丝素固定芋头多酚氧化酶的方法与流程

本发明属于材料领域，具体涉及一种成本低、操作简单，且制得的固化酶具有酶的稳定性、高效性、专一性的丝素固定芋头多酚氧化酶的方法。

背景技术：

芋头属南星科多年生草本植物芋的地下块茎，是一些热带或亚热带地区人们的主要食品，具有极高的食用价值和保健作用。但芋头组织中的多酚氧化酶在加工中非常容易引起酶促褐变，严重影响产品的外观品质及商品价值，因此，亟待解决褐变对芋头类加工中的问题。

为了解决上述问题，人们利用固定化酶技术，对多酚氧化酶进行固定化处理，经过固定化的多酚氧化酶，不但可以保持酶的高效专一及温和的酶催化反应特性，操作储存稳定性高，重复使用性提高等优点大大的降低其使用成本提高生产效率。而依据酶的性质及用途，酶的固定化方法主要可以分为化学及物理两大分类，其固定方法可通过包埋法、交联法、吸附法及共价结合法等来进行。其中，在固定化酶技术中，载体材料的选择是决定酶能否成功固定化以及固定化酶活力高低的重要因素，它直接影响固定化酶的性质及应用范围。

丝素作为一种新型的载体，因其具有特殊的氨基酸组成和结晶结构，是一种具有反应条件温和、反应性强、热安全性好等优点的固定化酶载体而成为研究热点。但目前对于丝素固定多酚氧化酶的研究不多，如能将丝素应用到固定化酶领域必将有着广阔的空间和美好的前景。

技术实现要素：

本发明旨在解决上述问题，而提供一种成本低、操作简单，且制得的固化酶具有酶的稳定性、高效性、专一性的丝素固定芋头多酚氧化酶的方法。

本发明提供的一种丝素固定芋头多酚氧化酶的方法，该方法包括如下步骤：

a、芋头多酚氧化酶粗酶液的制备：将芋头切块，加入磷酸盐缓冲液，按芋头与磷酸盐缓冲液固液比为1:2进行均质，将均质的混合液进行离心，经静置后，上清液即为芋头多酚氧化酶粗酶液；

b、丝素的制备：将蚕茧剪成1～2cm²的小片，将蚕茧小片置于0.5％碳酸钠(w/v＝1:50)溶液中，在沸水中加热脱胶两次，每次0.5h，烘干即得丝素；

c、丝素固定芋头多酚氧化酶：向芋头多酚氧化酶粗酶液中加入丝素进行芋头多酚氧化酶固定化，并根据考马斯亮蓝法，通过紫外-可见分光光度法检测，利用标准曲线和计算公式，确定固定化过程中多酚氧化酶的负载量、固定化酶活力、活力回收率及酶吸附含量。

步骤c中，所述固定化时间为20min。

步骤c中，所述丝素与芋头多酚氧化酶粗酶液的固液比为1:25。

步骤c中，所述反应体系溶液的ph值为7。

步骤c中，所述固定化温度为40℃。

步骤c中，所述紫外-可见分光光度法的吸收波长为595nm。

步骤c中，所述固定化过程中多酚氧化酶的负载量＝原酶液蛋白质浓度-固定化酶滤出蛋白质浓度。

步骤c中，所述固定化酶活力的计算公式：

式中：△a——某一段时间内吸光度的改变

n——总酶液体积与参与反应的提取体积之比

t——反应时间(min)

w——样品重量(g)

活力回收率的计算公式：

式中：r——固定化酶的活力(u/g)

r——相同条件下游离酶的活力(u/g)

酶吸附含量的计算公式：

式中：m——酶吸附含量mg/g

c1——上清液未吸附的浓度(mg/ml)

c2——上清液吸附后的浓度(mg/ml)

m——加入的材料的质量(g)。

优选地，一种丝素固定芋头多酚氧化酶的方法包括如下步骤：

a、芋头多酚氧化酶粗酶液的制备：将芋头切块，加入磷酸盐缓冲液，按芋头与磷酸盐缓冲液固液比为1：2进行均质，将均质后的混合液进行离心，经静置后，上清液即为芋头多酚氧化酶粗酶液；

b、丝素的制备：将蚕茧剪成1～2cm²的小片，将蚕茧小片置于0.5％碳酸钠(w/v＝1:50)溶液中，在沸水中加热脱胶两次，每次0.5h，烘干即得丝素；

c、丝素固定芋头多酚氧化酶：在反应温度为40℃，溶液的ph值为7下，向芋头多酚氧化酶粗酶液中加入丝素进行芋头多酚氧化酶固定化20min，所述丝素与芋头多酚氧化酶粗酶液的固液比为1:25，并根据考马斯亮蓝法，通过紫外-可见分光光度法检测，利用标准曲线和计算公式，确定固定化过程中多酚氧化酶的负载量、固定化酶活力、活力回收率及酶吸附含量。

本发明的有益效果为：本发明的丝素固定芋头多酚氧化酶的方法通过以丝素为载体，利用蚕丝自备的较多羧酸基团的微孔材料，用物理方法来吸附多酚氧化酶粗酶液的方法进行丝素固定芋头化多酚氧化酶。该方法成本较低，操作简单，原料广泛易得，而且制得的固定化酶具有酶的稳定性，并保持芋头多酚氧化酶的高效、专一性，并且具有分离回收便捷、重复使用，连续操作可控性好等特点。

【附图说明】

图1是牛血清蛋白标准曲线。

图2是固定化时间对多酚氧化酶固定化效果的影响。

图3是固液比对多酚氧化酶固定化效果的影响。

图4是ph值对多酚氧化酶固定化效果的影响。

图5是固定化温度对多酚氧化酶固定化效果的影响。

【具体实施方式】

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，对本发明不构成任何限制。

1、仪器、试剂

(1)仪器：1524r离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)，evolution300紫外-可见分光光度计(美国热电有限公司)，phs-3c酸度计(上海仪电科学仪器股份有限公司)。

(2)试剂：考马斯亮蓝试剂(天津市光复精细化工研究所)，十二水合磷酸氢二钠(分析纯)(西陇科学股份有限公司)，磷酸二氢钠(二水分析纯)(成都市科龙化工试剂厂)，氯化钠(分析纯)(成都市科龙化工试剂厂)，乙醇(95％)(成都市科龙化工试剂厂)。

2、试验方法和结果

试验方法：

(1)芋头多酚氧化酶粗酶液的制备：将芋头切块，加入磷酸盐缓冲溶液，按芋头与磷酸盐缓冲液固液比为1:2进行均质，混合液用离心机离心，静置20min后，取上清液即为芋头多酚氧化酶粗酶液。

(2)丝素的制备：将蚕茧剪成1～2cm²的小片，将蚕茧小片置于0.5％碳酸钠(w/v＝1:50)溶液中，在沸水中加热脱胶两次，每次0.5h，烘干后即得到丝素。

(3)0.01％考马斯亮蓝g250溶液的配制：精确称取考马斯亮蓝g250固体0.1g，加入95％乙醇50ml、85％的浓磷酸100ml，用超纯水定容至1l。

(4)0.1g/l牛血清蛋白溶液的配制：精确称取牛血清蛋白(bsa)固体0.1g，用超纯水溶解并定容到1l，作为标准蛋白液。

(5)将丝素与芋头多酚氧化酶粗酶液反应，即得到所述的丝素固定芋头多酚氧化酶。

(6)样品液蛋白质浓度测定

将芋头多酚氧化酶溶液和丝素固定化多酚氧化酶制备时滤出液各取1ml，分别加入4ml考马斯亮蓝，摇匀，静置5min，用紫外-可见分光光度计测595nm处吸光度(a595)，通过标准曲线算出滤液中多酚氧化酶浓度。则：固定化过程中多酚氧化酶的负载量＝原酶液蛋白质浓度-固定化酶滤出蛋白质浓度。

(7)酶活性测定

测定丝素固定化芋头多酚氧化酶吸附量时，取吸附时间结束后的样品上清液0.08ml中加入5ml的g250溶液与0.02ml0.9％氯化钠溶液反应3min后于595nm处测定吸光值。再根据多酚氧化酶标准曲线换算成材料吸附酶含量。

其中，固定化酶活力的计算公式：

式中：△a——某一段时间内吸光度的改变

n——总酶液体积与参与反应的提取体积之比

t——反应时间(min)

w——样品重量(g)

活力回收率的计算公式：

式中：r——固定化酶的活力(u/g)

r——相同条件下游离酶的活力(u/g)

酶吸附含量的计算公式：

式中：m——酶吸附含量mg/g

c1——上清液未吸附的浓度(mg/ml)

c2——上清液吸附后的浓度(mg/ml)

m——加入的材料的质量(g)

(8)绘制标准曲线

取7支洁净的比色管，按表1顺序依次编号并加入试剂。混匀后静置5min，以1号试管为空白对照，在紫外-可见分光光度计中测吸光度，根据表1的数据，以吸光度(a595)为纵坐标，各标准浓度为横坐标作图，回归分析法绘制标准曲线，如图1，得到室温下牛血清蛋白标准曲线为：a＝0.0091c+0.0131,r²＝0.9991。

表1牛血清蛋白标准曲线

以此方法为基础，研究固定化反应时间、固液比、ph值及固定化温度对多酚氧化酶的固定化效果的影响，得出丝素固定芋头多酚氧化酶的固定化效果的最优条件。

结果与讨论：

(1)固定化反应时间对多酚氧化酶的固定化效果的影响

在反应温度为25℃，取丝素与芋头多酚氧化酶粗酶液比例为1:100，控制溶液值ph为6.5的条件下，在不同固定化反应时间(10、20、30、40、50、60、90、120min)下对酶吸附含量及酶活性回收率(以同组最高活性回收率为100％，其余活性回收率与其比值)的影响变化曲线如图2所示。

从图2中可看出，丝素固定化多酚氧化酶的酶吸附含量及相对活性回收率在10min及20min中内的变化幅度不是很大，并都在反应20min时达到了最大值。随着时间的增大，酶吸附含量及相对活性回收率不但不再增大而且逐渐的降低。而且在反应时间40min中后，随时间的增加相对活性回收率下降的幅度不是很大，保持在60％—67％之间。

综合蚕丝固定化多酚氧化酶的酶吸附含量效果及相对活性回收考率选取反应时间为20min为最佳固定化时间。

(2)固液比对多酚氧化酶的固定化效果的影响

在固定化温度为25℃，固定化时间20min，溶液值ph为6.5的条件下，不同的丝素与芋头ppo粗酶液的比例(1:25、1:50、1:100、1:150、1:200、1：300)对酶吸附含量及酶活性回收率(以同组最高活性回收率为100％，其余活性回收率与其比值)的影响变化曲线如图3所示。

从图3可知，以酶吸附含量来看，在反应固液比由1:25改变到1:100的过程中酶吸附含量逐渐增大而且在1:100达到最大值771.86mg/g，随后随固液比例的增大酶吸附含量不但没有增加反而逐渐减小。但从另相对活性回收率来看，随固液的比例的增大相对活性回收率逐渐降低。这可能由于丝素载体本身的结构对固定化酶的吸附负荷能力有关，当固液比越来越大的时候，丝素与芋头ppo粗酶液吸附固液比达到饱和，会影响到吸附效果。

综合固定化效果和相对活性回收率，选取固液比为1:25时为最佳固定效果。但考虑到更好分析及结合上面的实验，下面的因素将采用固液比为(1:100)进行研究试验。

(3)ph值对多酚氧化酶的固定化效果的影响

在反应温度为25℃，丝素与芋头粗酶液比例为1:100，固定化时间20min的条件下，不同的溶液值ph(3.6、4.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)(原溶液)对酶吸附含量及酶活性回收率(以同组最高活性回收率为100％，其余活性回收率与其比值)的影响变化曲线如图4所示。

从图4中可以看出，溶液ph值也对丝素固定化芋头多酚氧化酶有影响。由酶吸附含量及相对活性回收率曲线图可知，随溶液ph值的增加酶吸附含量及相对活性回收率也随之逐渐增大，并分别在ph值为7.5与ph值为7时达到最大值。随后ph值继续增大，酶吸附含量及相对活性回收率不但不再增大反而降低了。

这可能是由于酶在过酸或者过碱的条件中，酶的部分分子结构可能遭到破坏，活性减弱，多酚氧化酶固定在丝素内部，丝素分子中某些基团对构可能发生了变化有关。综合固定化酶吸附含量效果及相对活性回收率考虑，选取ph值为7的条件，为最优固定效果条件。

(4)固定化温度对多酚氧化酶的固定化效果的影响

取丝素与芋头ppo粗酶液比例为1：100，固定化时间为20min，控制溶液值ph值为7，不同固定化温度(20、25、30、35、40、45、50、55、60℃)对酶吸附含量及酶活性回收率(以同组最高活性回收率为100％，其余活性回收率与其比值)的影响变化曲线如图5所示。

从图5中可以看出固定化温度是影响丝素固定化多酚氧化酶的主要因素之一。在不同的固定化温度环境下，固定化酶的吸附酶含量在反应温度从20上升到25℃时酶吸附含量变化不大，并在20℃时达最大值(831.16mg/g)，随着试验的进行固定化温度逐渐增大，酶吸附含量不再增加，反而逐渐减小。从相对活性回收率中可以看出温度从20℃逐渐上升到40℃时，活性回收率逐渐增大并在达到40℃最大值，此后随温度的上升活性回收率逐渐降低。这主要的原因是可能是因为随着温度的上升，酶本身的部分结构遭到破坏，酶活性逐渐降低，导致吸附能力减弱。综合相对活性回收率和吸附含量效果考虑，选取40℃作为丝素固定化多酚氧化酶最优的固定化温度。

(5)正交试验优化丝素固定化多酚氧化酶的固定条件

在单因素试验基础上，选取固定化温度、固定化时间、固液比、ph值四个主要因素做l9(3⁴)正交试验，正交结果分析如表2、表3及表4所示。

表2蚕丝固定化多酚氧化酶正交因素表

表3丝素固定化芋头多酚氧化酶l9(3⁴)正交实验结果

表4丝素固定化芋头多酚氧化酶研究的验证试验

根据表3的r1及r2值，从酶活力及酶吸附含量来看，各因素对丝素固定化芋头多酚氧化酶效果影响主次分别是：c>b>d>a、c>d>b>a；从各k值可知，由酶活力及酶吸附含量方面得到不同的最佳组合，分别是a2b3c2d3、a1b3c2d1。正交试验中得到的这两组最佳方案都没有在正交试验的9个方案中且两方案在反应温度与固液比之间存在差异，因此需要另外对此两最佳组合进行验证试验，验证结果如图4所示。

为了验证正交试验最佳组合的正确性，通过验证试验，从测定丝素固定芋头多酚氧化酶后的残液的酶活力及酶吸附含量方面来考量。由表4数据可以看出知，a1b3c2d1组合的酶活力及酶吸附含量效果都要比a2b3c2d3的要好。综合试验数据可选择反应温度35℃，反应时间25min，ph值＝7，固液比为1：15，为丝素固定化芋头多酚氧化酶制备的最佳组合。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。