一种酶活提高的金属β-内酰胺酶突变体及其构建方法与流程

本发明涉及一种酶活提高的金属β-内酰胺酶突变体及其构建方法，属于基因工程
技术领域：
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背景技术：
：自1929年青霉素发明以来，抗生素在防治细菌性疾病方面，发挥了巨大的作用。但是，由于抗生素的长期大量使用，特别是不规范地滥用抗生素，导致了日益严重的细菌耐药性问题。细菌耐药最主要的机制是产生灭活酶，如β-内酰胺酶、氨基糖苷钝化酶等。β-内酰胺酶能够与β-内酰胺的羧基共价结合，使其酰胺键水解，灭活青霉素和/或头孢菌素。β-内酰胺酶种类较为复杂，到目前已发现有三百多种，并且由于超广谱β-内酰胺类抗生素的大量使用，出现了耐受超广谱β-内酰胺类抗生素的超广谱β-内酰胺酶(esbls)。根据末端氨基酸序列及编码基因的位点可将β-内酰胺酶分成a、b、c和d四类：shv属于a类，金属酶属于b类，ampc酶属于c类，0xa型酶属于d类。a型和d型酶属于青霉素酶；c型酶属于头孢菌素酶；b型酶依靠金属离子而保持活性，因此被称为金属酶。b型β-内酰胺酶能分解除单环类抗生素外所有的β-内酰胺类药物，即对其耐药。克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦等酶抑制剂对其也不能抑制，细菌携带此酶已成为临床中的大问题。b型β-内酰胺酶，也称金属β-内酰胺酶(mβps)，是依靠zn2+或者其他重金属离子来发挥催化活性的水解酶，也是一个种类繁多的超级家族。mβps主要产于一些病原菌，其基因属于质粒编码。imp和vim是两种典型的mβps，基因依靠质粒编码，具有很多变异型。目前mβpimp已由最初的imp-1演变成有26种变异体的大家族，vim型由最初的vim-1发展成23个变异体的体系。这两种酶不仅含有耐药的基因卡盒，还含有与转座子相关的整合子(基因转移系统)结构，可以嵌入细菌的染色体和质粒中，整合子结构可以促进整合子在质粒间的移动，质粒可以帮助耐药基因在不同细菌间传递。近年发现的ndm-1，属于b1mβps，是一个双核zn结构，能水解所有β-内酰胺类抗生素，一经发现，便引起了世界卫生组织的恐慌。2008年，在一个由印度返回瑞典的病人身上采集的肺炎克雷伯菌和大肠杆菌中，首次发现ndm-1。在印度的肠杆菌科菌株中经常可检测到ndm-1，科学家在inca/c、incf、incl/m型染色体中发现了blandm-1基因，这种基因可依靠结合的方式在革兰氏阴性菌之间自由地传递，但是与imp-mpl和vim-mpl不同的是，它没有整合子结构。到2010年8月，含有ndm-1基因的阳性菌在全球广泛传播，在南美发现的病例尤为多，大部分病菌携带者与印度等次大陆的传染病有一定联系，小部分来自于中国和南亚。目前，临床上在很多来自各种疾病(泌尿感染、败血症、肺结核、腹膜炎及软组织感染等)的肠杆菌科细菌中发现ndm-1，而且在医院和社区中都有获得性细菌感染的相关报道，可看出，携带ndm-1的细菌几乎是无孔不入的。根据已知序列，金属β-内酰胺酶可分为b1、b2、b3个亚族。b1亚族是金属β-内酰胺酶最大的分支，其基因属于染色体编码，在铜绿假单胞菌等革兰氏阴性致病菌中可传播这种耐药基因。mols的底物范围很广，几乎可水解所有的β-内酰胺类抗生素，但是b2亚族金属β-内酰胺酶是一个例外，它可专一水解碳青霉烯类抗生素，此类mβps包括lmis、cpha和sfh-1。b3亚族金属β-内酰胺酶跟其他两类相比，只含有9个保守的残基，主要包括从临床致病菌中得到的u、gob-1和fez-1，其中gob-1酶己经有18种变异体，在gob酶中his16被谷氨酸盐替代，thin-b、mbl和bjp-1是从环境细菌中得到的。gmp中规定无菌药品(包括生物制品)的无菌生产工艺必须采用环境监测来评估生产环境控制是否达到gmp要求。监控项目包括空气悬浮粒子、空气浮游菌、沉降菌、设施和设备表面的微生物以及操作人员的卫生状况监测等。注射用碳青霉烯类广谱抗生素无菌分装间、功能间属于产尘功能间。碳青霉烯类抗生素粉尘落入监测用培养基平皿中，将降低平皿中培养基灵敏度，进而影响生产过程环境监控数据准确可靠性。监测用培养基平皿中添加金属β-内酰胺酶的量，以确保环境监测用监测皿培养基灵敏度适用于生产过程环境监控。开发高活性的金属β-内酰胺酶具有较高的商业价值。异源表达金属β-内酰胺酶突出的问题是，蛋白表达量低、金属β-内酰胺酶酶活低。因此，定点突变改造金属β-内酰胺酶，提高酶活，对于满足金属β-内酰胺酶工业化成产需求和降低生产成本有重要意义。本发明采用单点突变技术，基于同源建模方法，通过选择特定氨基酸优化金属β-内酰胺酶分子结构、提高酶活。技术实现要素：本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种酶活提高的金属β-内酰胺酶突变体及其构建方法，本发明的金属β-内酰胺酶突变体具有较高的酶活，对于满足金属β-内酰胺酶工业化成产需求和降低生产成本有重要意义。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种酶活提高的金属β-内酰胺酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如seqidno:1所示。作为本发明所述金属β-内酰胺酶突变体的优选实施方式，所述突变体在如seqidno:2所示的氨基酸序列的基础上，将第151位的脯氨酸突变成苏氨酸。作为本发明所述金属β-内酰胺酶突变体的优选实施方式，编码seqidno:2所示氨基酸序列的核苷酸序列如seqidno:4所示。表达核苷酸序列如seqidno:4所示的金属β-内酰胺酶的工程菌，为发明人之前研究所获得。第二方面，本发明提供了一种酶活提高的金属β-内酰胺酶突变体基因，所述基因编码上述酶活提高的金属β-内酰胺酶突变体。作为本发明所述金属β-内酰胺酶突变体基因的优选实施方式，所述基因的核苷酸序列如seqidno:3所示。第三方面，本发明提供了一种工程菌，所述工程菌表达上述金属β-内酰胺酶突变体。第四方面，本发明提供了上述工程菌的制备方法，包括以下步骤：在如seqidno:4所示的核苷酸序列的基础上，将第151位的脯氨酸突变成苏氨酸，得到突变体，将重组基因连接到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到dh5ɑ宿主菌中即得到工程菌。第五方面，本发明提供了上述酶活提高的金属β-内酰胺酶突变体在制备金属β-内酰胺酶中的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明采用单点突变技术，基于同源建模方法，通过选择特定氨基酸优化金属β-内酰胺酶分子结构、提高酶活，对于满足金属β-内酰胺酶工业化成产需求和降低生产成本有重要意义。附图说明图1为金属β-内酰胺酶突变体工程菌的发酵曲线图。图2为金属β-内酰胺酶突变体工程菌破碎裂解后上清的酶sds-page检测图。具体实施方式为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。实施例1定点突变以含有seqidno:4的重组质粒为模板质粒，参照takara生物产品及操作手册，利用takaramutanbest突变试剂盒，利用设计的相应突变引物对，pcr扩增出bmpga的定点突变序列，具体操作步骤如下：(1)突变引物正向引物vim-151-f为5’-gttgaaggttctgaaatcrhtacccactctctggaaggtc-3’，反向引物vim-151-r为5’-gaccttccagagagtgggtadygatttcagaaccttcaac-3’。(2)反应体系(10ul)10xpfu聚合酶缓冲液10ul，10mmol/ldntp溶液2ul，正向引物25pmoles，反向引物25pmoles，pfudna聚合酶5u，质粒dna模板100-200pg，加水至100ul。(3)pcr条件：94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃300s，30个循环，72℃10min。参考takara公司操作手册，对pcr获得的dna片断的5’末端进行磷酸化，然后将磷酸化的突变引物进行自身环化，接着转化dh5α感受态细胞，并涂布于加入卡纳硫酸霉素抗生素的lb选择性平板上，37℃倒置培养约20h。能在加入卡纳硫酸霉素抗生素的lb平板上长出来的就是转化有重组质粒的转化子。最后对转化子进一步培养以对重组质粒进行扩增，并抽提扩增的重组质粒。对筛选到的突变质粒进行测序，确定所获得的质粒在目的突变位点发生了突变而在非目的突变位点没有发生突变。实施例2工程菌的获得参照《分子克隆实验指南》的方法，将突变后的质粒转化大肠杆菌感受态细胞或酵母菌感受态细胞，获得表达突变酶的基因工程菌株，最后将工程菌株涂布于加入硫酸卡那霉素抗生素的lb选择性平板上，37℃倒置培养约12-18h，能在加入硫酸卡那霉素抗生素的lb平板上长出来的就是转化有重组质粒的转化子。实施例3工程菌发酵培养从lb选择性培养平板上挑单菌落，接种至3ml的lb液体培养基中，加入卡那霉素，至其终浓度为100μg/ml，于37℃下250r/min培养过夜；取2ml培养过夜的培养液，接种至200ml的lb液体培养基中，于37℃下250r/min培养4-6h，od600达到1.0-1.6之间，获得种子菌液。按1：15的接种量接入到含有3升tb培养基的5升发酵罐中，在37℃，400rpm，1.3vvm的发酵条件下，发酵培养至od600达到25时，调节温度为30℃，用终浓度为1％的iptg诱导，继续培养2小时后，再加入终浓度为0.5％iptg诱导，再继续培养约14-16小时，发酵结束。工程菌的发酵曲线图如图1所示，横坐标为时间，纵坐标为od600数值。数值越高，菌浓越高，收菌时od600达到58，达到工业化生产的要求。发酵液8000rpm离心20min，收集菌体，-20℃保存。取1ml发酵培养14-16小时的菌液，12000rpm离心1min，弃上清，然后用1ml20mm磷酸钾盐(ph7.0)重悬菌体，然后超声破碎细胞，进行sds-page检测。sds-page采用laemmli电泳方法，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为8％，还原样品与上样缓冲液混合后，100℃煮沸5分钟进行上样电泳。结果如图2所示，头孢菌素酶的分子量约为25kd，b为诱导前取样，其他为诱导不同时间点取样，结果显示诱导后8小时在25kd处出现了阳性条带，且随着诱导时间延长，蛋白累积，条带变深，表明金属β-内酰胺酶成功表达。实施例4突变酶的纯化量取5ml预处理的亲和载体fp-ida-ni2+，装入纯化柱中。样品按照1.0bv/h速度过柱。用3-5bv的washing缓冲液以1.0bv/h流速去除杂蛋白，同时利用蛋白核酸检测仪在280nm条件下检测流出液的蛋白含量，直到washing缓冲液澄清以及蛋白核酸检测仪的数值不再变化为止，最后在蛋白核酸检测仪280nm的监控下，用约1-2bv的elution缓冲液以1-2bv/h的速度洗脱目的酶，酶液4℃保存。实施例5酶水解活力的测定1、测定方法青霉素溶液的制备：称取青霉素钠(钾)适量，用磷酸盐缓冲液(ph7.0)溶解成每1ml中含青霉素1万单位的溶液。金属β-内酰胺酶稀释液的制备：取金属β-内酰胺酶发酵液/纯化后的酶，稀释1000-5000倍，在37℃预热。测定法：精密量取青霉素溶液50ml，置100ml量瓶中，预热至37℃后，精密加入已预热的金属β-内酰胺酶稀释液25ml，迅速混匀，在37℃准确放置1小时，精密量取3ml，立即加至已精密量取的碘滴定液(0.005mol/l)[精密量取碘滴定液(0.05mol/l)10ml，置100ml量瓶中，用醋酸钠缓冲液(ph4.5)稀释至刻度]25ml中，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/l)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失。空白试验：取已预热的青霉素溶液2ml，在37℃放置1小时，精密加入上述碘滴定液(0.005mol/l)25ml，然后精密加金属β-内酰胺酶稀释液1ml，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/l)滴定。按下式计算：e＝(b-a)×m×f×d×100；式中，e为金属β-内酰胺酶活力，单位/(ml·小时)；b为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml；a为供试品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml；m为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mol/l；f为在相同条件下，每1ml的上述碘滴定液(0.005mol/l)相当于青霉素的效价，单位；d为金属β-内酰胺酶溶液的稀释倍数。磷酸盐缓冲液(ph7.0)：取磷酸氢二钾7.36g与磷酸二氢钾3.14g，加水使成1000ml。醋酸钠缓冲液(ph4.5)：取冰醋酸13.86ml，加水使成250ml；另取结晶醋酸钠27.30g，加水使成200ml，两液混合均匀。2、测试结果酶水解活力的测试结果如表1所示。由表1可知，突变酶的水解底物的酶活为1.29×109u/l.h，相对于原始菌株(2.84×108u/l.h)提高了4.52倍。表1菌号氨基酸突变位点相对活力(％)原始菌株——100％金属β-内酰胺酶p151tp151t452％实施例6加酶tsa固体培养基制备及灵敏度测试配制tsa固体培养基，其中胰蛋白胨15.0g/l，大豆蛋白胨5.0g/l，氯化钠5.0g/l，琼脂14g/l，ph值7.5。将配置好的培养基于121℃下高压灭菌25分钟，待其冷却至50℃，加入金属β-内酰胺酶，混合均匀，使得金属β-内酰胺酶溶解在tsa培养基中的浓度为30万单位/ml。在超净工作台，将20mltsa加酶培养基均匀平铺于平皿底板，冷却凝固，盖上平皿上盖。往皿中加入碳青霉烯类抗生素10mg，按《中国药典》2015年版四部通则1105平皿法中的涂布法进行试验，计算回收率。藤黄微球菌(g+球菌)、皮氏罗尔斯顿菌(g－杆菌)及霉菌的回收率分别为99％、100％、100％，结果显示均有效中和碳青霉烯类抗生素10mg粉尘，灵敏度满足培养基的适用性试验，适用于碳青霉烯类抗生素日常环境沉降菌监测。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。sequencelisting<110>广州白云山拜迪生物医药有限公司<120>一种酶活提高的金属β-内酰胺酶突变体及其构建方法<130>20181220<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>267<212>prt<213>人工序列<400>1metphelysleuleuserlysleuleuvaltyrleuthralaserile151015metalailealaserproleualapheservalaspserserglyglu202530tyrprothrvalsergluileprovalglygluvalargleutyrgln354045ilealaaspglyvaltrpserhisilealathrargserpheaspgly505560alavaltyrproserasnglyleuilevalargaspglyaspgluleu65707580leuleuileaspthralatrpglyalalysasnthralaalaleuleu859095alagluileglulysglnileglyleuprovalthrargalavalser100105110thrhisphehisaspaspargvalglyglyvalaspvalleuargala115120125alaglyvalalathrtyralaserproserthrargargleualaglu130135140valgluglysergluilethrthrhisserleugluglyleuserser145150155160serglyaspalavalargpheglyprovalgluleuphetyrprogly165170175alaalahisserthraspasnleuvalvaltyrvalproseralaser180185190valleutyrglyglycysalailetyrgluleuserargthrserala195200205glyasnvalalaaspalaaspleualaglutrpprothrserileglu210215220argileglnglnhistyrproglualaglnphevalileproglyhis225230235240glyleuproglyglyleuaspleuleulyshisthrthrasnvalval245250255lysalahisthrasnargservalvalgluleu260265<210>2<211>267<212>prt<213>人工序列<400>2metphelysleuleuserlysleuleuvaltyrleuthralaserile151015metalailealaserproleualapheservalaspserserglyglu202530tyrprothrvalsergluileprovalglygluvalargleutyrgln354045ilealaaspglyvaltrpserhisilealathrargserpheaspgly505560alavaltyrproserasnglyleuilevalargaspglyaspgluleu65707580leuleuileaspthralatrpglyalalysasnthralaalaleuleu859095alagluileglulysglnileglyleuprovalthrargalavalser100105110thrhisphehisaspaspargvalglyglyvalaspvalleuargala115120125alaglyvalalathrtyralaserproserthrargargleualaglu130135140valgluglysergluileprothrhisserleugluglyleuserser145150155160serglyaspalavalargpheglyprovalgluleuphetyrprogly165170175alaalahisserthraspasnleuvalvaltyrvalproseralaser180185190valleutyrglyglycysalailetyrgluleuserargthrserala195200205glyasnvalalaaspalaaspleualaglutrpprothrserileglu210215220argileglnglnhistyrproglualaglnphevalileproglyhis225230235240glyleuproglyglyleuaspleuleulyshisthrthrasnvalval245250255lysalahisthrasnargservalvalgluleu260265<210>3<211>798<212>dna<213>人工序列<400>3atgttcaaactgctgtctaagctcctggtgtacctgaccgcatctatcatggctatcgct60tctccgctggctttctctgttgactcttctggcgaatacccgaccgtaagcgaaatcccg120gttggtgaagttcgtctgtaccagatcgctgacggtgtttggtctcacatcgctacccgt180tctttcgacggtgctgtttacccgtctaacggtctgatcgttcgtgacggtgacgaactg240ctgctgatcgacaccgcttggggtgctaaaaacaccgctgctctgctggctgaaatcgaa300aaacagatcggtctgccggttactcgtgctgtaagcacccacttccacgacgaccgtgtt360ggtggtgttgacgttctgcgtgctgctggtgttgctacctacgcttctccgtctacccgt420cgtctggctgaagttgaaggttctgaaatcactacccactctctggaaggtctgtcttct480tctggtgacgctgttcgtttcggtccggttgaactgttctacccgggtgctgctcactct540accgacaatctcgttgtgtacgtaccgtctgcttctgttctgtacggtggttgcgctatc600tacgaactgtctcgtacctctgctggtaacgttgctgacgctgacctggctgaatggccg660acctctatcgaacgtatccagcagcactacccggaagctcagttcgttatcccgggtcac720ggtctgccgggtggtctggacctgctgaaacacaccaccaacgttgttaaagctcacacc780aaccgttctgttgttgaa798<210>4<211>798<212>dna<213>人工序列<400>4atgttcaaactgctgtctaagctcctggtgtacctgaccgcatctatcatggctatcgct60tctccgctggctttctctgttgactcttctggcgaatacccgaccgtaagcgaaatcccg120gttggtgaagttcgtctgtaccagatcgctgacggtgtttggtctcacatcgctacccgt180tctttcgacggtgctgtttacccgtctaacggtctgatcgttcgtgacggtgacgaactg240ctgctgatcgacaccgcttggggtgctaaaaacaccgctgctctgctggctgaaatcgaa300aaacagatcggtctgccggttactcgtgctgtaagcacccacttccacgacgaccgtgtt360ggtggtgttgacgttctgcgtgctgctggtgttgctacctacgcttctccgtctacccgt420cgtctggctgaagttgaaggttctgaaatcccgacccactctctggaaggtctgtcttct480tctggtgacgctgttcgtttcggtccggttgaactgttctacccgggtgctgctcactct540accgacaatctcgttgtgtacgtaccgtctgcttctgttctgtacggtggttgcgctatc600tacgaactgtctcgtacctctgctggtaacgttgctgacgctgacctggctgaatggccg660acctctatcgaacgtatccagcagcactacccggaagctcagttcgttatcccgggtcac720ggtctgccgggtggtctggacctgctgaaacacaccaccaacgttgttaaagctcacacc780aaccgttctgttgttgaa798当前第1页12