一种特异性识别19-去甲睾酮的纳米抗体NT8及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
。更具体地，涉及一种特异性识别19-去甲睾酮的纳米抗体nt8及其应用。
背景技术：
：19-去甲睾酮(19-nortestosterone，19-nt)简称诺龙，是睾酮甾环结构上脱去第19位碳原子而形成的内源性和外源性蛋白同化激素。1950年birch首先合成外源性19-nt，随后wilds和nelson在1953年也成功合成，并广泛地应用于血液学疾病，恶病质和黄体酮替换治疗，以及人和动物的蛋白质缺陷型疾病、骨质疏松症和烧伤治疗等。研究还发现，19-nt具有很强的促蛋白质合成能力，能参与生长发育的生理调节，促进骨骼和肌肉的生长，减少脂肪贮积。因此，许多国家和地区将19-nt用作畜禽生长促进剂，以改善生产性能，提高饲料报酬。运动员服用19-nt后，能增强肌肉力量，结合适度的锻炼和饮食，可提高比赛成绩。然而，20世纪70年代末，一系列事故使人们认识到激素残留的危害。研究表明，19-nt及其代谢物残留可影响人的肝脏功能，损害心血管系统，还可造成生殖器官受损、肾上腺萎缩、情绪失控及内分泌失调等毒副作用。这就要求对食源性动物生产进行严格的激素滥用监测，以保护消费者的身心健康。因此，急需要一种快速、灵敏、高效的检测方法来实现对19-nt的快速检测。常见的检测19-nt的方法包括气相色谱-质谱法、液相色谱质谱联用法以及其他定量检测方法，但这些方法需要专业的技术人员、繁琐的样品前处理过程和昂贵的仪器设备，不适合大批量市场检测和现场监控。而免疫学检测技术灵敏度强、特异性强、操作简单、价格低廉，能够实现对生物液体的小体积、大通量检测，逐渐成为有毒有害残留物检测的替代方法。目前，免疫学检测主要以单克隆抗体和多克隆抗体为主，但是极端条件下抗体稳定性差，造成基于抗体建立的免疫分析方法准确性差，因此提供一种稳定性好、检测结果准确度高的快速检测19-nt的方法，对19-nt的残留检测和监控具有重要意义。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服现有19-nt的检测方法的缺陷和不足，提供一种特异性识别19-去甲睾酮的纳米抗体nt8及其应用。本发明的第一个目的是提供一种特异性识别19-去甲睾酮的纳米抗体nt8。本发明的第二个目的是提供一种编码所述纳米抗体nt8的基因。本发明的第三个目的是提供一种重组载体。本发明的第四个目的是提供一种重组细胞。本发明的第五个目的是提供所述纳米抗体nt8、所述基因、所述重组载体或所述重组细胞在检测19-去甲睾酮中的应用。本发明的第六个目的是提供所述纳米抗体nt8、所述基因、所述重组载体或所述重组细胞在制备19-去甲睾酮检测试剂/试剂盒中的应用。本发明的第七个目的是提供一种19-去甲睾酮免疫学检测方法。本发明的第八个目的是提供一种19-去甲睾酮检测试剂盒。本发明上述目的通过以下技术方案实现：本发明提供了一种特异性识别19-去甲睾酮的纳米抗体nt8，所述纳米抗体nt8的vhh的氨基酸序列如seqidno.1所示。本发明通过用噬菌体展示技术，从骆驼免疫抗体文库中筛选得到了一种能与19-nt特异性结合的纳米抗体nt8，该纳米抗体nt8能够特异性识别19-nt。所述纳米抗体nt8包括4个框架区fr1、fr2、fr3、fr4和3个互补决定区cdr1、cdr2、cdr3，所述4个框架区和3个互补决定区的排列顺序为fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4；其中，所述fr1的氨基酸序列如seqidno.2所示，所述cdr1的氨基酸序列如seqidno.3所示，所述fr2的氨基酸序列如seqidno.4所示，所述cdr2的氨基酸序列如seqidno.5所示，所述fr3的氨基酸序列如seqidno.6所示，所述cdr3的氨基酸序列如seqidno.7所示，所述fr4的氨基酸序列如seqidno.8所示。本发明还提供了一种编码所述纳米抗体nt8的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seqidno.9所示。本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体连接有所述的基因。本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞为携带有所述重组载体或能够表达所述纳米抗体nt8的细胞。所述纳米抗体nt8、所述基因、所述重组载体或所述重组细胞在检测19-去甲睾酮中的应用、在制备19-去甲睾酮检测试剂/试剂盒中的应用，均应在本发明的保护范围之内。另外，本发明还提供了一种19-去甲睾酮免疫学检测方法，用含有式(i)所述19-去甲睾酮半抗原与载体蛋白偶联得到的19-去甲睾酮完全抗原做包被原，用所述的纳米抗体nt8作为检测抗体进行检测。优选地，所述19-去甲睾酮半抗原的结构式如式(i)所示：本发明还提供了一种19-去甲睾酮检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的纳米抗体nt8。本发明具有以下有益效果：本发明筛选得到了一种能与19-nt特异性结合的纳米抗体nt8，该纳米抗体nt8能够特异性识别19-nt，具有较高的热稳定性和有机耐受性，可提高19-nt免疫检测的灵敏度，检测19-nt的范围0.48ng/ml～4.93ng/ml，ic50为1.53ng/ml，最低检测限(lod)为0.13ng/ml，检测灵敏度强；本发明还提供了一种19-去甲睾酮免疫学检测方法，该方法操作简单、所耗时间短，检测结果灵敏度强、准确度高，且该纳米抗体nt8的制备方法具有普遍适用性；因此，该纳米抗体nt8能够很好的应用于19-nt残留的实际样品检测，在检测19-去甲睾酮或制备19-去甲睾酮检测试剂/试剂盒中具有极高的应用价值。附图说明图1是特异性纳米抗体nt8的氨基酸序列及结构域划分示意图。图2是基于特异性纳米抗体nt8建立的间接竞争elisa标准曲线图。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1骆驼免疫抗体文库的构建(1)完全抗原19-nt-klh和19-nt-ova的制备把结构式如式(i)所示的19-去甲睾酮半抗原与卵清白蛋白(ova)和匙孔血蓝蛋白(klh)通过活泼酯方法偶联，制备获得完全抗原19-nt-klh和19-nt-ova。19-去甲睾酮半抗原的结构式如式(i)所示：(2)骆驼的免疫用健康的骆驼作为实验动物，以19-nt-klh作为免疫原，在骆驼背颈部进行皮下注射，每次免疫剂量为0.5ml(其中含有0.5mg免疫原)。首次免疫用0.5ml完全弗氏佐剂与免疫原乳化后用于免疫，后续的加强免疫用0.5ml不完全弗氏佐剂与免疫原乳化后免疫，每次免疫间隔1～2周。免疫前取10ml血分离血清作为阴性对照。从第二次免疫开始，每次取免疫一周后的血液10ml进行血清效价以及竞争反应检测。当出现较好的免疫应答效果时，取血100ml外周血进行淋巴细胞的分离，用于构建纳米抗体文库。(3)骆驼淋巴细胞的分离取骆驼全血与等体积生理盐水混合成1:1稀释血液，常温放置。在无菌的50ml离心管中加入20ml的淋巴分离液，用无菌巴氏滴管沿着试管壁缓慢加入20ml的稀释血液。500g，离心30min。取淋巴细胞层到新的50ml离心管，用生理盐水稀释2倍，2000g，4℃离心10min，弃上清。用5ml生理盐水吹散淋巴细胞，再次2000g离心10min，弃上清，以充分洗涤淋巴细胞。每份淋巴细胞中加入裂解液(trnsol)，1ml一份分装到2ml离心管中，于-80℃保存备用。(4)总rna的提取总rna的提取依据invitrogen公司的trizol试剂方法进行。具体方法如下：将上述裂解液每1ml加入0.2ml的氯仿。盖上离心管盖子，剧烈震荡15秒，在冰上孵育5min。室温下12000rpm离心10min。转移不多于80％上层水相至新的离心管，缓慢加入0.7倍体积的无水乙醇，混匀；将得到溶液和沉淀一起转入gbc吸附柱中，12000rpm离心30秒，弃废液；向gbc吸附柱中加入500μlwashbufferi离心1min，弃废液；向gbc吸附柱中加入600μlwashbufferii，12000rpm，离心30秒，弃废液。12000rpm离心1min，弃废液，室温打开盖子晾干吸附柱中残留漂洗液。将gbc吸附柱转入一个新的离心管中，加入30～100μlddh2o，室温放置2min，4℃，12000rpm离心1min。收集管内液体，于-80℃保存。(5)cdna的合成以rna为模板，参照takara公司第一链反转录试剂盒说明书进行cdna第一链的合成。具体方法为：a.按照表1所示的cdna合成的第一步反应体系，将试剂在无核酸酶的离心管中混合，在冰浴下操作；表1cdna合成的第一步反应体系totalrna3μgoligo(dt)18primer1μlrnasefreeddh2oupto12μltotal12μlb.上述反应体系65℃孵育5min，冰浴冷却2min；c.按照表2所示的cdna合成的第二步反应体系，在步骤a反应后的体系中加入试剂；表2cdna合成的第二步反应体系步骤a反应后的体系12μl5×reactionbuffer4μlribolockrnaseinhibitor(20u/μl)1μl10mmdntpmix2μlrevertaidm-milvrt(200u/μl)1μltotal20μld.42℃孵育60min，70℃孵育5min。反转录产物cdna于-80℃保存。(6)纳米抗体vhh目的基因的扩增第一轮pcr：将步骤(5)得到的反转录产物cdna作为模板，利用引物q1/q2进行第一轮pcr反应，引物q1/q2的核苷酸序列如表5所示，第一轮pcr的反应体系如表3所示。表3第一轮pcr的反应体系第一轮pcr的反应条件为：94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃1min30cycle；72℃10min。第二轮pcr：采用试剂盒回收第一轮pcr反应产物，适当稀释后作为第二轮pcr的模板，利用引物q3/q4进行第二轮pcr反应，引物q3/q4的核苷酸序列如表5所示，第二轮pcr的反应体系如表4所示。表4第二轮pcr的反应体系第二轮pcr的反应条件为：94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃1min30cycle；72℃10min。表5纳米抗体vhh目的基因的扩增所用的引物及其核苷酸序列(7)文库构建a.vhh目的基因及载体的酶切采用sfii酶对vhh目的基因及pcomb3xss载体进行酶切。酶切条件：50℃水浴锅反应16h。b.酶切产物的连接将载体pcomb3xss和vhh片段混匀(摩尔比1：3)，于16℃连接反应16h后用试剂盒清洁回收。c.电转化取5μl连接产物加至50μl电转感受态e.coiltg1中，轻轻混匀后转入0.1cm的电转杯中电击转化(电压为1.8kv)，立即向电转杯加入950μlsoc培养基，37℃，250rpm培养1h，将菌液涂布于lb-amp平板，37℃倒置培养过夜。(8)文库的救援接种超过10倍库容量的细胞于200mllb(amp)中37℃，250rpm培养至od600约0.4～0.6；加入辅助噬菌体m13k07(20:1感染复数)，37℃静置30min后，250rpm培养1h，加入卡那抗生素(1：1000)37℃，250rpm培养过夜。12000rpm4℃15min离心，取上清，加入1/5体积的peg/nacl，冰浴2～3h。12000rpm4℃15min离心，弃上清，沉淀用1mltbs重悬，转移到2ml离心管，12000rpm4℃5min离心，过0.22μm聚醚砜滤膜，取10μl测定库容，其余加入终浓度50％甘油，-80℃保存。实施例2纳米抗体的亲和淘选及其鉴定(1)纳米抗体的亲和淘选首先，以19-nt-ova作为包被原，用包被液将19-nt-ova包被原稀释至终浓度12μg/ml，37℃包被过夜。第二天用pbst(0.01mpbs，0.05％tween-20(v/v))洗两次后，加入1％鱼胶蛋白37℃封闭2h。甩干孔内液体并拍干，每孔加入100μl噬菌体库(滴度约为1012cfu/ml)，37℃孵育1h。弃去未结合的噬菌体，用pbst(0.01mpbs，0.05％tween-20(v/v))洗涤5次，pbs(ph7.0)洗涤15次，加入gly-hcl(0.2m，ph2.2)37℃洗脱10min，立即用10μltris-hcl(1m，ph9.0)中和。取10μl洗脱噬菌体测定滴度，其余的用于感染4ml生长至对数期的e.coiltg1菌株进行扩增。第三天用peg/nacl沉淀扩增后噬菌体，并测定噬菌体的滴度。在第二、三、四轮的淘选过程中，用包被液将19-nt-ova包被原稀释至终浓度分别为3μg/ml，0.75μg/ml，0.1875μg/ml，加入噬菌体孵育1h，用pbst(0.01mpbs，0.05％tween-20(v/v))与pbs洗涤后，采用药物竞争洗脱方式，即加入一定浓度的药物，37℃孵育1h，吸出孔内液体，即为洗脱下来的噬菌体。其余步骤同上。药物洗脱浓度分别为1200ng/ml，300ng/ml，150ng/ml。(2)阳性噬菌体克隆的鉴定采用间接酶联免疫吸附法进行阳性噬菌体克隆的鉴定，具体方法为：a.包板：用包被液将19-nt-ova包被原稀释至1μg/ml，37℃包被过夜。第二天用pbst(0.01mpbs，0.05％tween-20(v/v))洗两次后，加入2％的脱脂奶粉，每孔150μl，37℃封闭2h，弃封闭液，用pbst(0.01mpbs，0.05％tween-20(v/v))洗两次。37℃烘干30min，用密封袋装于4℃待用。b.从第三、四轮淘选后测定滴度的平板上随机挑选30个克隆于加有amp抗性的lb培养基的96孔深孔板中，同时接种一个tg1单克隆作为阴性对照，37℃培养过夜。第二天从96孔深孔板中取出10μl菌液加入到另一块96孔深孔板，37℃，180rpm培养2h，每孔加入iptg(1：1000比例，v/v)37℃，180rpm培养过夜。第三天4000rpm离心取上清100μl，加入到已经包被好的酶标板中，37℃孵育40min，用pbst(0.01mpbs，0.05％tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释hrp标记的抗ha二抗100μl，37℃孵育40min，用pbst(0.01mpbs，0.05％tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，加入100μltmb底物液，37℃避光显色10min；加入50μl终止液(2mh2so4)终止反应；用酶标仪测定450nm处的吸收值。选取od450大于阴性3倍的噬菌体克隆为阳性噬菌体克隆。(3)特异性纳米抗体的鉴定采用间接竞争elisa的方法进行阳性纳米抗体的鉴定，具体方法为：用包被液将19-nt-ova包被原稀释至1μg/ml，37℃包被过夜。第二天用pbst(0.01mpbs，0.05％tween-20(v/v))洗两次后，加入2％的脱脂奶粉，每孔150μl，37℃封闭2h，弃封闭液，用pbst(0.01mpbs，0.05％tween-20(v/v))洗两次。加入效价组：50μl经间接elisa鉴定为阳性克隆的上清液和50μl的pbs；抑制组：50μl经间接elisa鉴定为阳性克隆的上清液和50μl的19-nt标准品(浓度为1μg/ml)，37℃孵育40min，用pbst(0.01mpbs，0.05％tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释hrp标记的抗ha二抗100μl，37℃孵育40min，用pbst(0.01mpbs，0.05％tween-20(v/v))洗五次，拍干孔内液体，加入100μltmb底物液，37℃避光显色10min；加入50μl终止液(2mh2so4)终止反应；用酶标仪测定450nm处的吸收值。结果显示：获得了一株能够特异性识别19-nt的纳米抗体，命名为特异性纳米抗体nt8。实施例3特异性纳米抗体nt8编码基因的测序及其氨基酸序列的确定1、实验方法将经过间接竞争elisa鉴定获得的特异性纳米抗体nt8的菌株送到测序公司进行测序，获得特异性纳米抗体nt8的核苷酸序列；根据dna测序结果及密码子表，获得特异性纳米抗体nt8的氨基酸序列。2、实验结果特异性纳米抗体nt8的vhh的氨基酸序列如seqidno.1所示，特异性纳米抗体nt8的氨基酸序列及结构域划分示意图如图1所示，可以看出，该特异性纳米抗体nt8包括4个框架区(frameworkregion,fr)和3个互补决定区(complementarity-determiningregion,cdr)；框架区(fr1-fr4)分别选自seqidno.2，seqidno.4，seqidno.6，seqidno.8；互补决定区(cdr1-cdr3)分别选自seqidno.3，seqidno.5，seqidno.7；框架区结构相对保守，主要起着维持蛋白质结构的作用；互补决定区结构相对多样化，主要负责抗体的识别。其中，第1-26位氨基酸序列为fr1，其氨基酸如seqidno.2所示；第27-38位氨基酸序列为cdr1，其氨基酸如seqidno.3所示；第39-55位氨基酸序列为fr2，其氨基酸如seqidno.4所示；第56-65位氨基酸序列为cdr2，其氨基酸如seqidno.5所示；第66-104位氨基酸序列为fr3，其氨基酸如seqidno.6所示；第105-120位氨基酸序列为cdr3，其氨基酸如seqidno.7所示；第121-130位氨基酸序列为fr4，其氨基酸如seqidno.8所示。特异性纳米抗体nt8的核苷酸序列如seqidno.9所示。实施例5特异性纳米抗体nt8的大量制备以蛋白表达的形式进行制备特异性纳米抗体nt8，具体方法为：将所获得的特异性纳米抗体nt8的菌株，用试剂盒提取其质粒，将质粒用化学转化的方法转入e.coilbl21(de3)中。从转化平板上挑一单菌落接种于10mllb(amp)培养基中，37℃，250rpm培养过夜。将过夜培养物按1：100的比例接种于100mllb(amp)培养基中，37℃，250rpm培养至od600约为0.4-0.6时，加入iptg(1:1000比例,v/v)，37℃，250rpm培养过夜。第二天4℃，12000rpm离心5min，收集菌体沉淀，用蔗糖渗透压冻融法，12000rpm离心10min，取上清，将上清进行亲和层析纯化，即得表达的特异性纳米抗体nt8。实施例5特异性纳米抗体nt8的应用1、包被及封闭用包被液将19-nt-ova包被原稀释至1μg/ml，37℃包被过夜。第二天用pbst(0.01mpbs，0.05％tween-20(v/v))洗两次后，加入2％的脱脂奶粉，每孔150μl，37℃封闭2h，弃封闭液，用pbst(0.01mpbs，0.05％tween-20(v/v))洗两次。37℃烘干30min，用密封袋装于4℃待用。2、标准曲线的建立(1)实验方法用包被液将19-nt-ova包被原稀释至1μg/ml，37℃包被过夜。第二天用pbst(0.01mpbs，0.05％tween-20(v/v))洗两次后，加入2％的脱脂奶粉，每孔150μl，37℃封闭2h，弃封闭液，用pbst(0.01mpbs，0.05％tween-20(v/v))洗两次。每孔加入50μl纳米抗体和一系列不同浓度的50μl的19-nt标准品，37℃孵育40min，用pbst洗五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释hrp标记的抗ha二抗100μl，37℃孵育40min，用pbst洗五次，拍干孔内液体，加入100μltmb底物液，37℃避光显色10min；加入50μl终止液(2mh2so4)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸收值。以19-nt标准品浓度对横坐标，b/b0(加入19-nt的孔的od450/未加入19-nt的孔的od450)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。(2)实验结果基于特异性纳米抗体nt8建立的间接竞争elisa标准曲线图如图2所示，可以看出，标准曲线呈s型，线性相关性较好，检测范围0.48ng/ml～4.93ng/ml，ic50为1.53ng/ml，最低检测限(lod)为0.13ng/ml，检测灵敏度强。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>华南农业大学<120>一种特异性识别19-去甲睾酮的纳米抗体nt8及其应用<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>2<211>129<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2glnvalglnleuvalgluserglyglyglyservalglnalaglygly151015serleuargleusercysthralaalaglyalaserglyargthrtyr202530argserglycysmetglytrppheargglnalaproglyglugluarg354045glugluvalalaleuphetyralaglythrgluileiletyrtyrala505560aspservallysglyargphethrileserargasnasnalalysasp65707580thrleutyrleuglnmetaspserleulysprogluaspthralamet859095tyrtyrcysthralaaspileargthrservalcysargserleuarg100105110alaaspglnphetyrleutrpglyglnglythrglnvalthrvalser115120125ser<210>2<211>26<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2glnvalglnleuvalgluserglyglyglyservalglnalaglygly151015serleuargleusercysthralaalagly2025<210>3<211>12<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3alaserglyargthrtyrargserglycysmetgly1510<210>4<211>17<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>4trppheargglnalaproglyglugluargglugluvalalaleuphe151015tyr<210>5<211>10<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>5alaglythrgluileiletyrtyralaasp1510<210>6<211>38<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>6servallysglyargphethrileserargasnasnalalysaspthr151015leutyrleuglnmetaspserleulysprogluaspthralamettyr202530tyrcysthralaaspile35<210>7<211>16<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>7argthrservalcysargserleuargalaaspglnphetyrleutrp151015<210>8<211>10<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>8glyglnglythrglnvalthrvalserser1510<210>9<211>378<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9ctggtggagtctgggggagggtcggtgcaggctggaggctctctgagactctcctgtaca60gccgctggagcctctggacgcacctacaggagcggttgcatgggctggtttcgccaggct120ccaggggaggagcgcgaggaggtcgcacttttttatgctgggactgagatcatatattat180gccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccgaaacaacgccaaagacacgctctat240ctgcagatggacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtacggcagacatt300cgtactagcgtctgccgctcacttagagccgatcaattttatttgtggggccaggggacc360caggtcaccgtctcctca378当前第1页12