肿瘤相关基因CDH1突变短肽及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及肿瘤相关基因突变抗原肽及其应用，特别涉及肿瘤相关基因cdh1突变短肽及其应用。

背景技术：

2017年2月，国家癌症中心发布了中国最新癌症报告。报告显示：在中国，每年新发癌症病例达429万，也就是说全国每天约1万人确诊癌症，每1分钟约7人确诊患癌。若中国人均预期寿命是85岁，那么每个人的累计患癌风险高达36％。在世界范围内，大约22％的新增癌症病例和27％的癌症死亡发生在中国。大部分癌症疾病早期缺乏特异的临床症状，在确诊时往往处于中晚期，针对中晚期肿瘤的治疗目主要是延长患者生存期。因此，解决癌症问题的出路在于预防。

癌症发生的具体机理尚未研究清楚，但可以肯定的是癌症由基因突变引起，这里说的突变包括基因碱基的点突变、缺失、插入，基因的非正常扩增以及基因的异常融合。1990年，ericft.fearon和bertvogelstein在《cell》上发表论文，提出肠癌癌变的模型，该过程显示基因突变远早于临床表现，可以作为癌症早期诊断标志物。斯特拉顿教授领导的研究小组，通过分析乳腺癌患者的基因组，解析了癌症发生发展的全过程。他们发现在癌变发生的过程中，多数乳腺癌患者在有临床症状之前，体内的癌变就已开始。如果以体细胞突变为起点算起，患者早在十余年前就已经患上癌症，而当时并无任何临床症状。因此，清除体内突变的体细胞是预防癌症的关键。

cdh1基因是位于染色体16q22.1的一种肿瘤抑制基因。它的功能是编码e-cadherin蛋白。e-cadherin是依赖性粘附的钙粘蛋白家族成员。e-钙粘蛋白的蛋白质被发现在上皮细胞，表示在人类发展的早期阶段。e-钙黏蛋白(cadherin)基因(cdh1基因)的损失与多种肿瘤有关，包括胃癌、大肠癌、乳腺癌和卵巢癌。目前，与癌症相关的驱动基因突变及其突变位点在各种癌症中的分布情况和突变几率，都收录在英国桑格研究所的cosmic数据库。cdh1的几个关键突变cosm19751、cosm20773、cosm1659131、cosm19774，这些突变位点在胃癌、胆管癌、乳腺癌中检出。

免疫学研究证实，cd8阳性t淋巴细胞ctl发挥细胞免疫的原理为，ctl细胞通过识别与mhc-i分子结合的抗原肽被激活，被激活的ctl可以杀死相应的靶细胞，发挥免疫监视作用。

发明人通过t细胞表位预测综合平台netctl数据库(http://www.cbs.dtu.dk/services/netctl)在线分析，通过生物信息学预测，发现cosm19751，cosm20773、cosm1659131、cosm19774的突变多肽能够与mhc-i类分子结合，说明该位点是免疫清除cdh1基因突变细胞的重要靶点。

技术实现要素：

基于此，本发明提供肿瘤相关基因cdh1突变短肽及其应用。

本发明采取的技术方案是：

cdh1突变短肽，其序列为seqidno:2-seqidno:21中的一条。

如seqidno:2-seqidno:21所述的cdh1突变短肽能够诱导特异性细胞毒性t淋巴细胞的产生。

特异性细胞毒性t淋巴细胞的诱导方法，使用seqidno:2-seqidno:21的cdh1突变短肽中的至少一条经抗原提呈细胞与cd8⁺t细胞共培养，诱导得到cdh1突变特异性细胞毒性t细胞。

一种多肽疫苗，由活性抗原成分和辅剂组成，活性抗原成分为如seqidno:2-seqidno:21所述的cdh1突变短肽中的至少一条。

一种用于cdh1突变防治的dc疫苗，主要由seqidno:2-seqidno:21所述的cdh1突变短肽中的至少一条和树突状细胞加载得到。

本发明通过生物信息学技术预测cdh1突变序列与t淋巴细胞受体(tcr)及mhci类分子的结合能力，同时分析其表达定位于细胞膜外，筛选出多肽序列：seq:2-21，所筛选出的cdh1抗原肽具有与dc细胞上mhci分子高度的亲和力并能有效地刺激、诱导产生特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctls)，说明其具备良好的多肽疫苗及dc疫苗的潜力，并且提示其具有良好的临床转化及疾病预防前景。

附图说明：

图1是cdh1seq2特异性ctlifn-γ释放实验；

图2是cdh1seq6特异性ctlifn-γ释放实验；

图3是cdh1seq9特异性ctlifn-γ释放实验；

图4是cdh1seq17特异性ctlifn-γ释放实验；

图5是cdh1seq19特异性ctlifn-γ释放实验。

具体实施方式

cdh1基因是位于染色体16q22.1的一种肿瘤抑制基因(其核苷酸序列如seqidno:23所示)，它的功能是编码e-cadherin蛋白，e-cadherin是依赖性粘附的钙粘蛋白家族成员。e-钙粘蛋白主要存在于人和动物上皮细胞，对于维持上皮细胞形态和组织完整性发挥重要作用，也抑制肿瘤的侵袭转移，影响原发肿瘤的早期生长和诱发肿瘤的增殖生长。其氨基酸序列为：(seqidno:1)

下面结合实验，进一步地说明本发明的技术方案。

chd1基因突变肽的t细胞表位预测：

本发明通过t细胞表位预测数据综合平台(http://www.cbs.dtu.dk/services/netctl)，预测与t细胞表位及mhci类分子高亲和力的多肽序列，所得候选肽由专业公司合成，多肽序列具体如表1：

表1

基于预测结果，本发明随机挑选其中5条进行实验，具体实验如下：

cdh1突变短肽特异性ctl克隆建立的操作如下:

同一健康捐献者的10⁵个cd8⁺t细胞通过负载cdh1突变短肽的10⁴个mo-dcs间隔1周刺激2次后，再通过自体10⁵个丝裂霉素c处理过的负载cdh1短肽的pbmc刺激1次后，经标准细胞毒试验筛选获得。

t2细胞加载5umcdh1突变短肽作为靶细胞，ctl的cdh1短肽特异性细胞毒性通过ldh释放试验得以证实。

采用以上体外诱导建立cdh1基因突变短肽特异性ctl克隆的方法，本发明还建立了mhc-i限制性ctl克隆，通过ifn-γ释放试验证实其多肽特异性免疫应答效应，如图1至图5，其中，

图1：1表示seqidno:2多肽,2表示pbs磷酸盐缓冲液，3表示controlpeptide无关对照肽；

图2：1表示seqidno:6多肽,2表示pbs磷酸盐缓冲液，3表示controlpeptide无关对照肽；

图3：1表示seqidno:9多肽,2表示pbs磷酸盐缓冲液，3表示controlpeptide无关对照肽；

图4：1表示seqidno:17多肽,2表示pbs磷酸盐缓冲液，3表示controlpeptide无关对照肽；

图5：1表示seqidno:19多肽,2表示pbs磷酸盐缓冲液，3表示controlpeptide无关对照肽。

上述实验数据表明，本发明所建立的ctl表位是极其有效的，预测结果与实验结果符合性非常好。

可见，通过将上述的cdh1突变短肽中的至少一条(seqidno:2-seqidno:21)经抗原提呈细胞与细胞毒性淋巴t细胞共培养，可诱导筛选得到cdh1突变特异性细胞毒性t淋巴细胞。这种cdh1突变抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞可用于cdh1基因突变细胞的免疫清除，预防相关疾病的发生，尤其是肿瘤疾病。

将上述cdh1短肽中的至少一条(seqidno:2-seqidno:21)与树突状细胞(dendriticcell,dc)加载回输，可以作为dc疫苗用于疾病预防，刺激机体产生多肽特异性抗细胞毒性t细胞，进而实现cdh1基因突变相关疾病的预防，尤其是肿瘤的预防。

本发明的cdh1短肽长度较短，化学合成难度小，可以直接合成得到高纯的产物，应用成本大大降低，同时效果明确，具有很好的应用潜力。

序列表

<110>生命谷（海南）生物科技股份有限公司

<120>肿瘤相关基因cdh1突变短肽及其应用

<160>22

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

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