一种GAPDH纳米抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种gapdh纳米抗体及其应用。

背景技术：

骆驼科动物(羊驼、骆驼)和软骨鱼体内的一种天然缺失重链但仍然具有生物活性的特异性抗体称单域抗体，单域抗体的抗原结合位点(vhh)具有独立的抗原识别能力，独立表达的vhh又被称为纳米抗体。与传统的四联体抗体相比，单域抗体的主要特点有：分子量小，结构简单，理化性质稳定等。纳米抗体得优良特性使其在多种方面具有优势：在抗体进入机体方面纳米抗体能够穿过动物机体内的一些保护性的屏障进入发病部位发挥作用，如血脑屏障、血睾屏障等；在抗原抗体结合方面能够结合一些隐蔽的抗原表位，特别适用于比较难得到抗体的靶点，如gpcr、离子通道和酶活中心等；在降低生产成本方面纳米抗体结构简单易于体外表达，同时体外表达不易产生包涵体，生产工艺简单；同时纳米抗体的分子量小，结构简单，更有利于进行基因改造，纳米抗体人源化修饰等特性。

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，gapdh或g3pdh)，是糖酵解反应中的一个酶。由于gapdh广泛分布并高表达于各种组织中的细胞，且表达量稳定，因此，在分子生物学技术中gapdh可作为管家基因(housekeepinggene)，被广泛用作实时定量pcr和westernblot等实验中的内参。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种gapdh纳米抗体及其应用，本发明提供的gapdh纳米抗体对gapdh蛋白的灵敏度为0.2223μg/ml～0.5625μg/ml。本发明提供的gapdh纳米抗体可以成为westernblot、免疫组织化学和免疫共沉淀(co-ip)等相关技术的内参工具。同时，由于该抗体是纳米抗体，其分子量小，理化性质稳定，结构简单，能够穿过血脑屏障。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种gapdh纳米抗体，所述gapdh纳米抗体的氨基酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了一种gapdh纳米抗体，所述gapdh纳米抗体的氨基酸序列如seqidno.2所示。

本发明还提供了一种gapdh纳米抗体，所述gapdh纳米抗体的氨基酸序列如seqidno.3所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的gapdh纳米抗体在结合gapdh蛋白中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的gapdh纳米抗体在结合gapdh蛋白中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的gapdh纳米抗体在结合gapdh蛋白中的应用。

本发明提供了一种gapdh纳米抗体及其应用，gapdh纳米抗体的氨基酸序列如seqidno.1～3中任一种所示，这三种氨基酸序列具有纳米抗体恒定区，为esggglvqpggslrlscsfs……wfhqapgkere......yyadsvkgrftismdnsgntvylemnnlepedtgiyyc......wgqgtqvtvss(省略号部分为可变区)。所述gapdh纳米抗体对gapdh蛋白的灵敏度为0.2223μg/ml～0.5625μg/ml。

附图说明

图1为gapdh纳米抗体纯化后用his标签检测结果；

图2为gapdh纳米抗体纯化后作为一抗用westernblotting法检b16黑素瘤细胞中的gapdh。

具体实施方式

本发明提供了一种gapdh纳米抗体，所述gapdh纳米抗体的氨基酸序列如seqidno.1所示，具体如下：

esggglvqpggslrlscsfsglsldhtgigwfhqapgkereappkdregvscisiknysyyadsvkgrftismdnsgntvylemnnlepedtgiyycatdtwrtpqglcamwssfgswgqgtqvtvss。

本发明提供了一种gapdh纳米抗体，所述gapdh纳米抗体的氨基酸序列如seqidno.2所示，具体如下：

esgggsvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglewvsdinsggsnsyyadfvkgrftisrdnakntmylqmnnlkpgdtavyhcnfgtywgqgtqvtvss。

本发明提供了一种gapdh纳米抗体，所述gapdh纳米抗体的氨基酸序列如seqidno.3所示，具体如下：

esggglvqpggslrlsctasrnifsighyamgwyrqapgkerelvatiysdgdtyyqdsvkgrftysadttsdtaylqmsdlkpedsgiyycapspwgesdclgvndyeywgqgtqvtvss。

在本发明中，所述gapdh纳米抗体的筛选方法，优选包括以下步骤：

1)将黑素瘤纳米库进行第一轮淘洗，得到b16-gapdh-vhh1；

所述第一轮淘洗的gapdh蛋白的包被浓度为20μg/ml；

2)将所述步骤1)得到的b16-gapdh-vhh1依次进行第二轮、第三轮和第四轮淘洗，得到噬菌体溶液；

所述第二轮淘洗的gapdh蛋白的包被浓度为10μg/ml；

所述第三轮淘洗的gapdh蛋白的包被浓度为5μg/ml；

所述第四轮淘洗的gapdh蛋白的包被浓度为3μg/ml；

3)将所述步骤2)得到的噬菌体溶液与tg1菌液混合、感染后进行培养，得到菌株；

4)将所述步骤3)得到的菌株与km13辅助噬菌体混合、感染，将得到的感染物进行第一振荡培养后进行第一离心，将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二振荡培养后，进行第二离心，将得到的第二上清液与封闭液混合、孵育后进行间接elisa检测，检测第二上清液同gapdh蛋白的反应性，以确定所述菌株与gapdh蛋白具有反应性；

所述第一振荡的温度为35～42℃，所述第二振荡的温度为28～32℃；

所述第一离心的离心力为7500～8500g，所述第二离心的离心力为2000～2100g；

5)将所述步骤4)与gapdh蛋白具有反应性的菌株进行质粒提取，以所述质粒为模版，用质粒引物对进行pcr扩增，得到纳米抗体vhh片段，将所述纳米抗体vhh片段与表达载体连接，得到重组质粒；

所述质粒引物包括质粒上游引物和质粒下游引物，所述质粒上游引物的核苷酸序列如seqidno.4所示，具体如下：

ctagctagcagttgcagctcgtggagtccg；

所述质粒下游引物的核苷酸序列如seqidno.5所示，具体如下：cgagctctggagctggggtcttcgc；

6)将所述步骤5)得到的重组质粒、pbad18转入大肠杆菌，得到纳米抗体表达菌株，对所述纳米抗体表达菌株进行iptg诱导后，提取得到诱导后的纳米抗体表达菌株的蛋白，将所述蛋白进行sds-page鉴定和westernblotting鉴定，根据分子量大小和his-tag标签鉴定为gapdh纳米抗体。

本发明对所述黑素瘤纳米库没有特殊限定，优选依据申请号为201910058785.0、发明名称为一种黑素瘤纳米抗体库的构建方法的中国专利中公开的黑素瘤纳米库的构建方法构建得到即可。

本发明对所述黑素瘤纳米库进行第一轮淘洗，得到b16-gapdh-vhh1，分装冻存于-70℃。

淘洗时用50mm碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液作为包被缓冲液，包被浓度20μg/ml，包被体积2ml，以gapdh蛋白包被免疫管。

淘洗方法优选如下：

(1)将500μl黑素瘤纳米库接种于100ml2×ytag培养基，37℃200rmp振荡培养1小时至od600为0.4；

2)加入km13辅助噬菌体，100ml菌液加100μlkm13辅助噬菌体，37℃静置感染30分钟，而后振荡培养30分钟；

3)4000×g离心10分钟，去除培养基上清，用100ml2×ytak培养基重悬菌体沉淀，30℃200rmp振荡培养过夜；

4)次日上午11000×g，4℃离心过夜培养菌液10分钟，将上清转至新的离心瓶并加入20mlpeg/nacl溶液，混匀冰浴70分钟；

5)11000×g，4℃离心30分钟，弃上清，而后再次离心2分钟，彻底吸尽上清；

6)使用2.6mlpbs缓冲液重悬沉淀，而后将其分装于2个1.5ml离心管中，11600×g离心10分钟；

7)回收上清，命名为zj-b16-gapdh-vhh1，取100μl待用于滴度测定，剩余同1.6mlmpbs溶液混合，室温共孵育1h，得到混合液(mpbs溶液处理过的zj-b16-gapdh-vhh1)，待用。

包被蛋白处理优选如下：

(1)包被蛋白次日，将免疫管内的液体倒出，使用pbs缓冲液洗管3次。

(2)在每管中加满mpbs，室温封闭2h后使用pbs缓冲液洗管3次。

(3)在免疫管中加入2ml上述淘洗步骤7)得到的混合液，室温孵育2h后使用pbst溶液洗管10次，而后用pbs缓冲液洗管10次。

(4)在每管中加入2ml100mmtea溶液，室温轻摇15min洗脱结合的噬菌体，而后加入2mltris-hcl溶液中和。

(5)将洗脱的噬菌体(命名为xt-b16-gapdh-vhh1)转至50ml离心管，并加入16mlod600为0.4的tg1菌液，37℃水浴30分钟，使洗脱的噬菌体感染tg1菌液。(并在免疫管内加入4ml的od600为0.4的tg1菌液进行感染，最后合并，总共20ml的体积)

(6)取100μl菌液待用于滴度测定，剩余菌液于4000g离心10min。

(7)使用1ml2×yt培养基重悬菌体沉淀，将重悬后的菌液涂布于5个2×ytag固体培养板(150mm平板)，置于30℃孵箱培养过夜。

(8)次日用2×yt培养基收集平板上长出的菌落，加入60％的甘油至终浓度为15％，其即为一级文库菌，命名为b16-gapdh-vhh1，分装冻存于-70℃。

测定拯救噬菌体滴度：zj-b16-gapdh-vhh1进行梯度稀释，稀释度从10^-7～10^-13；每个稀释度取10μl噬菌体感染190μlod600为0.4的tg1菌液；每个稀释度取100μl菌液涂布2×ytag固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算zj-b16-gapdh-vhh1滴度。

测定洗脱噬菌体滴度：将用于滴度测定的菌液梯度稀释，稀释度从10^-1～10^-5；每个稀释度取100μl菌液涂布2×ytag固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算xt-b16-gapdh-vhh1滴度；进而计算第一轮淘洗的输入输出比i/o。

在一轮淘洗的基础上，依次进行二至四轮淘洗，所述第二轮淘洗的gapdh蛋白的包被浓度为10μg/ml，所述第三轮淘洗的gapdh蛋白的包被浓度为5μg/ml，所述第四轮淘洗的gapdh蛋白的包被浓度为3μg/ml。

在本发明中，所述步骤3)培养的温度优选为25～35℃，所述步骤4)感染的时间优选为25～35min，所述步骤4)孵育的时间优选为50～70min。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

gapdh纳米抗体的筛选方法，包括以下步骤：

1)将黑素瘤纳米库(根据中国专利cn201910058785.0公开的方法制备即可)进行第一轮淘洗，得到b16-gapdh-vhh1；

第一轮淘洗的gapdh蛋白的包被浓度为20μg/ml；

2)将步骤1)得到的b16-gapdh-vhh1依次进行第二轮、第三轮和第四轮淘洗，得到噬菌体溶液；

第二轮淘洗的gapdh蛋白的包被浓度为10μg/ml；

第三轮淘洗的gapdh蛋白的包被浓度为5μg/ml；

第四轮淘洗的gapdh蛋白的包被浓度为3μg/ml；

3)将步骤2)得到的噬菌体液与tg1菌液混合、感染后进行培养，得到菌株；

4)将步骤3)得到的菌株与km13辅助噬菌体混合、感染，将得到的感染物进行第一振荡培养后进行第一离心，将得到的第一沉淀经液体培养基重悬后进行第二振荡培养后，进行第二离心，将得到的第二上清液与封闭液混合、孵育后进行间接elisa检测，检测第二上清液同gapdh蛋白的反应性，以确定所述菌株与gapdh蛋白具有反应性；

第一振荡的温度为35～42℃，第二振荡的温度为28～32℃；

第一离心的离心力为7500～8500g，第二离心的离心力为2000～2100g；

5)将步骤4)与gapdh蛋白具有反应性的菌株进行质粒提取，以质粒为模版，用质粒引物对进行pcr扩增，得到纳米抗体vhh片段，将纳米抗体vhh片段与表达载体连接，得到重组质粒；

所述质粒引物包括质粒上游引物(seqidno.4)和质粒下游引物(seqidno.5)；

6)将步骤5)得到的重组质粒、pbad18转入大肠杆菌，得到纳米抗体表达菌株，对所述纳米抗体表达菌株进行iptg诱导后，提取得到诱导后的纳米抗体表达菌株的蛋白，将所述蛋白进行sds-page鉴定和westernblotting鉴定，根据分子量大小和his-tag标签鉴定为gapdh纳米抗体。

从已制备的黑素瘤纳米库进行第一轮淘洗，得到b16-gapdh-vhh1，分装冻存于-70℃。

淘洗时用50mm碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液作为包被缓冲液，包被浓度20μg/ml，包被体积2ml，以gapdh蛋白包被免疫管。

淘洗方法如下：

(1)将500μl黑素瘤纳米库接种于100ml2×ytag培养基，37℃200rmp振荡培养1小时至od600为0.4；

2)加入km13辅助噬菌体，100ml菌液加100μlkm13辅助噬菌体，37℃静置感染30分钟，而后振荡培养30分钟；

3)4000×g离心10分钟，去除培养基上清，用100ml2×ytak培养基重悬菌体沉淀，30℃200rmp振荡培养过夜；

4)次日上午11000×g，4℃离心过夜培养菌液10分钟，将上清转至新的离心瓶并加入20mlpeg/nacl溶液，混匀冰浴70分钟；

5)11000×g，4℃离心30分钟，弃上清，而后再次离心2分钟，彻底吸尽上清；

6)使用2.6mlpbs缓冲液重悬沉淀，而后将其分装于2个1.5ml离心管中，11600×g离心10分钟；

7)回收上清，命名为zj-b16-gapdh-vhh1，取100μl待用于滴度测定，剩余同1.6mlmpbs溶液混合，室温共孵育1h，得到混合液(mpbs溶液处理过的zj-b16-gapdh-vhh1)，待用。

包被蛋白处理：

(1)包被蛋白次日，将免疫管内的液体倒出，使用pbs缓冲液洗管3次。

(2)在每管中加满mpbs，室温封闭2h后使用pbs缓冲液洗管3次。

(3)在免疫管中加入2ml上述淘洗步骤(7)得到的混合液，室温孵育2h后使用pbst溶液洗管10次，而后用pbs缓冲液洗管10次。

(4)在每管中加入2ml100mmtea溶液，室温轻摇15min洗脱结合的噬菌体，而后加入2mltris-hcl溶液中和。

(5)将洗脱的噬菌体(命名为xt-b16-gapdh-vhh1)转至50ml离心管，并加入16mlod600为0.4的tg1菌液，37℃水浴30分钟，使洗脱的噬菌体感染tg1菌液。(并在免疫管内加入4ml的od600为0.4的tg1菌液进行感染，最后合并，总共20ml的体积)。

(6)取100μl菌液待用于滴度测定，剩余菌液于4000g离心10min。

(7)使用1ml2×yt培养基重悬菌体沉淀，将重悬后的菌液涂布于5个2×ytag固体培养板(150mm平板)，置于30℃孵箱培养过夜。

(8)次日用2×yt培养基收集平板上长出的菌落，加入60％的甘油至终浓度为15％，其即为一级文库菌，命名为b16-gapdh-vhh1，分装冻存于-70℃。

测定拯救噬菌体滴度：zj-b16-gapdh-vhh1进行梯度稀释，稀释度从10^-7～10^-13；每个稀释度取10μl噬菌体感染190μlod600为0.4的tg1菌液；每个稀释度取100μl菌液涂布2×ytag固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算zj-b16-gapdh-vhh1滴度。

测定洗脱噬菌体滴度：将用于滴度测定的菌液梯度稀释，稀释度从10^-1～10^-5；每个稀释度取100μl菌液涂布2×ytag固体培养板，置于30℃培养箱培养过夜；对测定板上的菌落计数，计算xt-b16-gapdh-vhh1滴度；进而计算第一轮淘洗的输入输出比i/o。

在一轮淘洗的基础上，依次进行二至四轮淘洗：gapdh蛋白包被浓度分别为10μg/ml、5μg/ml、5μg/ml；拯救噬菌体滴度测定稀释度分别为10^-7～10^-12、10^-8～10^-11、10^-8～10^-11；洗脱噬菌体m13-gapdh的滴度测定稀释度分别为10^-1～10^-6、10^-1～10^-6、10^-8～10^-11；洗脱的噬菌体用tris-hcl溶液(1m，ph值为7.4)中和后，取200μl噬菌体感染800μlod600为0.4的tg1菌液(取100μl进行梯度稀释，剩余的进行保菌)，而后做10^-3～10^-6共4个稀释度，每个稀释度涂布3个2×ytag固体培养板(150mm平板)，每板100μl菌液，置于30℃培养过夜；对培养板菌落计数，计算滴度，并将培养板标记为平板，置于4℃冰箱待用。

特异性纳米抗体的筛选：

单克隆噬菌体上清的制备：从平板挑取192个单克隆菌株共接种2块96孔深孔培养板，每孔中均含200μl2×ytag培养基，培养板分别标记为e-1、e-2，于30℃振荡培养。8h后，从每孔中吸取20μl菌液接种于180μl2×ytag培养基，于37℃振荡培养，原平板的剩余菌液中则加入60μl60％的甘油至终浓度为15％，冻存于-80℃。转接平板振荡培养1h后，在每孔中加入20μlkm13(60μlkm13+12ml2*ytag)辅助噬菌体，37℃静置感染30min，而后37℃振荡培养40min。1800×g离心深孔板10min，弃上清并在每孔中加入400μl2×ytak培养基重悬沉淀，30℃振荡培养过夜。次日，最大转速2020xg离心20分钟，从各孔中吸250μl噬菌体上清转移至新的深孔板中，并在每孔中加入250μl封闭液(含3％bsa的pbs缓冲溶液)常温共孵育1小时，待用于间接elisa检测。

特异性单克隆噬菌体的鉴定：通过间接elisa试验检测噬菌体上清同gapdh蛋白的反应性，具体方法如下：使用gapdh蛋白，包被96孔酶标板，包被浓度为2μg/ml，每孔100μl，置于4℃过夜。次日弃孔内包被液体，在每孔中加入100μl封闭液于37℃封闭1h。弃孔内封闭液，在每孔分别中加入100μl封闭液处理过的四轮筛选得到的噬菌体上清作为一抗，37℃孵育1h。用pbst洗液洗板12次。在每孔中加入100μl二抗(hrp-m13antibody，稀释度1:10000)，37℃孵育1h。用pbst洗液洗板12次。在每孔中加入100μl显色底物，避光反应5-15min，而后在每孔中加入50μl终止液终止反应。将96孔酶标板置于读板机上读取od450吸收值。对elisa结果进行分析并确定阳性孔号。

通过间接elisa方法检测192个单克隆对应的噬菌体上清同gapdh蛋白的反应性，根据间接elisa试验的结果挑选出了24个单克隆，这些单克隆均同gapdh蛋白有较好的反应性且同bsa蛋白的反应值较弱。将24个单克隆的培养菌液送测序公司测序。

gapdh纳米抗体活性和亲和性：

原核表达重组质粒的构建：将上述测序结果正确的克隆株的甘油菌接种5ml2×ytag培养基培养，并利用质粒小量提取试剂盒提取质粒作为原核表达的模板质粒。之后设计用于原核表达的引物，并在引物的5’端和3'端分别引入bamhⅰ和sali酶切位点。利用设计的引物扩增纳米抗体vhh序列，并通过上述酶切位点将其连接入pqe30原核表达载体，构建纳米抗体原核表达重组质粒以进行纳米抗体的gapdh特异性鉴定。

原核表达的引物：

f(seqidno.6):gtgaggatccagttgcagctcgtggagtccg；

r(seqidno.7):tctgagtcgactggagctggggtcttcgc。

筛选步骤如下：

将重组质粒和pbad18空载转化入bl21(de3)菌株并获得相应的纳米抗体表达菌株。而后对纳米抗体进行诱导表达，具体方法为：

将转化后涂板后的菌液进行过夜培养，次日挑取培养板上的单克隆菌落过夜培养。将次日培养的菌液进行保菌。

吸取10μl甘油菌接种于5mlamp抗性的lb培养基，37℃振荡培养过夜；

第二天吸取50μl菌液接种5mlamp抗性的lb培养基，各接种2管，37℃振荡培养至od600为0.6；

在其中1管菌液中加入iptg诱导(终浓度0.4mm)，另1管不加iptg做为未诱导对照，15℃振荡培养过夜；

同时做bl21(de3)空菌株对照，空菌株对照培养使用无抗性的lb培养基。

纳米抗体的sds-page鉴定：

将对纳米抗体的表达进行sds-page鉴定，具体方法为：

吸取1ml菌液于1.5ml离心管，13000rpm离心2min；

弃上清，使用pbs缓冲液洗涤菌体沉淀2次；

用20μlpbs缓冲液重悬菌体沉淀，而后加入5μl5×蛋白上样缓冲液，并于沸水中煮样5分钟。用10％的聚丙烯酰胺凝胶对样品进行电泳。待电泳结束后，用考马斯亮蓝染液染胶1h，而后用脱色液进行脱色。

具有抗gapdh中和活性的纳米抗体的筛选：分别将筛选出的n.1、n.2和n.3的纳米抗体对应甘油菌株接种于5mlamp抗性的lb培养基，37℃振荡培养10h后转接到500mlamp抗性的lb培养基中，37℃振荡培养至od600为0.6时加入iptg(终浓度0.4mm)诱导表达，15℃振荡培养过夜。次日，对上述3株纳米抗体进行小量纯化。

gapdh纳米抗体的亲和性：用5ug/ml得gapdh包被elisa板；经bsa封闭后将纯化稀释后的gapdh纳米抗体作为一抗，分别梯度稀释到5ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml、0.625ug/ml、0.3125ug/ml，进行elisa鉴定。纯化产物的鉴定：经elisa鉴定，筛选出亲和性最好的gapdh纳米抗体，并对该抗体用westernblotting法进行his标签鉴定：经sds-page电泳后，转到nc膜，直接用his二抗进行标记，经显影术显示抗体。

结果：

测序和elisa筛选结果

通过间接elisa方法检测192个单克隆对应的噬菌体上清同gapdh蛋白的反应性，根据间接elisa试验的结果挑选出了24个单克隆，进行测序，结果显示，有20个克隆的序列是正确的。这些单克隆均同gapdh蛋白有不同程度的反应性且同bsa蛋白的反应值较弱(表1)。

20个克隆测序并预测的氨基酸序列为：

seqidno.8(gapdh-vhh1)：

esggglvqpggslrlsckgsrntftlwdlgwyrqapgkqrnerelvasitatgttdyadsvkgrfaisrdnaekmaylqmndlrpndtavyycntagrilsawgqgtqvtvpa；

seqidno.9(gapdh-vhh2)：

esggglvqaggslrlscatsgavftlnavgwyrqvpgkerelvaalsaagrnsyyadtvqgrftisrdnarnmhylqmndlkpgdtamyycaaspqletdfvatqrwqyhywgqgtqvtvsp；

seqidno.10(gapdh-vhh3)：

esggglvqaggslrlscatsgavftlnavgwyrqvpgkerelvaalsaagrnsyyadtvqgrftisrdnarnmhylqmndlkpgdtamyycaaspqletdfvatqrwqyhywgqgtqvtvsp；

seqidno.11(gapdh-vhh4)：

esggglvqpggslrlscaasgftfsmyvmrwyrqapgkerelvasvaddgnstifadsvkgrftisrdnakntihlemnslkpedtadyycnalnkydyriqkwgkgtlvtvss；

seqidno.12(gapdh-vhh5)：

esggglvqpggslrlscaasgfslryyavgwfrqapgkeregvscisrsglgdgsglrdgrteyldsvkgrftisrdntkstvylhmnnlkpedtaiyycaaagprfgerlcrldeddfgswgqgaqvtvss；

seqidno.13(gapdh-vhh6)：

esgggsvqpggslrlscaasgftfsmyvmrwyrqapgkerelvasvaddgnstifadsvkgrftisrdnakntihlemnslkpedtadyycnalnkydyriqkwgkgtlvtvss；

seqidno.14(gapdh-vhh7)：

esggglvqpggslrlscsfsglsldhtgigwfhqapgkereappkdregvscisiknysyyadsvkgrftismdnsgntvylemnnlepedtgiyycatdtwrtpqglcamwssfgswgqgtqvtvss；

seqidno.15(gapdh-vhh8)：

esggglvqpggslrlsctasgfaleyyaigwfrqapgkeregvscitergestyyadsvkgrftvsrdntkntaylqmtnlkpedtdvyrcaaaqycsgydlmneynyggqgtqvtvss；

seqidno.16(gapdh-vhh9)：

esggglvqpggslrlscaasgftfddygmswvrqapgkwlewvsdiswnggstyyaesmkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycakyertlpksprfyygmdywgkgtlvtvss；

seqidno.17(gapdh-vhh12)：

esggglvqaggslrlscvasgiisglnamawcrqapgkrrelvaaivegdgstryedsvkgrftisrdavknmvnlqmnslqpedtavyycnaevqevptmtyywgqgtqvtvs；

seqidno.18(gapdh-vhh13)：

esggglvqaggslrlscvasgiisglnamawcrqapgkrrelvaaivegdgstryedsvkgrftisrdavknmvnlqmnslqpedtavyycnaevqevptmtyywgqgtqvtvs；

seqidno.19(gapdh-vhh14)：

esggglvqaggslrlscvasgiisglnamawcrqapgkrrelvaaivegdgstryedsvkgrftisrdavknmvnlqmnslqpedtavyycnaevqevptmtyywgqgtqvtvs；

seqidno.20(gapdh-vhh16)：

esggglvqaggslrlscvasgiisglnamawcrqapgkrrelvaaivegdgstryedsvkgrftisrdavknmvnlqmnslqpedtavyycnaevqevptmtyywgqgtqvtvs；

seqidno.21(gapdh-vhh17)：

esgggsvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglewvsdinsggsnsyyadfvkgrftisrdnakntmylqmnnlkpgdtavyhcnfgtywgqgtqvtvss；

seqidno.22(gapdh-vhh18)：

esggglvqaggslrlscvasgiisglnamawcrqapgkrrelvaaivegdgstryedsvkgrftisrdavknmvnlqmnslqpedtavyycnaevqevptmtyywgqgtqvtv；

seqidno.23(gapdh-vhh20)：

esggglvqpggslrlsctasrnifsighyamgwyrqapgkerelvatiysdgdtyyqdsvkgrftysadttsdtaylqmsdlkpedsgiyycapspwgesdclgvndyeywgqgtqvtvss；

seqidno.24(gapdh-vhh21)：

esggglvqpggslglscaasgftfstypltwvrqapgeglewlsgissgsgsiyygdsvkgrftisrdnakntlylqmnslkpedtavyycakgglvltpngmdywgkgtlvtvss；

seqidno.25(gapdh-vhh22)：

esgggsvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglewvsdinsggsnsyyadfvkgrftisrdnakntmylqmnnlkpgdtavyhcnfgtywgqgtqvtvss；

seqidno.26(gapdh-vhh23)：

esggglvqpggslglscaasgftfstypltwvrqapgeglewlsgissgsgsiyygdsvkgrftisrdnakntlylqmnslkpedtavyycakgglvltpngmdywgkgtlvtvss；

seqidno.27(gapdh-vhh24)：

esggglvqpggslglscaasgftfstypltwvrqapgeglewlsgissgsgsiyygdsvkgrftisrdnakntlylqmnslkpedtavyycakgglvltpngmdywgkgtlvtvs。

以上序列均为vhh序列。

表1gapdh单克隆elisa筛选结果

gapdh纳米抗体亲和性检测：

elisa检测后，将选择阳性较强的三个克隆gapdh-vhh4(seqidno.14)、gapdh-vhh17(seqidno.21)、gapdh-vhh20(seqidno.23)进行表达后，亲和性检测结果分别为：gapdh-vhh17对gapdh蛋白的灵敏度为0.2223ug/ml；gapdh-vhh4对gapdh蛋白的灵敏度为0.5625ug/ml；gapdh-vhh20对gapdh蛋白的灵敏度为0.4628ug/ml。

his标签检测：用westernblotting法对纯化的抗体进行his标签检测，结果发现分子量大小约为15kd，符合纳米抗体大小。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>山西农业大学

<120>一种gapdh纳米抗体及其应用

<160>27

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>128

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gluserglyglyglyleuvalglnproglyglyserleuargleuser

151015

cysserpheserglyleuserleuasphisthrglyileglytrpphe

202530

hisglnalaproglylysgluargglualaproprolysaspargglu

354045

glyvalsercysileserilelysasntyrsertyrtyralaaspser

505560

vallysglyargphethrilesermetaspasnserglyasnthrval

65707580

tyrleuglumetasnasnleugluprogluaspthrglyiletyrtyr

859095

cysalathraspthrtrpargthrproglnglyleucysalamettrp

100105110

serserpheglysertrpglyglnglythrglnvalthrvalserser

115120125

<210>2

<211>107

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gluserglyglyglyservalglnproglyglyserleuargleuser

151015

cysalaalaserglyphethrphesersertyralametsertrpval

202530

argglnalaproglylysglyleuglutrpvalseraspileasnser

354045

glyglyserasnsertyrtyralaaspphevallysglyargphethr

505560

ileserargaspasnalalysasnthrmettyrleuglnmetasnasn

65707580

leulysproglyaspthralavaltyrhiscysasnpheglythrtyr

859095

trpglyglnglythrglnvalthrvalserser

100105

<210>3

<211>121

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gluserglyglyglyleuvalglnproglyglyserleuargleuser

151015

cysthralaserargasnilepheserileglyhistyralametgly

202530

trptyrargglnalaproglylysgluarggluleuvalalathrile

354045

tyrseraspglyaspthrtyrtyrglnaspservallysglyargphe

505560

thrtyrseralaaspthrthrseraspthralatyrleuglnmetser

65707580

aspleulysprogluaspserglyiletyrtyrcysalaproserpro

859095

trpglygluseraspcysleuglyvalasnasptyrglutyrtrpgly

100105110

glnglythrglnvalthrvalserser

115120

<210>4

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ctagctagcagttgcagctcgtggagtccg30

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cgagctctggagctggggtcttcgc25

<210>6

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

gtgaggatccagttgcagctcgtggagtccg31

<210>7

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

tctgagtcgactggagctggggtcttcgc29

<210>8

<211>113

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gluserglyglyglyleuvalglnproglyglyserleuargleuser

151015

cyslysglyserargasnthrphethrleutrpaspleuglytrptyr

202530

argglnalaproglylysglnargasngluarggluleuvalalaser

354045

ilethralathrglythrthrasptyralaaspservallysglyarg

505560

phealaileserargaspasnalaglulysmetalatyrleuglnmet

65707580

asnaspleuargproasnaspthralavaltyrtyrcysasnthrala

859095

glyargileleuseralatrpglyglnglythrglnvalthrvalpro

100105110

ala

<210>9

<211>122

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

gluserglyglyglyleuvalglnalaglyglyserleuargleuser

151015

cysalathrserglyalavalphethrleuasnalavalglytrptyr

202530

argglnvalproglylysgluarggluleuvalalaalaleuserala

354045

alaglyargasnsertyrtyralaaspthrvalglnglyargphethr

505560

ileserargaspasnalaargasnmethistyrleuglnmetasnasp

65707580

leulysproglyaspthralamettyrtyrcysalaalaserprogln

859095

leugluthraspphevalalathrglnargtrpglntyrhistyrtrp

100105110

glyglnglythrglnvalthrvalserpro

115120

<210>10

<211>122

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

gluserglyglyglyleuvalglnalaglyglyserleuargleuser

151015

cysalathrserglyalavalphethrleuasnalavalglytrptyr

202530

argglnvalproglylysgluarggluleuvalalaalaleuserala

354045

alaglyargasnsertyrtyralaaspthrvalglnglyargphethr

505560

ileserargaspasnalaargasnmethistyrleuglnmetasnasp

65707580

leulysproglyaspthralamettyrtyrcysalaalaserprogln

859095

leugluthraspphevalalathrglnargtrpglntyrhistyrtrp

100105110

glyglnglythrglnvalthrvalserpro

115120

<210>11

<211>114

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

gluserglyglyglyleuvalglnproglyglyserleuargleuser

151015

cysalaalaserglyphethrphesermettyrvalmetargtrptyr

202530

argglnalaproglylysgluarggluleuvalalaservalalaasp

354045

aspglyasnserthrilephealaaspservallysglyargphethr

505560

ileserargaspasnalalysasnthrilehisleuglumetasnser

65707580

leulysprogluaspthralaasptyrtyrcysasnalaleuasnlys

859095

tyrasptyrargileglnlystrpglylysglythrleuvalthrval

100105110

serser

<210>12

<211>132

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

gluserglyglyglyleuvalglnproglyglyserleuargleuser

151015

cysalaalaserglypheserleuargtyrtyralavalglytrpphe

202530

argglnalaproglylysgluarggluglyvalsercysileserarg

354045

serglyleuglyaspglyserglyleuargaspglyargthrglutyr

505560

leuaspservallysglyargphethrileserargaspasnthrlys

65707580

serthrvaltyrleuhismetasnasnleulysprogluaspthrala

859095

iletyrtyrcysalaalaalaglyproargpheglygluargleucys

100105110

argleuaspgluaspasppheglysertrpglyglnglyalaglnval

115120125

thrvalserser

130

<210>13

<211>114

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

gluserglyglyglyservalglnproglyglyserleuargleuser

151015

cysalaalaserglyphethrphesermettyrvalmetargtrptyr

202530

argglnalaproglylysgluarggluleuvalalaservalalaasp

354045

aspglyasnserthrilephealaaspservallysglyargphethr

505560

ileserargaspasnalalysasnthrilehisleuglumetasnser

65707580

leulysprogluaspthralaasptyrtyrcysasnalaleuasnlys

859095

tyrasptyrargileglnlystrpglylysglythrleuvalthrval

100105110

serser

<210>14

<211>128

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

gluserglyglyglyleuvalglnproglyglyserleuargleuser

151015

cysserpheserglyleuserleuasphisthrglyileglytrpphe

202530

hisglnalaproglylysgluargglualaproprolysaspargglu

354045

glyvalsercysileserilelysasntyrsertyrtyralaaspser

505560

vallysglyargphethrilesermetaspasnserglyasnthrval

65707580

tyrleuglumetasnasnleugluprogluaspthrglyiletyrtyr

859095

cysalathraspthrtrpargthrproglnglyleucysalamettrp

100105110

serserpheglysertrpglyglnglythrglnvalthrvalserser

115120125

<210>15

<211>119

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

gluserglyglyglyleuvalglnproglyglyserleuargleuser

151015

cysthralaserglyphealaleuglutyrtyralaileglytrpphe

202530

argglnalaproglylysgluarggluglyvalsercysilethrglu

354045

argglygluserthrtyrtyralaaspservallysglyargphethr

505560

valserargaspasnthrlysasnthralatyrleuglnmetthrasn

65707580

leulysprogluaspthraspvaltyrargcysalaalaalaglntyr

859095

cysserglytyraspleumetasnglutyrasntyrglyglyglngly

100105110

thrglnvalthrvalserser

115

<210>16

<211>121

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

gluserglyglyglyleuvalglnproglyglyserleuargleuser

151015

cysalaalaserglyphethrpheaspasptyrglymetsertrpval

202530

argglnalaproglylystrpleuglutrpvalseraspilesertrp

354045

asnglyglyserthrtyrtyralaglusermetlysglyargphethr

505560

ileserargaspasnalalysasnthrvaltyrleuglnmetasnser

65707580

leulysprogluaspthralavaltyrtyrcysalalystyrgluarg

859095

thrleuprolysserproargphetyrtyrglymetasptyrtrpgly

100105110

lysglythrleuvalthrvalserser

115120

<210>17

<211>114

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

gluserglyglyglyleuvalglnalaglyglyserleuargleuser

151015

cysvalalaserglyileileserglyleuasnalametalatrpcys

202530

argglnalaproglylysargarggluleuvalalaalailevalglu

354045

glyaspglyserthrargtyrgluaspservallysglyargphethr

505560

ileserargaspalavallysasnmetvalasnleuglnmetasnser

65707580

leuglnprogluaspthralavaltyrtyrcysasnalagluvalgln

859095

gluvalprothrmetthrtyrtyrtrpglyglnglythrglnvalthr

100105110

valser

<210>18

<211>114

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>18

gluserglyglyglyleuvalglnalaglyglyserleuargleuser

151015

cysvalalaserglyileileserglyleuasnalametalatrpcys

202530

argglnalaproglylysargarggluleuvalalaalailevalglu

354045

glyaspglyserthrargtyrgluaspservallysglyargphethr

505560

ileserargaspalavallysasnmetvalasnleuglnmetasnser

65707580

leuglnprogluaspthralavaltyrtyrcysasnalagluvalgln

859095

gluvalprothrmetthrtyrtyrtrpglyglnglythrglnvalthr

100105110

valser

<210>19

<211>114

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>19

gluserglyglyglyleuvalglnalaglyglyserleuargleuser

151015

cysvalalaserglyileileserglyleuasnalametalatrpcys

202530

argglnalaproglylysargarggluleuvalalaalailevalglu

354045

glyaspglyserthrargtyrgluaspservallysglyargphethr

505560

ileserargaspalavallysasnmetvalasnleuglnmetasnser

65707580

leuglnprogluaspthralavaltyrtyrcysasnalagluvalgln

859095

gluvalprothrmetthrtyrtyrtrpglyglnglythrglnvalthr

100105110

valser

<210>20

<211>114

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>20

gluserglyglyglyleuvalglnalaglyglyserleuargleuser

151015

cysvalalaserglyileileserglyleuasnalametalatrpcys

202530

argglnalaproglylysargarggluleuvalalaalailevalglu

354045

glyaspglyserthrargtyrgluaspservallysglyargphethr

505560

ileserargaspalavallysasnmetvalasnleuglnmetasnser

65707580

leuglnprogluaspthralavaltyrtyrcysasnalagluvalgln

859095

gluvalprothrmetthrtyrtyrtrpglyglnglythrglnvalthr

100105110

valser

<210>21

<211>107

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>21

gluserglyglyglyservalglnproglyglyserleuargleuser

151015

cysalaalaserglyphethrphesersertyralametsertrpval

202530

argglnalaproglylysglyleuglutrpvalseraspileasnser

354045

glyglyserasnsertyrtyralaaspphevallysglyargphethr

505560

ileserargaspasnalalysasnthrmettyrleuglnmetasnasn

65707580

leulysproglyaspthralavaltyrhiscysasnpheglythrtyr

859095

trpglyglnglythrglnvalthrvalserser

100105

<210>22

<211>113

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>22

gluserglyglyglyleuvalglnalaglyglyserleuargleuser

151015

cysvalalaserglyileileserglyleuasnalametalatrpcys

202530

argglnalaproglylysargarggluleuvalalaalailevalglu

354045

glyaspglyserthrargtyrgluaspservallysglyargphethr

505560

ileserargaspalavallysasnmetvalasnleuglnmetasnser

65707580

leuglnprogluaspthralavaltyrtyrcysasnalagluvalgln

859095

gluvalprothrmetthrtyrtyrtrpglyglnglythrglnvalthr

100105110

val

<210>23

<211>121

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>23

gluserglyglyglyleuvalglnproglyglyserleuargleuser

151015

cysthralaserargasnilepheserileglyhistyralametgly

202530

trptyrargglnalaproglylysgluarggluleuvalalathrile

354045

tyrseraspglyaspthrtyrtyrglnaspservallysglyargphe

505560

thrtyrseralaaspthrthrseraspthralatyrleuglnmetser

65707580

aspleulysprogluaspserglyiletyrtyrcysalaproserpro

859095

trpglygluseraspcysleuglyvalasnasptyrglutyrtrpgly

100105110

glnglythrglnvalthrvalserser

115120

<210>24

<211>116

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>24

gluserglyglyglyleuvalglnproglyglyserleuglyleuser

151015

cysalaalaserglyphethrpheserthrtyrproleuthrtrpval

202530

argglnalaproglygluglyleuglutrpleuserglyileserser

354045

glyserglyseriletyrtyrglyaspservallysglyargphethr

505560

ileserargaspasnalalysasnthrleutyrleuglnmetasnser

65707580

leulysprogluaspthralavaltyrtyrcysalalysglyglyleu

859095

valleuthrproasnglymetasptyrtrpglylysglythrleuval

100105110

thrvalserser

115

<210>25

<211>107

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>25

gluserglyglyglyservalglnproglyglyserleuargleuser

151015

cysalaalaserglyphethrphesersertyralametsertrpval

202530

argglnalaproglylysglyleuglutrpvalseraspileasnser

354045

glyglyserasnsertyrtyralaaspphevallysglyargphethr

505560

ileserargaspasnalalysasnthrmettyrleuglnmetasnasn

65707580

leulysproglyaspthralavaltyrhiscysasnpheglythrtyr

859095

trpglyglnglythrglnvalthrvalserser

100105

<210>26

<211>116

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>26

gluserglyglyglyleuvalglnproglyglyserleuglyleuser

151015

cysalaalaserglyphethrpheserthrtyrproleuthrtrpval

202530

argglnalaproglygluglyleuglutrpleuserglyileserser

354045

glyserglyseriletyrtyrglyaspservallysglyargphethr

505560

ileserargaspasnalalysasnthrleutyrleuglnmetasnser

65707580

leulysprogluaspthralavaltyrtyrcysalalysglyglyleu

859095

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100105110

thrvalserser

115

<210>27

<211>115

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>27

gluserglyglyglyleuvalglnproglyglyserleuglyleuser

151015

cysalaalaserglyphethrpheserthrtyrproleuthrtrpval

202530

argglnalaproglygluglyleuglutrpleuserglyileserser

354045

glyserglyseriletyrtyrglyaspservallysglyargphethr

505560

ileserargaspasnalalysasnthrleutyrleuglnmetasnser

65707580

leulysprogluaspthralavaltyrtyrcysalalysglyglyleu

859095

valleuthrproasnglymetasptyrtrpglylysglythrleuval

100105110

thrvalser

115