高斯荧光素酶和地高辛单链抗体的融合蛋白及其应用的制作方法

文档序号：21087779发布日期：2020-06-12 17:00阅读：803来源：国知局

本发明涉及抗体技术领域，具体涉及一种高斯荧光素酶和地高辛单链抗体的融合蛋白及其应用。

背景技术：

荧光素酶(luciferase)是生物体内能够产生生物发光的酶的总称。由于其自发光效应而被广泛应用作为报告基因。在检测等方面的应用也越来越广泛。荧光素酶的种类包括：细菌荧光素酶(bacterialluciferase，bluc)、萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase，fluc)、海肾荧光素酶(renillaluciferase，rluc)和高斯荧光素酶(gaussialuciferase，gluc)。其中高斯荧光素酶发光活性较其他种类荧光素酶活性高100倍以上。高斯荧光素酶是来源于海洋桡脚类生物(gaussiaprinceps)体内的一种荧光素酶，大小19.9kda，只有185个氨基酸，可以被细胞分泌到细胞外，反应只需要腔肠素和氧气参与。目前高斯荧光素酶广泛作为报告基因使用。通过将高斯荧光素酶与目的蛋白共表达，使得能够对目的蛋白进行定位示踪等研究。由于其发现较其他荧光素酶晚，因此对其开发应用较少。特别是在检测方面的应用特别少。因此对其开发应用是具有广泛应用前景。

地高辛被广泛应用于临床治疗心力衰竭及心律失常的强心苷类药物。同时地高辛作为分子靶标在检测研究方面具有广泛应用。特别是在临床诊断、科研检测实验方面，将地高辛作为靶标或标记，进而利用地高辛抗体特异性识别靶标，进行分子诊断或分子定位方面的研究应用更是越来越多。

目前地高辛抗体作为诊断或者检测手段大都是通过地高辛抗体识别地高辛靶标后，利用二抗识别地高辛抗体进行放大，最后利用二抗上带有的标签进行显色反应。这样检测就需要两步或者更多步骤才能完成。而另外一种方式是在地高辛抗体上加上荧光标签。荧光标签需要吸收激发光后，才能发射荧光被检测器接收信号，检测过程需要荧光显微镜等硬件设施，因此应用被限制。目前市场上尚未有地高辛抗体上加上荧光标签的产品。但是可以通过组合拥有类似功能。通过生物素(biotin)修饰地高辛抗体后，再使用sa-glu偶联产品进行放大，能够特异性识别地高辛并且实现自发光检测。但是，这种抗体联用法过程繁琐，耗时较长。

技术实现要素：

本发明提供一种高斯荧光素酶和地高辛单链抗体的融合蛋白及其应用，本发明的融合蛋白保留了两部分蛋白的活性，一方面能够特异性地与地高辛结合，另一方面能够发挥荧光素酶自发光的优势，实现特异性结合靶标地高辛的同时自发光检测，可应用于临床检测或相关科学研究。

根据第一方面，一种实施例中提供一种高斯荧光素酶和地高辛单链抗体的融合蛋白，该融合蛋白包括地高辛单链抗体的重链可变区、轻链可变区和高斯荧光素酶或持续发光突变体，上述重链可变区与上述轻链可变区之间通过第一柔性肽连接，上述高斯荧光素酶或持续发光突变体与上述重链可变区或上述轻链可变区之间通过第二柔性肽连接。

在优选实施例中，上述重链可变区序列如seqidno：1所示。

在优选实施例中，上述轻链可变区序列如seqidno：2所示。

在优选实施例中，上述高斯荧光素酶序列如seqidno：3所示。

在优选实施例中，上述持续发光突变体序列如seqidno：4所示。

在优选实施例中，上述第一柔性肽和上述第二柔性肽各自独立地选自如seqidno：5和seqidno：6所示的序列。

在优选实施例中，上述第一柔性肽是seqidno：5所示的序列；上述第二柔性肽是seqidno：6所示的序列。

在优选实施例中，上述融合蛋白还包括：信号肽，该信号肽用于引导上述融合蛋白从表达细胞内向外分泌。

在优选实施例中，上述信号肽位于上述融合蛋白的n端。

在优选实施例中，上述信号肽序列如seqidno：7所示。

在优选实施例中，上述融合蛋白还包括：融合标签，该融合标签用于亲和纯化上述融合蛋白。

在优选实施例中，上述融合标签是6×组氨酸标签。

在优选实施例中，上述融合标签位于融合蛋白c端。

在优选实施例中，上述融合蛋白的序列如seqidno：8或seqidno：9所示。

根据第二方面，一种实施例中提供一种分离的核酸，该分离的核酸编码第一方面的融合蛋白。

在优选实施例中，上述分离的核酸包括地高辛单链抗体的重链可变区编码序列、轻链可变区编码序列和高斯荧光素酶编码序列或持续发光突变体编码序列，上述重链可变区编码序列与上述轻链可变区编码序列之间通过第一连接序列连接，上述高斯荧光素酶编码序列或持续发光突变体编码序列与上述重链可变区编码序列或上述轻链可变区编码序列之间通过第二连接序列连接。

在优选实施例中，上述重链可变区编码序列如seqidno：10所示。

在优选实施例中，上述轻链可变区编码序列如seqidno：11所示。

在优选实施例中，上述高斯荧光素酶编码序列如seqidno：12所示。

在优选实施例中，上述持续发光突变体编码序列如seqidno：13所示。

在优选实施例中，上述第一连接序列和上述第二连接序列各自独立地选自如seqidno：14和seqidno：15所示的序列。

在优选实施例中，上述第一连接序列是seqidno：14所示的序列；上述第二连接序列是seqidno：15所示的序列。

在优选实施例中，上述分离的核酸还包括：信号肽编码序列，该信号肽编码序列编码信号肽，该信号肽用于引导上述融合蛋白从表达细胞内向外分泌。

在优选实施例中，上述信号肽编码序列位于上述分离的核酸的5’端。

在优选实施例中，上述信号肽编码序列如seqidno：16所示。

在优选实施例中，上述分离的核酸还包括融合标签编码序列，该融合标签编码序列用于编码融合标签，该融合标签用于亲和纯化上述融合蛋白。

在优选实施例中，上述融合标签编码序列是编码6×组氨酸标签的序列。

在优选实施例中，上述融合标签编码序列位于分离的核酸的3’端。

在优选实施例中，上述分离的核酸序列如seqidno：17或seqidno：18所示。

根据第三方面，一种实施例中提供一种表达载体，该表达载体包括编码第一方面的融合蛋白的核酸序列，以及载体骨架序列。

根据第四方面，一种实施例中提供一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞内包含第三方面的表达载体。

根据第五方面，一种实施例中提供第一方面的融合蛋白、第二方面的分离的核酸、第三方面的表达载体或第四方面的重组宿主细胞在地高辛分子检测中的用途。

本发明的高斯荧光素酶和地高辛单链抗体的融合蛋白，一方面可特异性识别地高辛，另一方面具有自发光的功能，便于检测。相对于现有的通过偶联放大检测地高辛的方式，本发明的融合蛋白具有工艺简单、便于生产、使用简便、耗时较短的优点。

附图说明

图1为本发明实施例中融合蛋白表达载体的构建原理流程示意图，地高辛单链抗体的重链(hchain)可变区编码序列与轻链(lchain)可变区编码序列(其包括信号肽signalpeptide编码序列)通过第一连接序列(linker1)连接，地高辛单链抗体的重链(hchain)可变区编码序列与高斯荧光素酶(gluc)编码序列通过第二连接序列(linker2)连接，得到融合蛋白(fusionprotein)编码序列，然后整体连入载体骨架序列pcdna3.1(+)中，得到重组融合蛋白表达载体。

图2为本发明实施例中antidigscfv-gluc融合蛋白sds-page鉴定及westernblot鉴定图，泳道1：antidigscfv-gluc融合蛋白，泳道m：marker。

图3为本发明实施例中antidigscfv-gluc融合蛋白抗体部分elisa检测其对地高辛的结合力实验结果图，其中antidigscfv-gluc表示野生型融合蛋白，antidigscfv-g2l表示突变体融合蛋白，antidigscfv表示地高辛单链抗体，gluc表示高斯荧光素酶，g2l表示高斯荧光素酶持续发光突变体，横坐标表示浓度(concentration)值，纵坐标表示od450nm吸光值。

图4为本发明实施例中antidigscfv-gluc融合蛋白生物发光检测实验结果图，其中antidigscfv-gluc表示融合蛋白，antidigscfv-g2l表示突变体融合蛋白，antidigscfv表示地高辛单链抗体，gluc表示高斯荧光素酶，g2l表示高斯荧光素酶持续发光突变体，横坐标表示时间(time)，纵坐标表示发光强度(clvalues)。

图5为本发明实施例中antidigscfv-gluc融合蛋白双功能活性检测实验结果图，其中antidigscfv-gluc表示融合蛋白，antidigscfv-g2l表示突变体融合蛋白，antidigscfv表示地高辛单链抗体，gluc表示高斯荧光素酶，g2l表示高斯荧光素酶持续发光突变体，横坐标表示浓度(concentration)值，纵坐标表示发光强度(clvalues)。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

本文中“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。

本发明提供一种高斯荧光素酶和地高辛单链抗体的融合蛋白，该融合蛋白是靶向地高辛的抗体融合蛋白，该融合蛋白是以地高辛单链抗体和高斯荧光素酶或持续发光突变体为基础，通过基因重组构建成的融合蛋白，地高辛单链抗体和高斯荧光素酶或持续发光突变体通过柔性肽连接起来。

具体而言，本发明的融合蛋白包括地高辛单链抗体的重链(h链)可变区、轻链(l链)可变区和高斯荧光素酶(gluc)或持续发光突变体，重链可变区与轻链可变区之间通过第一柔性肽连接，高斯荧光素酶或持续发光突变体与重链可变区或轻链可变区之间通过第二柔性肽连接。

本发明的融合蛋白中，地高辛单链抗体的重链(h链)可变区、轻链(l链)可变区和高斯荧光素酶(gluc)或持续发光突变体的连接方式有多种，例如，从蛋白的n端至c端可以是依次为h+l+gluc、l+h+gluc、gluc+l+h或gluc+h+l四种连接方式。在优选实施例中，采用h+l+gluc连接方式。

在优选实施例中，重链可变区序列如下seqidno：1所示：

qvqllqsaaevkkpgeslkisckgsgysftsywigwvrqmpgkglewmgiiypgdsdtryspsfqgqvtisadksistaylqwsslkasdtavyycaraspsgfdywgqgtlvtvss(seqidno：1)。

在优选实施例中，轻链可变区序列如下seqidno：2所示：

qsvltqppsasgtpgqrvtiscsgsssnigsnyvywyqqlpgtapklliyrnnqrpsgvpdrfsgsksgtsaslaisglrsedeadyycaawddslravvfgggtkltvlgg(seqidno：2)。

在优选实施例中，高斯荧光素酶序列如下seqidno：3所示：

kptennedfnivavasnfattdldadrgklpgkklplevlkemeanarkagctrgcliclshikctpkmkkfipgrchtyegdkesaqggigeaivdipeipgfkdlepmeqfiaqvdlcvdcttgclkglanvqcsdllkkwlpqrcatfaskiqgqvdkikgaggd(seqidno：3)。

在优选实施例中，持续发光突变体序列如下seqidno：4所示：

kptennedfnivavasnfattdldadrgklpgkklplevlkeleanarkagctrgcliclshikctpkmkkfipgrchtyegdkesaqggigeaivdipeipgfkdlepleqfiaqvdlcvdcttgclkglanvqcsdllkkwlpqrcatfaskiqgqvdkikgaggd(seqidno：4)。

需要说明的是，本发明的融合蛋白除了采用上述seqidno：1～3所示的序列连接而成或seqidno：1～2和seqidno：4所示的序列连接而成以外，也包括虽然序列有一定差别但具有相同功能的序列形式。例如，对于重链可变区而言，可以是与seqidno：1序列有一些差别但是也具有相应抗原表位特性的序列，如在seqidno：1序列两端增加或减少若干氨基酸但保持相同抗原表位特性的序列；对于轻链可变区而言，可以是与seqidno：2序列有一些差别但是也具有相应抗原表位特性的序列，如在seqidno：2序列两端增加或减少若干氨基酸但保持相同抗原表位特性的序列；对于高斯荧光素酶而言，可以是与seqidno：3有一些差别但是也具有高斯荧光素酶活性的序列，如在seqidno：3序列两端增加或减少若干氨基酸但保持相同高斯荧光素酶活性的序列。

本发明的融合蛋白中，具有连接作用的第一柔性肽和第二柔性肽可以分别独立地选自如下序列：

ggggsggggsggs(seqidno：5)；

ggggsggggs(seqidno：6)；

gqgqgqgqgqg(seqidno：19)；

gstsgsgkssekgkg(seqidno：20)；

vpgvgvpgvg(seqidno：21)；

sapgtpsr(seqidno：22)；

egkssgsgseskef(seqidno：23)；

gsggsg(seqidno：24)。

第一柔性肽和第二柔性肽均可以是上述序列中的任意一种，二者可以是相同的序列，也可是不同的序列。

在优选实施例中，第一柔性肽和第二柔性肽各自独立地选自如下序列：

ggggsggggsggs(seqidno：5)；ggggsggggs(seqidno：6)。

第一柔性肽和第二柔性肽可以是相同的序列或不同的序列。

在优选实施例中，第一柔性肽是seqidno：5所示的序列；第二柔性肽是seqidno：6所示的序列。

在优选实施例中，融合蛋白还包括：信号肽，该信号肽用于引导融合蛋白从表达细胞内向外分泌。

信号肽可以位于本发明的融合蛋白的n端或c端，在不影响本发明的融合蛋白中的亲和活性和发光活性的情况下，在优选实施例中，信号肽位于上述融合蛋白的n端。

在优选实施例中，信号肽序列如下seqidno：7所示：

mgvkvlfaliciavaea(seqidno：7)。

本发明中，可用于纯化融合蛋白的方法，包括但不局限于：镍柱纯化、离子交换层析(q柱、p柱)、疏水层析、肝素柱层析、硫酸铵沉淀法等。

在优选实施例中，本发明的融合蛋白还包括：融合标签，该融合标签用于亲和纯化该融合蛋白。具体而言，融合标签与各种纯化方法中使用的纯化装置(如纯化柱)亲和结合，然后通过适当方法获取纯化的融合蛋白。融合标签可以位于本发明的融合蛋白的n端或c端，优选位于c端，不影响本发明的融合蛋白中的抗体活性和发光活性。

融合标签可以是6×组氨酸标签(6×histag)，以及gst、mbp、sumo等其他融合标签，根据融合标签不同，选用融合标签相对应的亲和纯化方法。在优选实施例中，融合标签是6×组氨酸标签。

在一个最优选的实施例中，本发明的融合蛋白具有如下seqidno：8或seqidno：9所示的：

mgvkvlfaliciavaeaqvqllqsaaevkkpgeslkisckgsgysftsywigwvrqmpgkglewmgiiypgdsdtryspsfqgqvtisadksistaylqwsslkasdtavyycaraspsgfdywgqgtlvtvssggggsggggsggsqsvltqppsasgtpgqrvtiscsgsssnigsnyvywyqqlpgtapklliyrnnqrpsgvpdrfsgsksgtsaslaisglrsedeadyycaawddslravvfgggtkltvlggggggsggggskptennedfnivavasnfattdldadrgklpgkklplevlkemeanarkagctrgcliclshikctpkmkkfipgrchtyegdkesaqggigeaivdipeipgfkdlepmeqfiaqvdlcvdcttgclkglanvqcsdllkkwlpqrcatfaskiqgqvdkikgaggdhhhhhh(seqidno：8)。

mgvkvlfaliciavaeaqvqllqsaaevkkpgeslkisckgsgysftsywigwvrqmpgkglewmgiiypgdsdtryspsfqgqvtisadksistaylqwsslkasdtavyycaraspsgfdywgqgtlvtvssggggsggggsggsqsvltqppsasgtpgqrvtiscsgsssnigsnyvywyqqlpgtapklliyrnnqrpsgvpdrfsgsksgtsaslaisglrsedeadyycaawddslravvfgggtkltvlggggggsggggskptennedfnivavasnfattdldadrgklpgkklplevlkeleanarkagctrgcliclshikctpkmkkfipgrchtyegdkesaqggigeaivdipeipgfkdlepleqfiaqvdlcvdcttgclkglanvqcsdllkkwlpqrcatfaskiqgqvdkikgaggdhhhhhh(seqidno：9)。

其中，带下划线的序列(mgvkvlfaliciavaea)表示信号肽；带下划线的序列(ggggsggggsggs)表示连接地高辛单链抗体的重链(h链)可变区和轻链(l链)可变区的第一柔性肽；带下划线的序列(ggggsggggs)表示连接轻链(l链)可变区和高斯荧光素酶(gluc)的第二柔性肽；带下划线的序列(hhhhhh)表示6×组氨酸标签序列。

本发明的融合蛋白，可以通过如下方法获取：利用pcr技术将筛选获得的高斯荧光素酶或持续发光突变体基因与地高辛单链抗体基因进行克隆重组，构建地高辛单链抗体/高斯荧光素酶或持续发光突变体融合蛋白重组载体，电转入宿主表达细胞(例如cho细胞)中，将融合蛋白基因整合到染色体上，利用新霉素g418筛选高表达融合抗体的稳定细胞株；对稳定细胞株扩大培养，低温离心取上清，将上清过镍柱分离纯化；然后westernblot鉴定分离纯化得到的融合蛋白；elisa实验鉴定融合蛋白抗体部分的亲和活性；酶活实验鉴定荧光素酶部分的自发光活性。融合蛋白均良好地保留了两部分蛋白的活性。

本发明的一种实施例提供一种分离的核酸，该分离的核酸编码本发明的融合蛋白。

在优选实施例中，分离的核酸包括地高辛单链抗体的重链可变区编码序列、轻链可变区编码序列和高斯荧光素酶编码序列或持续发光突变体编码序列，重链可变区编码序列与轻链可变区编码序列之间通过第一连接序列连接，高斯荧光素酶编码序列或持续发光突变体编码序列与重链可变区编码序列或轻链可变区编码序列之间通过第二连接序列连接。

需要说明的是，由于密码子的简并性，编码同一个多肽或蛋白的核苷酸序列可以不同，因此本发明的分离的核酸只要能够编码本发明的融合蛋白即可。对于序列没有特别限定。

在优选实施例中，重链可变区编码序列如下seqidno：10所示：

caggtgcagctgctgcagagcgccgctgaggtgaagaagccaggcgagtccctgaagatcagctgtaagggctccggctatagcttcacatcttactggatcggctgggtgagacagatgcccggcaagggcctggagtggatgggcatcatctatcccggcgactctgatacccgctacagcccttcttttcagggccaggtgaccatctccgctgataagtccatcagcacagcctatctgcagtggtccagcctgaaggcttctgatacagccgtgtactattgcgctagggcctctccctccggctttgactactggggccagggcaccctggtgacagtgtcttcc(seqidno：10)。

在优选实施例中，轻链可变区编码序列如下seqidno：11所示：

cagtctgtgctgacccagccaccttccgctagcggaacccctggacagagggtgacaatctcttgttccggcagctcttccaacatcggctctaattacgtgtattggtaccagcagctgcctggcacagccccaaagctgctgatctataggaacaatcagaggccatccggagtgcctgatcggttcagcggatctaagtccggcacctccgcctccctggctatctctggcctgaggtccgaggatgaggctgactactattgcgctgcttgggacgattccctgagggctgtggtgtttggaggaggaaccaagctgacagtgctgggcgga(seqidno：11)。

在优选实施例中，高斯荧光素酶编码序列如下seqidno：12所示：

aagccaacagagaacaatgaggacttcaacatcgtggctgtggccagcaattttgctaccacagacctggatgccgacagaggcaagctgccaggcaagaagctgcccctggaggtgctgaaggagatggaggctaacgccagaaaggctggctgtacccgcggctgcctgatctgtctgtcccacatcaagtgcacacctaagatgaagaagttcatcccaggccgctgtcatacctacgagggcgataaggagtccgcccagggaggaatcggagaggccatcgtggatatcccagagatccccggcttcaaggacctggagcctatggagcagtttatcgctcaggtggatctgtgcgtggactgtaccacaggctgcctgaagggcctggccaatgtgcagtgtagcgacctgctgaagaagtggctgccacagcggtgcgctacctttgcctctaagatccagggccaggtggataagatcaagggagctggaggcgac(seqidno：12)。

在优选实施例中，持续发光突变体编码序列如下seqidno：13所示：aagccaacagagaacaatgaggatttcaacatcgtggctgtggccagcaattttgctaccacagacctggatgccgacagaggcaagctgccaggcaagaagctgcccctggaggtgctgaaggagctcgaggctaacgctaggaaggctggatgtaccaggggatgcctgatctgtctgtctcacatcaagtgcacacctaagatgaagaagttcatcccaggccgctgtcatacctacgagggcgataaggagtccgctcagggaggaatcggagaggccatcgtggatatccccgagatccctggcttcaaggacctggagcccctcgagcagtttatcgctcaggtggatctgtgcgtggactgtaccacaggctgcctgaagggcctggccaatgtgcagtgttccgacctgctgaagaagtggctgcctcagaggtgcgctacctttgccagcaagatccagggccaggtggataagatcaagggagctggaggcgac(seqidno：13)。

在优选实施例中，第一连接序列和第二连接序列各自独立地选自如下序列：

ggaggaggaggaagcggaggaggaggatctggaggaagc(seqidno：14)；ggaggaggaggatccggcggaggtggaagt(seqidno：15)。

第一连接序列和第二连接序列可以是相同的序列或不同的序列。

在优选实施例中，第一连接序列是seqidno：14所示的序列；第二连接序列是seqidno：15所示的序列。

在优选实施例中，分离的核酸还包括：信号肽编码序列，该信号肽编码序列编码信号肽，该信号肽用于引导融合蛋白从表达细胞内向外分泌。

由于本发明的融合蛋白中信号肽可以位于融合蛋白的n端或c端，因此信号肽编码序列可以位于分离的核酸的5’端或3’端。在不影响本发明的融合蛋白中的亲和活性和发光活性的情况下，信号肽位于上述融合蛋白的n端，因此在优选实施例中，信号肽编码序列位于分离的核酸的5’端。

在优选实施例中，信号肽编码序列如下seqidno：16所示：

atgggcgtgaaggtgctgttcgccctgatctgcatcgccgtggctgaggcc(seqidno：16)。

在优选实施例中，分离的核酸还包括融合标签编码序列，该融合标签编码序列用于编码融合标签，该融合标签用于亲和纯化上述融合蛋白。

在优选实施例中，融合标签编码序列是编码6×组氨酸标签的序列。

融合标签编码序列可以位于分离的核酸的3’端或5’端，在优选实施例中，融合标签编码序列位于分离的核酸的3’端，不影响抗体活性和发光活性部分蛋白的表达。

在一个最优选的实施例中，本发明的分离的核酸序列如seqidno：17或seqidno：18所示：

atgggcgtgaaggtgctgttcgccctgatctgcatcgccgtggctgaggcccaggtgcagctgctgcagagcgccgctgaggtgaagaagccaggcgagtccctgaagatcagctgtaagggctccggctatagcttcacatcttactggatcggctgggtgagacagatgcccggcaagggcctggagtggatgggcatcatctatcccggcgactctgatacccgctacagcccttcttttcagggccaggtgaccatctccgctgataagtccatcagcacagcctatctgcagtggtccagcctgaaggcttctgatacagccgtgtactattgcgctagggcctctccctccggctttgactactggggccagggcaccctggtgacagtgtcttccggaggaggaggaagcggaggaggaggatctggaggaagccagtctgtgctgacccagccaccttccgctagcggaacccctggacagagggtgacaatctcttgttccggcagctcttccaacatcggctctaattacgtgtattggtaccagcagctgcctggcacagccccaaagctgctgatctataggaacaatcagaggccatccggagtgcctgatcggttcagcggatctaagtccggcacctccgcctccctggctatctctggcctgaggtccgaggatgaggctgactactattgcgctgcttgggacgattccctgagggctgtggtgtttggaggaggaaccaagctgacagtgctgggcggaggaggaggaggatccggcggaggtggaagtaagccaacagagaacaatgaggacttcaacatcgtggctgtggccagcaattttgctaccacagacctggatgccgacagaggcaagctgccaggcaagaagctgcccctggaggtgctgaaggagatggaggctaacgccagaaaggctggctgtacccgcggctgcctgatctgtctgtcccacatcaagtgcacacctaagatgaagaagttcatcccaggccgctgtcatacctacgagggcgataaggagtccgcccagggaggaatcggagaggccatcgtggatatcccagagatccccggcttcaaggacctggagcctatggagcagtttatcgctcaggtggatctgtgcgtggactgtaccacaggctgcctgaagggcctggccaatgtgcagtgtagcgacctgctgaagaagtggctgccacagcggtgcgctacctttgcctctaagatccagggccaggtggataagatcaagggagctggaggcgaccaccatcaccatcaccat(seqidno：17)。

atgggcgtgaaggtgctgttcgccctgatctgcatcgccgtggctgaggcccaggtgcagctgctgcagagcgccgctgaggtgaagaagccaggcgagtccctgaagatcagctgtaagggctccggctatagcttcacatcttactggatcggctgggtgagacagatgcccggcaagggcctggagtggatgggcatcatctatcccggcgactctgatacccgctacagcccttcttttcagggccaggtgaccatctccgctgataagtccatcagcacagcctatctgcagtggtccagcctgaaggcttctgatacagccgtgtactattgcgctagggcctctccctccggctttgactactggggccagggcaccctggtgacagtgtcttccggaggaggaggaagcggaggaggaggatctggaggaagccagtctgtgctgacccagccaccttccgctagcggaacccctggacagagggtgacaatctcttgttccggcagctcttccaacatcggctctaattacgtgtattggtaccagcagctgcctggcacagccccaaagctgctgatctataggaacaatcagaggccatccggagtgcctgatcggttcagcggatctaagtccggcacctccgcctccctggctatctctggcctgaggtccgaggatgaggctgactactattgcgctgcttgggacgattccctgagggctgtggtgtttggaggaggaaccaagctgacagtgctgggcggaggaggaggaggatccggcggaggtggaagtaagccaacagagaacaatgaggatttcaacatcgtggctgtggccagcaattttgctaccacagacctggatgccgacagaggcaagctgccaggcaagaagctgcccctggaggtgctgaaggagctcgaggctaacgctaggaaggctggatgtaccaggggatgcctgatctgtctgtctcacatcaagtgcacacctaagatgaagaagttcatcccaggccgctgtcatacctacgagggcgataaggagtccgctcagggaggaatcggagaggccatcgtggatatccccgagatccctggcttcaaggacctggagcccctcgagcagtttatcgctcaggtggatctgtgcgtggactgtaccacaggctgcctgaagggcctggccaatgtgcagtgttccgacctgctgaagaagtggctgcctcagaggtgcgctacctttgccagcaagatccagggccaggtggataagatcaagggagctggaggcgaccaccatcaccatcaccat(seqidno：18)。

其中，序列中，从5’端至3’端带下划线的序列分别是信号肽编码序列，用于连接地高辛单链抗体的重链可变区编码序列与轻链可变区编码序列的第一连接序列连接，用于连接轻链可变区编码序列与高斯荧光素酶编码序列的第二连接序列，以及用于编码6×组氨酸标签的序列。

本发明的一种实施例提供一种表达载体，该表达载体包括编码本发明的融合蛋白的核酸序列，以及载体骨架序列。其中，载体骨架序列可以是任何合适的表达载体序列，例如，在一个实施例中，载体骨架序列是pcdna3.1(+)。

本发明的一种实施例提供一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞内包含本发明的表达载体。宿主细胞可以是任何能够表达本发明的融合蛋白的宿主细胞，例如，在一个实施例中，是cho细胞。

本发明还提供融合蛋白、分离的核酸、表达载体或重组宿主细胞在地高辛分子检测中的用途。

本发明的用途在于检测地高辛分子，该地高辛分子可以是独立存在的游离的地高辛分子，也可以是与合适的蛋白等结合的形式，通过检测这种蛋白上结合的地高辛分子能够间接地检测该蛋白。

以下通过实施例详细说明本发明的技术方案，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。

实施例1融合蛋白(fusionprotein)重组表达载体pcdna3.1-antidigscfv-gluc的构建

如图1所示，分别以地高辛抗体重、轻链基因，高斯荧光素酶基因及pcdna3.1质粒为模板，设计并合成引物进行pcr扩增。融合蛋白antidigscfv-gluc的构建以地高辛抗体重链基因(hchain)及轻链基因(lchain)为基础，利用第一连接序列(linker1)(ggggsggggsggggs)连接，进行重叠pcr延伸扩增获得完整的scfv基因。pcr产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因。再以上述产物及gluc基因为基础，利用第二连接序列(linker2)(ggggs)连接，重叠pcr延伸扩增获得完整的antidigscfv-gluc基因(序列如seqidno：17)，最后进行pcr扩增终产物及质粒pcdna3.1用限制性内切酶进行双酶切，酶切产物切胶回收后，用t4连接酶16℃过夜连接。连接后转化大肠杆菌hb2151感受态，涂布平板，次日挑取单克隆双酶切及测序鉴定。

突变体g2l融合表达载体在成功制备的野生型融合蛋白表达载体基础上，通过设计含突变基因的引物进行质粒pcr(其中，antidigscfv-g2l基因序列如seqidno：18所示)，然后将pcr产物用dpni酶处理，37℃反应2h。产物转化top10感受态细胞，涂布于含100ng/μl氨苄西林的lb平板。次日，于平板挑取单克隆，扩大培养后抽提质粒，测序确保突变位点正确。

实施例2融合表达载体的转染、表达和纯化

将30μg构建好的pcdna3.1-antidigscfv-gluc融合蛋白表达质粒与1ml细胞培养基混合均匀。另取920μl细胞培养基与80μllipo2000转染试剂(invitrogen)混匀。将稀释好的表达载体和稀释好的转染试剂混匀，室温放置20分钟。准备25ml浓度为2×10⁶/ml的cho细胞，将混好的融合蛋白表达质粒及转染试剂混合物加入细胞，轻轻摇匀。37℃，8％co2条件下培养10天。

收集细胞培养液8000rpm/min离心10min，收集上清。将上清过滤后过镍柱上样，pbs洗涤10ml。用缓冲液(20mmtris，ph8.0，150mmnacl，20mm咪唑)冲洗10ml以去除杂蛋白，最后用缓冲液(20mmtris，ph8.0，150mmnacl，500mm咪唑)洗脱。

然后，用10％sds-page检测洗脱得到的蛋白。将高纯度蛋白样品进行westernblot鉴定。4℃，250ma恒流转印1.5h，将蛋白转印到pvdf膜(购自millipore)；转印结束，将膜在5％脱脂牛奶中室温封闭2h；pbs洗3遍，按1∶2000的比例加入anti-h+l、anti-fc、anti-mica抗体，37℃孵育1h，用含0.05％吐温的pbs(tpbs)洗3遍，再按1∶5000比例加入hrp偶联的羊抗鼠igg多克隆抗体，37℃孵育1h，tbs洗3遍，滴加ecl发光显色液，凝胶成像仪曝光拍照。将最终纯化并鉴定后的样品透析或超滤至pbs中，液氮速冻，-70℃保存。图2示出了sds-page和westernblot检测结果，可见洗脱得到的蛋白条带清晰，纯度较高。

pcdna3.1-antidigscfv-g2l融合蛋白表达质粒参照上述同样操作。

实施例3融合蛋白抗体部分elisa测试亲和实验

(1)将抗原100μlbsa-dig蛋白，按浓度1μg/ml过夜包被于酶条上。加200μlpbst震荡洗涤10min，共洗涤3次，pbs震荡洗涤3次。

(2)加入1％bsa-pbs200μl，37℃封闭2h。pbst200μl，洗涤10min，洗涤3次，pbs200μl，洗涤10min，洗涤3次。

(3)加入浓度梯度稀释的待测蛋白溶液100μl，37℃孵育2h。pbst200μl，洗涤10min，洗涤3次，pbs200μl，洗涤10min，洗涤3次。

(4)加入稀释的商品辣根过氧化物酶偶联的鼠抗6*his抗体100μl，37℃孵育1h。pbst200μl，洗涤10min，洗涤3次，pbs200μl，洗涤10min，洗涤3次。

(5)使用四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物(tmb)作为底物进行显色10min。

(6)加入50μl浓度为0.1mol/l的硫酸终止反应后，测量450nm的吸光度。

(7)分析吸光度与浓度，效果分析结果如图3所示。

结果显示：融合蛋白antidigscfv-gluc和antidigscfv-g2l的抗体部分elisa法测定对地高辛的结合力，显示融合蛋白保留了抗体对地高辛的亲和活性。

实施例4融合蛋白荧光素酶部分活性检测

将融合蛋白用底物稀释液(50mmtris，ph8.0，100mmnacl)稀释至3nm，取10μl加入96孔酶标板。再加入用相同溶液稀释至10μm的底物腔肠素90μl，用酶标仪自发光模块读取发光强度(clvalues)，结果如图4所示。

结果显示：融合蛋白antidigscfv-gluc和antidigscfv-g2l的荧光素酶部分均催化自发光活性，融合蛋白保留了荧光素酶催化底物发光的活性。

实施例5融合蛋白双功能活性检测——elisa检测结合与生物发光实验

(1)将抗原100μlbsa-dig蛋白，按浓度1μg/ml过夜包被于酶条上。加200μlpbst震荡洗涤10min，洗涤3次，pbs震荡洗涤3次。

(2)加入1％bsa-pbs200μl，37℃封闭2h。pbst200μl，洗涤10min，洗涤3次，pbs200μl，洗涤10min，洗涤3次。

(3)加入浓度梯度稀释的待测蛋白溶液100μl，37℃孵育2h。pbst200μl，洗涤10min，洗涤3次，pbs200μl，洗涤10min，洗涤3次。

(4)加入用溶液稀释至10μm的底物腔肠素90μl，用酶标仪自发光模块读取发光强度(clvalues)。

(5)分析吸光度与浓度，效果分析结果如图5所示。

结果显示：融合蛋白antidigscfv-gluc和antidigscfv-g2l同时具有抗体及荧光素酶双功能活性，能够结合靶点地高辛后催化底物生物发光。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

sequencelisting

<110>深圳华大生命科学研究院

<120>高斯荧光素酶和地高辛单链抗体的融合蛋白及其应用

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