筛选得到的，该菌株在一定温度和ph范围内均对cy有很好的吸附能力，吸附速度快，且灭活菌体同样具有cy吸附能力。

本发明所用培养基为：mrs培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，磷酸氢二钠2g，柠檬酸氢二钠2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温-802g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，水1000ml，调ph至6.2±0.2，121℃灭菌15min。加入2%琼脂、1%caco3为mrs固体培养基。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：首次从四川传统家庭自制泡菜中筛选获得高效吸附氯氰菊酯的乳酸片球菌，乳酸片球菌是最早被用做人工发酵剂的乳酸菌之一，也是农业部批准使用的益生菌之一，该菌株来源安全，具有吸附快速、操作简单等优点，可为环境和食品中残留氯氰菊酯的脱除提供良好菌源，具有良好的应用潜力。

附图说明

图1为吸附菌株d15的菌落形态和细胞形态图。

图2为培养时间对菌株吸附cy的影响。

图3为培养温度对菌株吸附cy的影响。

图4为ph对菌株吸附cy的影响。

图5为菌体浓度对菌株吸附cy的影响。

图6为cy浓度对菌株吸附cy的影响。

具体实施方式

实例1：菌株d15对cy的吸附特性。

1)培养时间对氯氰菊酯吸附率的影响将细胞浓度为1×10¹⁰cfu/ml的菌株d15与10mg/lcy工作液在37℃下分别振荡培养15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h，测定不同培养时间下菌体对cy的吸附率。同时设置不含菌体的cy工作液为阳性对照，在相同时间点收集样品，用[0011]和[0012]所述方法测定cy吸附率。

2)培养温度对氯氰菊酯吸附率的影响将细胞浓度为1×10¹⁰cfu/ml的菌株d15与10mg/lcy工作液分别在10℃、20℃、30℃、37℃、42℃振荡培养4h。以不同温度下不含菌体的cy工作液为阳性对照，用[0011]和[0012]所述方法测定cy吸附率。

3)ph对氯氰菊酯吸附率的影响将细胞浓度为1×10¹⁰cfu/ml的菌株d15与不同初始ph分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的10mg/lcy工作液在37℃振荡培养4h。以不含菌体的不同初始ph的cy工作液为阳性对照，用[0011]和[0012]所述方法测定cy吸附率。

4)菌体浓度对氯氰菊酯吸附率的影响调整菌体浓度为1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰cfu/ml，与10mg/lcy工作液在37℃下振荡培养4h，以不含菌体的的cy工作液为阳性对照，用[0011]和[0012]所述方法测定cy吸附率。

5)cy浓度对氯氰菊酯吸附率的影响将细胞浓度为1×10¹⁰cfu/ml的菌株d15与浓度分别为5、10、20、50、100mg/l的cy工作液在37℃下振荡培养4h，以不含菌体的cy工作液为阳性对照，用[0011]和[0012]所述方法测定cy吸附率。

菌株d15对cy的吸附特性结果：随着培养时间的延长，菌株d15的吸附率缓慢上升，由15min时的56.46%上升至48h时的78.32%；菌株d15的吸附率在10~20℃范围内无明显变化，在30~42℃范围内随温度升高呈增加的趋势，42℃时达到最大；ph值对cy的吸附率影响不大；在cy浓度一定的条件下，随菌体浓度的增加，吸附率呈上升趋势；cy浓度在5~100mg/l范围内，吸附率随着cy浓度的增大呈现下降的趋势。这一研究结果可为菌株d15应用于环境和食品中残留cy的脱除提供了数据参考。

实例2：cy吸附菌株d15对其他拟除虫菊酯类农药的吸附效果。

将菌株d15悬浮于10mg/l溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯工作液中，以不含乳酸菌细胞的10mg/l上述拟除虫菊酯类农药工作液作为空白对照，37℃振荡培养4h，用[0011]和[0012]所述方法测定cy吸附率。

菌株d15对溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯均有较好的吸附能力，吸附率分别为74.02%、73.47%和73.34%。

实例3：cy吸附菌株d15对黄瓜汁中cy的吸附效果。

黄瓜汁制备：取新鲜市售黄瓜，清洗、切块、按w:v为1:2加入超纯水，打浆，10000r/min离心20min，取上清液加入一定量的cy，使黄瓜汁中的cy终浓度为10mg/l，85℃灭菌15min。

取一定量的菌株d15培养液于121℃下加热灭活20min，离心收集菌体，用无菌水离心清洗沉淀，重悬于cy浓度为10mg/l的黄瓜汁中，使菌体浓度为1×10¹⁰cfu/ml，于37℃振荡处理2h，以不加入菌体的黄瓜汁为空白对照。离心取上清液，用[0011]和[0012]所述方法测定cy吸附率。

采用全自动色差仪对吸附前后的黄瓜汁进行色差测定，根据计算色泽变化，δe越大则表示颜色变化越大。

菌株d15对黄瓜汁中cy的吸附率可达62.69%。经计算，δe小于2，可认为色泽未出现可见变化。说明菌株d15失活菌体可用于黄瓜汁中cy的去除，且不会引起黄瓜汁色泽发生明显变化。

实例4：cy吸附菌株d15对苹果汁中cy的吸附效果。

苹果汁制备：取新鲜市售苹果，清洗、切块、按w:v为1:2加入超纯水，打浆，10000r/min离心20min，取上清液添加柠檬酸、vc至质量浓度为0.2%、0.4%，混匀，再加入一定量的cy，使苹果汁中的cy终浓度为10mg/l，85℃灭菌15min。

取一定量的菌株d15培养液于121℃下加热灭活20min，离心收集菌体，用无菌水离心清洗沉淀，重悬于cy浓度为10mg/l的苹果汁中，使菌体浓度为1×10¹⁰cfu/ml，于37℃振荡处理2h，以不加入菌体的苹果汁为空白对照。离心取上清液，用[0011]和[0012]所述方法测定cy吸附率。

采用全自动色差仪对吸附前后的苹果汁进行色差测定，根据计算色泽变化，δe越大则表示颜色变化越大。

菌株d15对苹果汁中cy的吸附率可达63.40%。经计算，δe小于2，可认为色泽未出现可见变化。说明菌株d15失活菌体可用于苹果汁中cy的去除，且不会引起苹果汁色泽发生明显变化。

以上的实例仅仅是对本发明的实施方式进行描述，而并非对本发明的范围进行限定，对于本领域的技术人员来说，可以对上述说明进行改进或变形，但所有的这些改进或变形均应落入本发明的权利要求确定的保护范围。