一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌及其应用的制作方法

文档序号：17117767发布日期：2019-03-15 23:29阅读：289来源：国知局

本发明属于微生物领域，具体涉及一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌及其应用。

背景技术：

随着生物工程技术的发展，越来越多的微生物发酵的方法应用于化学品、酶蛋白以及药剂的生产。其中，大肠杆菌由于其易于培养，生长迅速，操作简便，成本低、遗传背景清晰且无安全性问题等诸多优点，而成为工业上理想的宿主细胞。工业上实现高密度发酵是利用大肠杆菌发酵生产各类有经济价值化合物的重要前提。利用分子生物学技术使外源基因成功表达是实现目的产物大规模生产的第一步。要想真正实现目的产物的大量生产，必须实现重组菌的大规模培养，也就是高密度发酵技术。高密度发酵是指改变培养方式以及培养条件，提升菌群的生长密度，提高目标产物(氨基酸、代谢产物、蛋白等)的比生产率。高密度发酵技术的实现，不仅可以减少培养体积，缩短发酵周期，还能减少设备投资，降低成本。很多酶蛋白、氨基酸、抗生素等已经通过高密度发酵技术实现了大规模生产。实现菌体的高密度培养对发酵条件提出了较高的要求，影响高密度发酵的因素众多，其中涉及到菌体生长所需的营养物质、发酵中副产物的累积、溶氧、ph、温度、诱导方式及补料策略等。工业上，为了发酵得到高密度菌体，必须合理控制好各个影响因素。在工业上广泛使用的工程菌，比如大肠杆菌bw25113，jm109，bl21(de3)在lb中补加碳源葡糖糖培养条件下，细胞密度od600在5.0左右，远远不能满足高密度发酵的需要，通过生物反应器进行高密度发酵需要准确的营养、ph调节、通氧量控制等手段才能做到。

技术实现要素：

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种埃希氏菌属大肠杆菌种escherichiacolis17-3及其应用。旨在解决现有埃希氏菌属大肠杆菌密度低的问题。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种埃希氏菌属大肠杆菌种escherichiacolis17-3，其保藏号为：cctcc2018200。

escherichiacolis17-3为实验室保藏的模式大肠杆菌菌种escherichiacolis17-1的突变菌株，菌株s17-3已于2018年4月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为cctcc2018200。

本发明分离的埃希氏菌属大肠杆菌种escherichiacolis17-3，此菌为两端钝圆的短杆菌，大小约0.5um-3um，具有乳白色且表面光滑的圆形菌落，菌落边缘整齐。

经形态学鉴定和16srdna序列比对后的发育树分析，确定该菌株为大肠杆菌，按照国际命名规则：属名+种名+株名对该菌株进行命名，属名、种名、株名分别为埃希氏菌属、大肠杆菌种和s17-3，命名为埃希氏菌属大肠杆菌种escherichiacolis17-3，保藏号为：cctcc2018200。该菌株具有如下优势：在培养基中补加碳源的条件下，外源表达质粒pbhya-cab的条件下，菌的密度远远高于其他已有的大肠杆菌，细菌的密度(od600，600纳米光波时的吸光值)可达到32.0以上，是普通大肠杆菌的最高生长密度的3倍以上。此外，该菌在发酵过程中，各种有机酸等副产物的积累远远低于其他已有的大肠杆菌，使得碳源更多的流向主产物。

进一步地，所述埃希氏菌属大肠杆菌种escherichiacolis17-3的16srdna核苷酸序列如seqidno.14所示。

本发明所述的埃希氏菌属大肠杆菌种escherichiacolis17-3分泌可拉酸。

本发明的第二方面，提供前述埃希氏菌属大肠杆菌种escherichiacolis17-3在发酵领域中的用途。

本发明进一步提供前述埃希氏菌属大肠杆菌种escherichiacolis17-3在重组多肽生产中的用途。

本发明进一步提供前述埃希氏菌属大肠杆菌种escherichiacolis17-3在化学品转化中的用途。

本发明进一步提供前述埃希氏菌属大肠杆菌种escherichiacolis17-3在细胞催化中的用途。

本发明的第三方面提供了一种重组质粒pbhya-cab，所述重组质粒的核苷酸序列如seqidno.11所示。

本发明的第四方面提供了上述质粒的构建方法，所述方法为：

(1)构建pblu片段，所述pblu片段核苷酸序列如seqidno.7所示，

(2)构建pcab片段，所述pcab片段的核苷酸序列如seqidno.10所示

(3)通过overlappcr连接pblu片段和pcab片段；

(4)筛选出核苷酸序列如seqidno.11所示的质粒。

进一步地，所述步骤(1)中pblu片段是采用1p-f，1p-r作为引物，扩增质粒pbcab获得。所述1p-f核苷酸序列如seqidno.5所述，1p-r核苷酸序列如seqidno.6。所述质粒pbcab的核苷酸序列如seqidno.3所示。

进一步地，所述步骤(2)中pcab片段是采用2p-f，2p-r作为引物，扩增质粒petacab获得。所述2p-f核苷酸序列如seqidno.8所述，2p-r核苷酸序列如seqidno.9。所述质粒petacab核苷酸序列如seqidno.4所示。

进一步地，所述质粒petacab是通过采用核苷酸序列如seqidno.1所示的片段和核苷酸序列如seqidno.2所示的片段连接后筛选获得。

本发明的第五方面提供了一种重组埃希氏菌属大肠杆菌种escherichiacoli，所述重组埃希氏菌属大肠杆菌种escherichiacoli的基因组中转染有质粒pbhya-cab。所述质粒pbhya-cab可以通过现有技术的方法转染大肠杆菌种escherichiacoli。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明公开通过实验室筛选获得的一株大肠杆菌，在lb中补加碳源葡糖糖培养条件下，无需额外进行发酵控制，可自然延长大肠杆菌的对数生长期，在过夜培养时间段内，可使细胞密度od600值达到30以上，约是其他大肠杆菌的3倍以上，为实现大肠杆菌经济高效的高密度发酵生产提供了重要的宿主细胞。

本发明菌株保藏信息如下：

菌株名称：escherichiacolis17-3

保藏号为：cctcc2018200；

保藏日期：2018年4月16日；

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

保藏单位简称：cctcc；

保藏单位地址：武汉市武昌珞珈山街道武汉大学生命科学学院。

附图说明

图1a为质粒petacab的结构示意图

图1b为质粒pbhya-cab的结构示意图

图2为四株重组大肠杆菌发酵24h得到细胞密度od600

图3大肠杆菌s17-3/pbhya-cab细胞生长密度od600随时间变化示意图

图4为可拉酸发酵表达的曲线图

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。

实施例1埃希氏菌属大肠杆菌种escherichiacolis17-3的获得及鉴定、保藏

escherichiacolis17-3为世界各地实验室均会使用的模式大肠杆菌escherichiacolis17-1的突变株，该大肠杆菌在发明人的实验室中经历过紫外诱变，以及长时间的培养，紫外诱变及自然的随机突变均有可能造成微生物的性状改变。该菌株由其培养性能的改变，以及后续的基因组测序和比较，均证实已经发生了多个基因位点的突变，并于2018年4月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为cctcc2018200。

本发明分离的埃希氏菌属大肠杆菌种escherichiacolis17-3，具有此菌为两端钝圆的短杆菌，大小约0.5–3.0um，具有乳白色且表面光滑的圆形菌落，菌落边缘整齐，在富含葡萄糖为碳源的培养基中生长迅速。

经形态学鉴定和16srdna序列比对后的发育树分析，确定该菌株为大肠杆菌，按照国际命名规则：属名+种名+株名对该菌株进行命名，属名、种名、株名分别为埃希氏菌属、大肠杆菌种和s17-3，命名为埃希氏菌属大肠杆菌种escherichiacolis17-3，保藏号为：cctcc2018200。该菌株具有如下优势：在培养基中补加碳源的条件下，外源表达质粒pbhya-cab的条件下，菌的密度远远高于其他已有的大肠杆菌。此外，该菌在发酵过程中，各种有机酸等副产物的积累远远低于其他已有的大肠杆菌，使得碳源更多的流向主产物，非常适合高密度发酵培养。

此外，对escherichiacolis17-3进行基因鉴定的方法，包括如下步骤：

采用16srdna序列分析实现菌株的分子生物学鉴定。首先取对数期菌体，离心后用细菌基因组dna提取试剂盒提取，以基因组dna为模板,再以引物对3p-f(agagtttgatcctggctcag，seqidno.12)以及3p-r:(ggttaccttgttacgactt，seqidno.13)为引物对进行pcr扩增，反应条件为95℃预变性5min、94℃变性30sec、55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min。获得的pcr产物利用1％琼脂糖凝胶电泳分离纯化并回收，并送至上海生工生物工程有限公司进行dna序列测定，测序结果利用ncbi的genank数据库进行比对分析。

结果如下，s17-3菌的其碱基长度为1430bp，序列具体如seqidno.14所示，具体为：

gggggaaagtctaaccatgtcagtcgaacggtaacaggaagaagcttgcttctttgctgacgagtggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcggatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcggggaggaagggagtaaagttaatacctttgctcattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatctgatactggcaagcttgagtctcgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacggaagttttcagagatgagaatgtgccttcgggaaccgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggtccggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgctaccca

实施例2大肠杆菌s17-3高密度生长体系的构建方法

a.重组质粒petacab，pbhya-cab的构建

构建的重组质粒petacab的图谱如图1a所示。首先通过双酶切(酶切位点ndei和hindiii)从实验室储存的质粒pet-a切下3870bp片段(所述3870bp片段的核苷酸序列如seqidno.1所示，具体为：

tatggcacgtctctcctccttgcgacaccggcaggacaccgggcgcttatggtcggcaagcgacgtccctgtagcaaggcaaaccatcgcttcacgtgagatgctgaaaacgaaagctcatccttctgcactggcgcacgtcgccagaaagtattgttaataaagcgtagtgaaacttttgcacaaaacaatacaaactgtgtggatttatcttttagcgataaaaatggacctatttttcttttggccgggcggtggggatgtttagccggttgctaaacgagtaaaagagaaggaattcggatcctagagggaaaccgttgtggtctccctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcgagatctcgggcagcgttgggtcctggccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctgcaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgaaattgtaaacgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccaatccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctttgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgctcgagtgcggccgcaa)

然后对质粒pbcab进行三酶切(酶切位点分别为ndei，hindiii和apali)，获得长度为3721bp的dna片段，其核苷酸序列如seqidno.2所示，具体如下：

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通过酶切获得的两个dna片段(seqidno.1及seqidno.2)通过t4dna连接酶连接，并转化到大肠杆菌dh5α，筛选得到重组质粒petacab，质粒示意图如图1a所示。其序列如seqidno.4所示。具体如下：

atccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctttgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgctcgagtgcggccgcaaagcttaacccatgtgcagaccaccgttcagagagaagtcagcaccggtagagaaaccagattcttcagaagacagccaagcgcagatagaagcgatttcttccggcagacccagacgtttaaccgggatggtagcaacgattttgtccagaacgtcctgacggatagctttaaccatgtcggtagcgatgtaacccggagaaacggtgttaacggtaacacctttggtagcaacttcctgagccagagccatggtgaaaccgtgcagaccagctttagcggtagagtagttggtctgaccgaactgacctttctgaccgttaacagaagagatgttaacgatacgaccccaaccacggtcagccataccgtcgataacctgtttggtaacgttgaacagagaggtcaggttggtgtcgataacagcgtcccagtcagcacgggtcattttacggaaaacaacgtcacgggtgataccagcgttgttgatcagaacgtcaacttcaccaacttcagatttaactttgtcgaaagcggttttggtagagtcccagtcagcaacgttaccttcagaagcgatgaagtcgaaacccagagctttctgctgttccagccatttttcacgacgcggagagttcggaccgcaaccagcaacaacacggaaaccgtctttagccagacgctggcagatagcggtaccgataccacccataccaccggtaacgtaagcgatacgctgggtcatttatcattcctcctttatttacgttcaacagccagagcaacacccataccaccaccgatgcacagagaagccagaccttttttagcgtcacgacgtttcatttcgtgcagcagggtaaccaggatacggcaaccagaagcaccgatcgggtgaccgatagcgatagcaccaccgttaacgttaactttagaggtgtcccaacccatctgctggtgaacagccagagcctgagcagcgaacgcttcgttgatttccatcaggtccaggtcctgcggggtccattcagcacgagacagagcacgtttagaagccggaaccggacccatacccataactttcgggtcaacaccagcgttagcgtaagatttgatggtagccagcggggtcagacccagttctttagctttagcagcagacataacaacaacagcagcagcaccgtcgttcagaccagaagcgttagcagcggtaacggtaccagctttgtcgaaagccggtttcagaccagacatagagtccagggtagcaccctgacgaacgaattcgtcggttttgaaagcaaccgggtcacctttacgctgcgggatcagaaccggaacgatttcttcgtcgaatttaccagctttctgagcagcttcagctttgttctgagaaccaacagcgaattcgtcctgagcttcacgggtgataccgtattctttagcaacgttttcagcggtgatacccatgtggtactggttgtaaacgtcccacagaccgtcaacgatcatggtgtcaaccagtttagcgtcacccatacggaaaccgtcacgagaacccggcagaacgtgcggagcagcagacatgttttcctgaccaccagcaacaacgatttcagcgtcaccagccatgatagcgttagcagccagcataacagctttcagaccagaaccgcaaactttgttgatggtcatagccggaaccatagccggcagaccagctttgatagcagcctgacgagccgggttctgaccagaaccagcggtcagaacctgacccatgataacttcagaaacctgttccggtttaacaccagcacgttccagagcagctttgataacaacagcacccagttccggagccgggattttagccagagaaccaccgaatttaccaacagcggtacgagcagcagaaacgataacaacgtcggtcatttatcattcctcctttacgctttagctttaacgtaacgacccggagccggttcgatagcacggtaacgagcgttaccgtagttagccggagcagcacgtttagcaccagcctgaccagccagccaagcggtccagtccggccaccaagaaccgtggtgttcgatagcaccagccagccactgctgcggagattccggcagagcgtcgttggtccagtgagaacgtttgtttttagccggcgggttgataacaccagcgatgtgaccagaagcacccagaacgaaacgcagtttgttagccagcagagcggtagaagcgtaagcagcggtccacggaacgatgtggtcttcacgagaaccgtagatgtaggtcggaacgtcgatagaagccaggtcaaccggaacaccgcaaacggtcagtttacccggaactttcagttcgttctgcaggtaggtgtgacgcaggtaccagcagtaccacggacccggcaggttggtagcgtcaccgttccagaacagcaggtcgaacggaaccggggtgttacctttcaggtagttgtcaacaacgtagttccaaaccaggtcgttcggacgcaggaaagagaaggtgttagccagttccagaccacgcagcagagcgcacggagcaccagcaccaccacccagggtagcttcacgcagctgaacgtgaccttcgtcaacgaaaacgtccaggataccggtgtcagcgaagtccagcagggtggtcagcagggtaacagaagcagccgggtgttcaccacgagcagccagaacagccagagcggtagaaacgatggtaccaccaacgcagaaacccagaacgttgattttgtcctgaccagagatgtcacgagcaacttcgatagcacggatagcagcgtgttcgatgtagtcgtcccaggtagaaccagccatagaagcgtccgggttacgccaagaaaccaggaaaacggtgtgaccctgttcaacaacgtgacgaaccagagaagattccggctgcaggtccaggatgtagtatttgttgatgcacggcggaaccatcagcagcggacgagcgtgaactttgtcggtcagcggtttgtactgcagcagctggaagtattcgttttcgaaaacaacagcaccttcggtaacagcaacgttacgaccaacttcgaaagcagattcgtcggtctgagagattttaccacgggtcaggtcttccatcatgttacgaacaccagcacgcagagattcaccaccagattcgatcagcagacgctgagcttccgggttggtagccaggaagttagccggagacatagcgtcaacccactgagagatagcgaaacggatacgctgacgggttttagcgtcagcttcaacagcgtcagccagttcggtcagagcacgagcgttcagcaggtagaaagcagcagcgaaacggtacggcaggttggtacgccaagcgtcaccagcgaaacgacggtcgtgcagcggaccggtagcttcagctttaccttcagccatagcctgccacagagcagagaagtctttcatgtaacgctgctggatgtcacccagctgagccggagcgattttaacaccagccagagcgtccagacccgggataccagaagcagcagcgtgaccgttaccttcggtaccctgccactgacgagaccattccagccaggtagccgggtcgaacggacccggggtaactttgaacggctgagatttaccttcctgggtagaagcagcagcacctttaccggtagccatatggcacgtctctcctccttgcgacaccggcaggacaccgggcgcttatggtcggcaagcgacgtccctgtagcaaggcaaaccatcgcttcacgtgagatgctgaaaacgaaagctcatccttctgcactggcgcacgtcgccagaaagtattgttaataaagcgtagtgaaacttttgcacaaaacaatacaaactgtgtggatttatcttttagcgataaaaatggacctatttttcttttggccgggcggtggggatgtttagccggttgctaaacgagtaaaagagaaggaattcggatcctagagggaaaccgttgtggtctccctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcgagatctcgggcagcgttgggtcctggccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagc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构建的重组质粒pbhya-cab图谱如图1b所示。重组质粒pbhya-cab的构建如下：利用引物1p-f(tctgcacatgggttaagctttgcggccgcactcgagacgcgccctgtagcggcgcatt，seqidno.5)和1p-r(ggttgctaaacgagtaaaagagaaggaattcggatcctttccataggctccgccccseqidno.6)，以质粒pbcab为模板，扩增得到2279bp片段，标记为pblu片段(pblu的核苷酸序列如seqidno.7所示，具体如下：

ggttgctaaacgagtaaaagagaaggaattcggatcctttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtctcgagtgcggccgcaaagcttaacccatgtgcaga。

再利用引物2p-f(ggatccgaattccttctcttttactcgtttagcaacc，seqidno.8)以及2p-r(ctcgagtgcggccgcaaagcttaacccatgtgc，seqidno.9)，以质粒petacab(图1a)为模板，扩增得到4018bp片段，记为pcab片段，所述pcab片段的核苷酸序列如seqidno.10所示，具体如下：

acccatgtgcagaccaccgttcagagagaagtcagcaccggtagagaaaccagattcttcagaagacagccaagcgcagatagaagcgatttcttccggcagacccagacgtttaaccgggatggtagcaacgattttgtccagaacgtcctgacggatagctttaaccatgtcggtagcgatgtaacccggagaaacggtgttaacggtaacacctttggtagcaacttcctgagccagagccatggtgaaaccgtgcagaccagctttagcggtagagtagttggtctgaccgaactgacctttctgaccgttaacagaagagatgttaacgatacgaccccaaccacggtcagccataccgtcgataacctgtttggtaacgttgaacagagaggtcaggttggtgtcgataacagcgtcccagtcagcacgggtcattttacggaaaacaacgtcacgggtgataccagcgttgttgatcagaacgtcaacttcaccaacttcagatttaactttgtcgaaagcggttttggtagagtcccagtcagcaacgttaccttcagaagcgatgaagtcgaaacccagagctttctgctgttccagccatttttcacgacgcggagagttcggaccgcaaccagcaacaacacggaaaccgtctttagccagacgctggcagatagcggtaccgataccacccataccaccggtaacgtaagcgatacgctgggtcatttatcattcctcctttatttacgttcaacagccagagcaacacccataccaccaccgatgcacagagaagccagaccttttttagcgtcacgacgtttcatttcgtgcagcagggtaaccaggatacggcaaccagaagcaccgatcgggtgaccgatagcgatagcaccaccgttaacgttaactttagaggtgtcccaacccatctgctggtgaacagccagagcctgagcagcgaacgcttcgttgatttccatcaggtccaggtcctgcggggtccattcagcacgagacagagcacgtttagaagccggaaccggacccatacccataactttcgggtcaacaccagcgttagcgtaagatttgatggtagccagcggggtcagacccagttctttagctttagcagcagacataacaacaacagcagcagcaccgtcgttcagaccagaagcgttagcagcggtaacggtaccagctttgtcgaaagccggtttcagaccagacatagagtccagggtagcaccctgacgaacgaattcgtcggttttgaaagcaaccgggtcacctttacgctgcgggatcagaaccggaacgatttcttcgtcgaatttaccagctttctgagcagcttcagctttgttctgagaaccaacagcgaattcgtcctgagcttcacgggtgataccgtattctttagcaacgttttcagcggtgatacccatgtggtactggttgtaaacgtcccacagaccgtcaacgatcatggtgtcaaccagtttagcgtcacccatacggaaaccgtcacgagaacccggcagaacgtgcggagcagcagacatgttttcctgaccaccagcaacaacgatttcagcgtcaccagccatgatagcgttagcagccagcataacagctttcagaccagaaccgcaaactttgttgatggtcatagccggaaccatagccggcagaccagctttgatagcagcctgacgagccgggttctgaccagaaccagcggtcagaacctgacccatgataacttcagaaacctgttccggtttaacaccagcacgttccagagcagctttgataacaacagcacccagttccggagccgggattttagccagagaaccaccgaatttaccaacagcggtacgagcagcagaaacgataacaacgtcggtcatttatcattcctcctttacgctttagctttaacgtaacgacccggagccggttcgatagcacggtaacgagcgttaccgtagttagccggagcagcacgtttagcaccagcctgaccagccagccaagcggtccagtccggccaccaagaaccgtggtgttcgatagcaccagccagccactgctgcggagattccggcagagcgtcgttggtccagtgagaacgtttgtttttagccggcgggttgataacaccagcgatgtgaccagaagcacccagaacgaaacgcagtttgttagccagcagagcggtagaagcgtaagcagcggtccacggaacgatgtggtcttcacgagaaccgtagatgtaggtcggaacgtcgatagaagccaggtcaaccggaacaccgcaaacggtcagtttacccggaactttcagttcgttctgcaggtaggtgtgacgcaggtaccagcagtaccacggacccggcaggttggtagcgtcaccgttccagaacagcaggtcgaacggaaccggggtgttacctttcaggtagttgtcaacaacgtagttccaaaccaggtcgttcggacgcaggaaagagaaggtgttagccagttccagaccacgcagcagagcgcacggagcaccagcaccaccacccagggtagcttcacgcagctgaacgtgaccttcgtcaacgaaaacgtccaggataccggtgtcagcgaagtccagcagggtggtcagcagggtaacagaagcagccgggtgttcaccacgagcagccagaacagccagagcggtagaaacgatggtaccaccaacgcagaaacccagaacgttgattttgtcctgaccagagatgtcacgagcaacttcgatagcacggatagcagcgtgttcgatgtagtcgtcccaggtagaaccagccatagaagcgtccgggttacgccaagaaaccaggaaaacggtgtgaccctgttcaacaacgtgacgaaccagagaagattccggctgcaggtccaggatgtagtatttgttgatgcacggcggaaccatcagcagcggacgagcgtgaactttgtcggtcagcggtttgtactgcagcagctggaagtattcgttttcgaaaacaacagcaccttcggtaacagcaacgttacgaccaacttcgaaagcagattcgtcggtctgagagattttaccacgggtcaggtcttccatcatgttacgaacaccagcacgcagagattcaccaccagattcgatcagcagacgctgagcttccgggttggtagccaggaagttagccggagacatagcgtcaacccactgagagatagcgaaacggatacgctgacgggttttagcgtcagcttcaacagcgtcagccagttcggtcagagcacgagcgttcagcaggtagaaagcagcagcgaaacggtacggcaggttggtacgccaagcgtcaccagcgaaacgacggtcgtgcagcggaccggtagcttcagctttaccttcagccatagcctgccacagagcagagaagtctttcatgtaacgctgctggatgtcacccagctgagccggagcgattttaacaccagccagagcgtccagacccgggataccagaagcagcagcgtgaccgttaccttcggtaccctgccactgacgagaccattccagccaggtagccgggtcgaacggacccggggtaactttgaacggctgagatttaccttcctgggtagaagcagcagcacctttaccggtagccatatggcacgtctctcctccttgcgacaccggcaggacaccgggcgcttatggtcggcaagcgacgtccctgtagcaaggcaaaccatcgcttcacgtgagatgctgaaaacgaaagctcatccttctgcactggcgcacgtcgccagaaagtattgttaataaagcgtagtgaaacttttgcacaaaacaatacaaactgtgtggatttatcttttagcgataaaaatggacctatttttcttttggccgggcggtggggatgtttagccggttgctaaacgagtaaaagagaaggaattc。

扩增得到的pblu片段和pcab片段互有有同源互补序列，经过overlappcr获得环状pcr产物后转化大肠杆菌dh5α，经氨苄抗生素(100ug/ml)筛选，获得含有重组质粒pbhya-cab的转化子，该质粒的示意图如图1b所示，其序列如seqidno.11所示，具体为：

ctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtctcgagtgcggccgcaaagcttaacccatgtgcagaccaccgttcagagagaagtcagcaccggtagagaaaccagattcttcagaagacagccaagcgcagatagaagcgatttcttccggcagacccagacgtttaaccgggatggtagcaacgattttgtccagaacgtcctgacggatagctttaaccatgtcggtagcgatgtaacccggagaaacggtgttaacggtaacacctttggtagcaacttcctgagccagagccatggtgaaaccgtgcagaccagctttagcggtagagtagttggtctgaccgaactgacctttctgaccgttaacagaagagatgttaacgatacgaccccaaccacggtcagccataccgtcgataacctgtttggtaacgttgaacagagaggtcaggttggtgtcgataacagcgtcccagtcagcacgggtcattttacggaaaacaacgtcacgggtgataccagcgttgttgatcagaacgtcaacttcaccaacttcagatttaactttgtcgaaagcggttttggtagagtcccagtcagcaacgttaccttcagaagcgatgaagtcgaaacccagagctttctgctgttccagccatttttcacgacgcggagagttcggaccgcaaccagcaacaacacggaaaccgtctttagccagacgctggcagatagcggtaccgataccacccataccaccggtaacgtaagcgatacgctgggtcatttatcattcctcctttatttacgttcaacagccagagcaacacccataccaccaccgatgcacagagaagccagaccttttttagcgtcacgacgtttcatttcgtgcagcagggtaaccaggatacggcaaccagaagcaccgatcgggtgaccgatagcgatagcaccaccgttaacgttaactttagaggtgtcccaacccatctgctggtgaacagccagagcctgagcagcgaacgcttcgttgatttccatcaggtccaggtcctgcggggtccattcagcacgagacagagcacgtttagaagccggaaccggacccatacccataactttcgggtcaacaccagcgttagcgtaagatttgatggtagccagcggggtcagacccagttctttagctttagcagcagacataacaacaacagcagcagcaccgtcgttcagaccagaagcgttagcagcggtaacggtaccagctttgtcgaaagccggtttcagaccagacatagagtccagggtagcaccctgacgaacgaattcgtcggttttgaaagcaaccgggtcacctttacgctgcgggatcagaaccggaacgatttcttcgtcgaatttaccagctttctgagcagcttcagctttgttctgagaaccaacagcgaattcgtcctgagcttcacgggtgataccgtattctttagcaacgttttcagcggtgatacccatgtggtactggttgtaaacgtcccacagaccgtcaacgatcatggtgtcaaccagtttagcgtcacccatacggaaaccgtcacgagaacccggcagaacgtgcggagcagcagacatgttttcctgaccaccagcaacaacgatttcagcgtcaccagccatgatagcgttagcagccagcataacagctttcagaccagaaccgcaaactttgttgatggtcatagccggaaccatagccggcagaccagctttgatagcagcctgacgagccgggttctgaccagaaccagcggtcagaacctgacccatgataacttcagaaacctgttccggtttaacaccagcacgttccagagcagctttgataacaacagcacccagttccggagccgggattttagccagagaaccaccgaatttaccaacagcggtacgagcagcagaaacgataacaacgtcggtcatttatcattcctcctttacgctttagctttaacgtaacgacccggagccggttcgatagcacggtaacgagcgttaccgtagttagccggagcagcacgtttagcaccagcctgaccagccagccaagcggtccagtccggccaccaagaaccgtggtgttcgatagcaccagccagccactgctgcggagattccggcagagcgtcgttggtccagtgagaacgtttgtttttagccggcgggttgataacaccagcgatgtgaccagaagcacccagaacgaaacgcagtttgttagccagcagagcggtagaagcgtaagcagcggtccacggaacgatgtggtcttcacgagaaccgtagatgtaggtcggaacgtcgatagaagccaggtcaaccggaacaccgcaaacggtcagtttacccggaactttcagttcgttctgcaggtaggtgtgacgcaggtaccagcagtaccacggacccggcaggttggtagcgtcaccgttccagaacagcaggtcgaacggaaccggggtgttacctttcaggtagttgtcaacaacgtagttccaaaccaggtcgttcggacgcaggaaagagaaggtgttagccagttccagaccacgcagcagagcgcacggagcaccagcaccaccacccagggtagcttcacgcagctgaacgtgaccttcgtcaacgaaaacgtccaggataccggtgtcagcgaagtccagcagggtggtcagcagggtaacagaagcagccgggtgttcaccacgagcagccagaacagccagagcggtagaaacgatggtaccaccaacgcagaaacccagaacgttgattttgtcctgaccagagatgtcacgagcaacttcgatagcacggatagcagcgtgttcgatgtagtcgtcccaggtagaaccagccatagaagcgtccgggttacgccaagaaaccaggaaaacggtgtgaccctgttcaacaacgtgacgaaccagagaagattccggctgcaggtccaggatgtagtatttgttgatgcacggcggaaccatcagcagcggacgagcgtgaactttgtcggtcagcggtttgtactgcagcagctggaagtattcgttttcgaaaacaacagcaccttcggtaacagcaacgttacgaccaacttcgaaagcagattcgtcggtctgagagattttaccacgggtcaggtcttccatcatgttacgaacaccagcacgcagagattcaccaccagattcgatcagcagacgctgagcttccgggttggtagccaggaagttagccggagacatagcgtcaacccactgagagatagcgaaacggatacgctgacgggttttagcgtcagcttcaacagcgtcagccagttcggtcagagcacgagcgttcagcaggtagaaagcagcagcgaaacggtacggcaggttggtacgccaagcgtcaccagcgaaacgacggtcgtgcagcggaccggtagcttcagctttaccttcagccatagcctgccacagagcagagaagtctttcatgtaacgctgctggatgtcacccagctgagccggagcgattttaacaccagccagagcgtccagacccgggataccagaagcagcagcgtgaccgttaccttcggtaccctgccactgacgagaccattccagccaggtagccgggtcgaacggacccggggtaactttgaacggctgagatttaccttcctgggtagaagcagcagcacctttaccggtagccatatggcacgtctctcctccttgcgacaccggcaggacaccgggcgcttatggtcggcaagcgacgtccctgtagcaaggcaaaccatcgcttcacgtgagatgctgaaaacgaaagctcatccttctgcactggcgcacgtcgccagaaagtattgttaataaagcgtagtgaaacttttgcacaaaacaatacaaactgtgtggatttatcttttagcgataaaaatggacctatttttcttttggccgggcggtggggatgtttagccggttgctaaacgagtaaaagagaaggaattcggatcctttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccac

其中双酶切体系为：

表1

三酶切体系为：

表2

酶切反应在37℃水浴锅，反应4h。酶切产物经axygenpcr清洁试剂盒回收纯化。酶切后的两片段经t4dnaligation进行酶连。

其中，由引物对1p-f，1p-r扩增片段pblue片段的pcr反应体系如下：

表3

pcr程序如下：

1)95℃，3min；

2)95℃，15sec；

3)56℃，15sec；

4)72℃，2.5min；

5)循环从2)到4)，30次；

6)72℃，5min；

7)4℃，保存。

同样地，按照相同的pcr反应体系和pcr程序扩增pcab片段，其中模板为质粒petacab，引物为2p-f，2p-r。

将片段pblue和pcab进行overlappcr的反应体系如下：

表4

反应程序与扩增片段pblue一样。

验证筛选阳性克隆pbhya-cab进行的菌落pcr体系如下：

表5

pcr程序如下：

1)98℃，2min

2)98℃，30sec

3)55℃，30sec

4)72℃，4.5min

5)循环从2)到4)，30次

6)72℃，5min

7)4℃，保存。

b.质粒转化获得重组大肠杆菌

重组质粒petacab和pbhya-cab分别电转到菌株bw25113，该菌株也是一株模式大肠杆菌，其基因型为laci^qrrnbt14δlaczwj16hsdr514δarabadah33δrhabadld78(参考文献babaetal.(2006))，和s17-3(本发明的埃希氏菌属大肠杆菌种escherichiacolis17-3)，分别得到重组菌株bw25113/petacab，bw25113/pbhya-cab，s17-3/petacab，s17-3/pbhya-cab。

实施例3大肠杆菌s17-3高密度生长随时间示意图

将实施例2中的电转得到的重组大肠杆菌bw25113/petacab，bw25113/pbhya-cab，s17-3/petacab，s17-3/pbhya-cab做摇瓶发酵：用接种环挑取大肠杆菌s17-3/pbhya-cab接种到装3mllb的试管，37℃，200r/min摇床过夜培养。将过夜培养的大肠杆菌以1％的接种量接种到装有100ml液体lb培养基的500ml摇瓶中，培养基中加20g/l的葡萄糖以及100ul的100ug/ml的氨苄抗生素，同样在37℃、200r/min摇床中进行发酵培养。培养基初始ph控制在ph7.0左右。发酵24h取样测定细胞生长密度od600。图2则为四株重组大肠杆菌发酵24h得到细胞密度od600。从图2可以观察到重组菌株s17-3/pbhya-cab发酵24h后的细胞密度最大，而bw25113重组菌的细胞密度则要低得多。以重组大肠杆菌s17-3/pbhya-cab为生产菌种，做上面相同条件的摇瓶发酵。图3为重组大肠杆菌s17-3/pbhya-cab细胞生长密度od600随时间变化示意图。在发酵24h，大肠杆菌s17-3的细胞密度od600在32左右。

实施例4重组大肠杆菌在初始低ph值发酵生产可拉酸

以重组大肠杆菌s17-3/pbhya-cab为生产菌种，做摇瓶发酵：用接种环挑取大肠杆菌s17-3/pbhya-cab接种到装3mllb的试管，37℃，200r/min摇床过夜培养。将过夜培养的大肠杆菌以1％的接种量接种到装有50ml液体lb培养基的500ml摇瓶中，培养基中加20g/l的葡萄糖以及50ul的100ug/ml的氨苄抗生素，同样在37℃、200r/min摇床中进行发酵培养。培养基初始ph使用3m的盐酸控制在ph4.5。发酵24h取样测定可拉酸产量。测定可拉酸产量的方法为：首先配制岩藻糖母液10g/l，将母液稀释成1至10g/l的浓度梯度。取4.5ml硫酸水溶液(6:1v/v)中加入50ul的标品溶液，100℃煮沸20min。冷却至室温，分别测定a396nm和a427nm的吸光值(，随后加入100ul的1m的半胱氨酸盐酸盐，再次测定a’396nm和a’427nm的吸光值。计算△a396-△a427(△a396＝a’396nm-a396nm，△a427＝a’427nm-a427nm)。以岩藻糖浓度为横坐标，以△a396-△a427为纵坐标，绘制标准曲线。得到y＝0.0676x+0.0194(r2＝0.9968)。根据岩藻糖标准曲线得到生产的可拉酸中含有的岩藻糖的浓度，并通过可拉酸中岩藻糖所在百分含量(36.61％)得到可拉酸的含量。菌株在摇瓶发酵24h测得可拉酸浓度为10.22g/l。

采用上罐分批不补料的方式进行发酵，在5l罐中，用盐酸控制发酵罐的初始ph在4.5左右，发酵罐培养基为3llb及20g/l的葡萄糖，罐内温度控制在37℃。通风搅拌，溶氧控制为30％左右。取样并测定可拉酸浓度，两者随发酵时间变化曲线的结果如图4所示，在32h左右，可拉酸的浓度在16g/l左右。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110>中国科学院上海高等研究院

<120>一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌及其应用

<160>13

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3870

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tatggcacgtctctcctccttgcgacaccggcaggacaccgggcgcttatggtcggcaag60

cgacgtccctgtagcaaggcaaaccatcgcttcacgtgagatgctgaaaacgaaagctca120

tccttctgcactggcgcacgtcgccagaaagtattgttaataaagcgtagtgaaactttt180

gcacaaaacaatacaaactgtgtggatttatcttttagcgataaaaatggacctattttt240

cttttggccgggcggtggggatgtttagccggttgctaaacgagtaaaagagaaggaatt300

cggatcctagagggaaaccgttgtggtctccctatagtgagtcgtattaatttcgcggga360

tcgagatctcgggcagcgttgggtcctggccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgt420

tgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatac480

gcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaa540

tggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcacca600

ttatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtggaacacctacatctg660

tattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtcccgccgcatccata720

ccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaaccc780

gtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccc840

cttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgcttta900

tcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacagg960

cagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgc1020

gtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagctt1080

gtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcg1140

ggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaa1200

ctatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccg1260

cacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgac1320

tcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaata1380

cggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaa1440

aaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccct1500

gacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataa1560

agataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccg1620

cttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctca1680

cgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa1740

ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccg1800

gtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgagg1860

tatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagg1920

acagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagc1980

tcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcag2040

attacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgac2100

gctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatc2160

ttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgag2220

taaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgt2280

ctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggag2340

ggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctcca2400

gatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaact2460

ttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgcca2520

gttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctgcaggcatcgtggtgtcacgctcgtcg2580

tttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatccccc2640

atgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttg2700

gccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgcca2760

tccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgt2820

atgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagc2880

agaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatc2940

ttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagca3000

tcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaa3060

aagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattat3120

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