一种人参皂苷Rk6的制备方法与流程

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种人参皂苷rk6的制备方法。
背景技术：
：三七(panaxnotoginseng)为五加科植物三七的干燥根及根茎，别名山漆、金不换、田漆、田三七、田七、参三七、血参、人参三七、滇三七等，主产于我国云南、广西等地。本品性温，味甘、微苦，无毒。三七生品能消肿止痛，散瘀止血，熟品能补血活血。三七用于治疗疾病已有悠久的历史，为我国常用的传统名贵药材之一。数千年来为中华民族的繁荣作出了巨大的贡献，并深受世界人民的关注与重视。三七中的皂苷成分作为其主要药效物质成分，发挥着至关重要的作用，近年来已有学者采用不同的提取方法从三七不同部位中分离获得一些较为常见的活性皂苷类成分，如人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、人参皂苷rb3、三七皂苷r1等。但三七中存在的皂苷种类及含量有限，其中不包含人参皂苷rk6。而人参皂苷rk6是一种稀有皂苷，有研究表明具有更加显著的药理活性，药用及研究价值极高，但目前无法实现大量制备，因而无法为后期更深入的研究提供原料，严重影响了后期人参皂苷rk6药物开发和药理研究工作。技术实现要素：有鉴于此，针对现有的人参皂苷rk6无法大量制备的问题，本发明目的在于提供一种转化率高的人参皂苷rk6的制备方法。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：一种人参皂苷rk6的制备方法，包括：步骤1：将灵芝菌种接入药用培养基培养，获得灵芝菌种子液；步骤2：取三七药材烘干、粉碎、过筛，制得三七固体培养基；步骤3：将步骤1所述灵芝菌种子液接种到步骤2所述的三七固体培养基中进行发酵，获得含人参皂苷rk6的发酵产物。本发明提供一种人参皂苷rk6的制备方法，包括：步骤1：将灵芝菌种接入药用培养基培养，获得灵芝菌种子液；步骤2：取三七药材烘干、粉碎、过筛，制得三七固体培养基；步骤3：将步骤1所述灵芝菌种子液接种到步骤2所述的三七固体培养基中进行发酵，获得含人参皂苷rk6的发酵产物；步骤4：所述发酵产物经提取、分离纯化，获得人参皂苷rk6；所述提取为：将发酵产物以乙醇加热回流提取，提取液经石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇顺序萃取，收集水饱和正丁醇层。灵芝(ganodermalucidum)是一种珍贵的药用真菌，属于担子菌门，灵芝科，灵芝属。自古以来，灵芝被人们视为“仙草”，具有滋补强壮，扶正固本作用，长期以来被看作珍贵的中药材。本发明所述制备方法以灵芝菌种为原料制备灵芝菌种子液，以三七为原料制备三七固体培养基，然后将灵芝菌种子液接种到三七固体培养基中进行发酵，利用灵芝复杂的酶系促使三七药材中原有的化学成分经过结构修饰或活性位点的改变，转化为人参皂苷rk6，转化率高，可用于人参皂苷rk6的大量制备。本发明提供的制备方法可将三七中存在的原人参三醇型皂苷转化为人参皂苷rk6，转化机理图如图1所示。本发明所述制备方法步骤1利用药用培养基对灵芝菌种进行培养，其中，所述药用培养基配方为：葡萄糖1.9～2.1％，kh2po40.09～0.11％，mgso40.09～0.11％，蛋白胨0.45～0.55％，酵母粉0.18～0.22％，维生素b10.09～0.11％，余量为水。在一些具体实施例中，药用培养基配方为：葡萄糖2％，kh2po40.1％，mgso40.1％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.2％，维生素b10.1％，余量为水。药用培养基按照上述配方进行配制，分装于250ml广口瓶中，包扎后置于压力蒸汽灭菌器中，于121℃灭菌30分钟。培养基冷却后在无菌操作台中接种灵芝菌种，接种的灵芝菌种为斜面菌种。其中，对灵芝菌种进行培养的方式为恒温振荡培养，所述恒温振荡培养为：在转速为150r/min，温度为27～29℃，湿度为39～41％的条件下避光培养5～7天。在一些具体实施例中，恒温振荡培养为：在转速为150r/min，温度为28℃，湿度为40％的条件下避光培养5～7天。本发明所述制备方法步骤2将三七药材于温度为70℃～75℃条件下烘干，粉碎，获得目数为10～60目的三七粉末，制成三七固体培养基。所述三七药材经烘干、粉碎、过筛后还包括加入caco3水溶液和灭菌步骤。具体为：将三七药材于温度为70℃～75℃条件下烘干，粉碎，过筛，获得目数为10～60目的三七粉末，加入caco3水溶液，混合均匀后置于三角瓶内，121℃高压蒸汽灭菌两次，每次30分钟，制成三七固体培养基。其中，三七固体培养基的含水量为50～70％，优选为60％。其中，caco3的质量为三七药材质量的1.5％。本发明所述制备方法步骤3将步骤1所述灵芝菌种子液接种到步骤2所述的三七固体培养基中进行发酵，利用灵芝复杂的酶系促使三七药材中原有的化学成分经过结构修饰或活性位点的改变，转化为人参皂苷rk6。其中，以ml/g计，灵芝菌种子液与三七固体培养基的体积质量比为0.5～1:1～1.5，发酵培养的温度为24～28℃。在一些具体实施例中，灵芝菌种子液与三七固体培养基的体积质量比为1:1，发酵培养的温度为28℃。在一些实施方案中，发酵培养的时间为35天～45天。本发明所述制备方法步骤4将发酵产物经提取、分离纯化，获得人参皂苷rk6。其中，所述提取为采用70％～75％乙醇加热回流提取，提取液脱溶后加水混悬，所得混悬液经石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇顺序萃取，收集水饱和正丁醇层；所述70％～75％乙醇的质量为发酵产物质量的7～8倍，提取次数为3～4次。其中，石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇的体积为所述混悬液体积的1～1.2倍。具体地，分离纯化包括：取所述水饱和正丁醇层浓缩，甲醇溶解后经mci色谱柱，乙醇洗脱，所得洗脱液依次经硅胶gf254薄层检识、开放式ods色谱柱、甲醇洗脱、硅胶gf254薄层检识，以70％甲醇为流动相，经半制备液相获得人参皂苷rk6。其中，所述浓缩至80℃-85℃相对密度为1.21-1.25。所述mci色谱柱口径为6厘米，柱高75厘米。所述开放式ods柱以40-60umods为填料，色谱柱口径为3厘米，柱高40厘米。半制备液相为以70％甲醇为流动相，流速1.2ml/min，检测波长为203nm，收集保留时间为126min的组分。在一个具体实施例中，分离纯化步骤为：取所述水饱和正丁醇层浓缩得浸膏，取浸膏加入甲醇溶解，利用mci色谱柱不同浓度乙醇梯度洗脱，洗脱液经硅胶gf254薄层检识得到富含人参皂苷rk6部分。再将此部分通过开放式ods柱用不同浓度甲醇进行梯度洗脱(纯水→30％甲醇→50％甲醇→70％甲醇→纯甲醇)，洗脱液经硅胶gf254薄层检识再次得到富含人参皂苷rk6部分，将此部分通过半制备液相，收集保留时间为126min的组分，得到人参皂苷rk6。本发明将灵芝菌种与三七进行发酵，利用灵芝复杂的酶系促使三七药材中原有的化学成分经过结构修饰或活性位点的改变，转化为人参皂苷rk6，经检测发酵产物的产率为68～72％，发酵产物中人参皂苷的rk6含量达0.6481～0.8508％，为后期药物开发和药理研究提供原料，对开发具有自主知识产权的新药具有了十分重要的研究意义和社会效益。同时，该方法具有反应快、专属性强、副反应少等优点，且反应条件温和可控，环保无污染。附图说明图1示三七中原人参三醇型皂苷转化为人参皂苷rk6的转化机理图；图2示人参皂苷rk6半制备高效液相色谱图。具体实施方式本发明实施例公开了一种人参皂苷rk6的制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。实施例1本发明制备方法(1)灵芝菌种子液的制备：培养基配方为葡萄糖2％，kh2po40.1％，mgso40.1％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.2％，维生素b10.1％，余量水，ph自然。以上物质置于大烧杯中，加入适量的水制成种子液，待种子液冷却后，分装于250ml广口瓶中，包扎后置于压力蒸汽灭菌器中，于121℃灭菌30分钟。待冷却后，在无菌操作台中用直径为1mm的接种环接入保存好的灵芝斜面3-4块菌种。将接有灵芝菌种的液体培养基放入恒温振荡培养箱中，以150r/min，28℃，湿度40％的条件下避光培养5-7天，待种子液澄清并有大量大小均匀星芒状菌球出现，获得灵芝菌种子液。(2)三七固体培养基的制备：取三七药材，烘干，粉碎，粉末过10目筛不过60目筛，加入caco3水溶液，混合均匀后置于三角瓶内，121℃高压蒸汽灭菌两次，每次30分钟，制得含水量为50％～70％的三七固体培养基；其中，caco3的质量为三七药材质量的1.5％。(3)发酵：在无菌操作台中将灵芝菌种子液接种到三七固体培养基中于恒温培养箱中避光发酵培养，至菌丝布满容器底部为止，将其取出并干燥，得到发酵产物。其中，以ml/g计，灵芝菌种子液与三七固体培养基的体积质量比为0.5～1:1～1.5，发酵培养的温度为24～28℃。(4)提取：将步骤(3)发酵产物用8倍质量70％乙醇加热回流提取3次，每次2.5小时，回收溶剂并挥干至无醇味后用适量水混悬，再经1.2倍体积石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇顺序萃取，收集水饱和正丁醇层。(5)分离纯化：取所述水饱和正丁醇层浓缩，得到相对密度1.21-1.25(80℃-85℃)浸膏，取浸膏加入甲醇溶解，利用mci色谱柱不同浓度乙醇梯度洗脱，洗脱液经硅胶gf254薄层检识得到富含人参皂苷rk6部分。再将此部分通过开放式ods柱用不同浓度甲醇进行梯度洗脱(纯水→30％甲醇→50％甲醇→70％甲醇→纯甲醇)，洗脱液经硅胶gf254薄层检识再次得到富含人参皂苷rk6部分，将此部分通过半制备液相，流速1.2ml/min，检测波长为203nm，收集保留时间为126min的组分(见表124号峰)，得到化合物。半制备液相图谱见图2，液相色谱数据见表1。表1液相分析结果该化合物白色粉末(甲醇)，10％硫酸乙醇溶液显紫红色，molish反应呈阳性，liebermann-burchard反应呈阳性，推测其为三萜皂苷类化合物。hr-esi-ms给出：m/z671.3929([m+ci]-,calc.for671.3926)，结合其nmr可推测其分子式为c36h60o9。1h-nmr(cd3od，500mhz)谱中高场区给出6个角甲基质子信号δh:0.94(3h,s,h-30)、0.99(3h,s,h-19)、1.00(3h,s,h-29,)、1.13(3h,s,h-18)、1.33(3h,s,h-28)、1.67(3h,s,h-27)；3个连氧碳上的质子信号δc:3.11(1h,dd,j＝10.0,5.0)，4.10(1h,td,j＝10.0,5.0hz)，3.53-3.63(1h,m)；两对碳碳双键，3个烯烃质子信号δ:4.70(1h,s),4.89(1h,s)，5.45(1h,t,j＝5.0hz)；1个糖的端基质子信号δ4.35(1h,d,j＝10.0hz,h-1')。13c-nmr(cd3od，150mhz)谱中给出36个碳信号，高场区给出6个角甲基碳信号δc:17.2(c-18)，17.6(c-19)，13.5(c-27)，31.1(c-28)，15.8(c-29)，16.7(c-30)；3个连氧碳信号δc:79.5(c-3)，80.6(c-6)，70.1(c-12)；4个烯碳信号δc:155.6(c-20)，108.3(c-21)，126.6(c-24)，135.6(c-25)；其中δc61.5(c-5)为三醇型皂苷的特征信号，推测化合物为达玛烷三醇型三萜类化合物。结合1h-nmr中相应的糖端基信号表明化合物中存在1组葡萄糖，信号为δc:105.2(c-1')，75.2(c-2')，78.8(c-3')，71.4(c-4')，77.4(c-5')，62.6(c-6')。化合物的碳谱数据与文献中报道的人参皂苷rk3的c-25、c-26、c-27化学位移有差别，由质谱可知比人参皂苷rk3多一个氧原子，根据hmqc和hmbc谱图推断该化合物c-26位多连接一个羟基，使得周边化学环境发生改变。结合化合物的hmqc及hmbc图谱，可知δh2.20(h-23)与δc126.6(c-24)，δc135.6(c-25)，δc68.7(c-26)的碳信号存在远程相关；δh5.45(h-24)与δc27.0(c-23)，δc68.7(c-26)，δc13.5(c-27)的碳信号存在远程相关；δh3.92(h-26)与δc126.6(c-24)，δc135.6(c-25)，δc13.5(c-27)的碳信号存在远程相关；δh1.67(h-27)与δc126.6(c-24)，δc135.6(c-25)，δc68.7(c-26)的碳信号存在远程相关。在hmbc图谱中，可知δh4.35(d,j＝10.0hz,h-1')与δc80.6(c-6)存在远程相关，表明该化合物为6-o-β-d型葡萄糖。综上分析，化合物为3β,6α,12β,26-tetrahydroxydammar-20(21),24(25)(e)-diene-6-o-β-d-glucopyranoside，即人参皂苷rk6，分子式为c36h60o9，结构如式i所示，表2本实施例提取得到的化合物的1h-nmr(c5d5n,500mhz)与13c-nmr(c5d5n,150mhz)数据实施例2不同菌种与三七发酵产物中rk6含量比较利用十三种药用真菌(牛肝菌、木耳、香菇1500、平菇、杏鲍菇、大青菇、白灵菇、树鸡、树舌、云芝、灵芝、灰树花、白树花)分别接种到三七固体培养基中进行发酵，其他条件相同，参照实施例1步骤(1)～(3)，进行，其中，三七固体培养基含水量为50％，灵芝菌种子液v(ml)︰三七固体培养基m(g)＝1:1，发酵培养的温度为24℃。对固态培养基进行观察，结果见表3，检测发酵产物中rk6含量，结果见表4。表3不同菌种与三七发酵情况菌种第一周第二周第三周牛肝菌未发出未发出未发出木耳少量棕色瘤状菌球菌球少量增多无明显变化香菇1500少量白色菌毛菌毛缓慢生长菌毛基本布满平菇少量白色菌毛5cm直径菌丛菌毛密布杏鲍菇长满菌球且球上针状菌丝菌丛缓慢生长菌毛基本布满大青菇稀松白色菌毛少量白色菌毛无明显变化白灵菇少量白色菌丝菌毛缓慢生长菌毛密布树鸡未发出未发出未发出树舌长出菌毛但未扩散无明显变化无明显变化云芝稀松白色菌毛菌毛增多菌毛密布灵芝密布白色菌毛菌毛增多菌毛密布并向瓶底扩散灰树花未发出未发出未发出白树花未发出未发出未发出表4不同菌种与三七发酵产物中rk6含量％rk6含量％三七药材0香菇1500与三七发酵产物0平菇与三七发酵产物0杏鲍菇与三七发酵产物0白灵菇与三七发酵产物0灵芝与三七发酵产物0.6481云芝与三七发酵产物0实施例3最佳工艺优化试验本实施例采用正交试验对步骤(2)～(3)工艺条件进行优化，选取a三七固体培养基含水量(％)、b灵芝菌种子液v(ml)︰三七固体培养基m(g)、c发酵培养温度(℃)为影响因素，因素水平表见表5，正交试验结果见表6，综合评分方差分析见表7。表5因素水平表表6正交实验及结果表7综合评分方差分析表方差来源偏差平方和自由度f值显著性a0.01227.416b0.075247.219*c0.01126.653d0.01529.708f1-0.10(2,2)＝9.00f1-0.05(2,2)＝19.00由以上结果可知，三个影响因素的主次顺序为：b灵芝菌种子液v(ml)︰三七固体培养基m(g)>a三七固体培养基含水量％>c发酵培养温度(℃)，其中，b因素：灵芝菌种子液v(ml)︰三七固体培养基m(g)对产物rk6含量有显著影响。综合考虑，确定最佳发酵条件为：a2b2c3，即三七固体培养基含水量60％，灵芝菌种子液v(ml)︰三七固体培养基m(g)＝1:1，发酵培养温度28℃。实施例4最佳工艺条件下制备人参皂苷rk6(1)灵芝菌种子液的制备：培养基配方为葡萄糖2％，kh2po40.1％，mgso40.1％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.2％，维生素b10.1％，余量水，ph自然。以上物质置于大烧杯中，加入适量的水制成种子液，待种子液冷却后，分装于250ml广口瓶中，包扎后置于压力蒸汽灭菌器中，于121℃灭菌30分钟。待冷却后，在无菌操作台中用直径为1mm接种环接入保存好的灵芝斜面3-4块菌种，将接有灵芝菌种的液体培养基放入恒温振荡培养箱中，以150r/min，28℃，湿度40％的条件下避光培养5-7天，待种子液澄清并有大量大小均匀星芒状菌球出现，获得灵芝菌种子液。(2)三七固体培养基的制备：取三七药材，烘干，粉碎，粉末过10目筛不过60目筛，加入caco3水溶液，混合均匀后置于三角瓶内，121℃高压蒸汽灭菌两次，每次30分钟，制得含水量为60％的三七固体培养基；其中，caco3的质量为三七药材质量的1.5％。(3)发酵：在无菌操作台中将100ml灵芝菌种子液接种到100g三七固体培养基中于恒温培养箱中避光发酵培养，至菌丝布满容器底部为止，将其取出并干燥，得到发酵产物。其中，以ml/g计，灵芝菌种子液与三七固体培养基的体积质量比为1:1，发酵培养的温度为28℃。(4)提取：将步骤(3)所得发酵产物用8倍量70％乙醇加热回流提取3次，每次2.5小时，脱溶后用适量水混悬，再经1.2倍体积石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇顺序萃取，收集水饱和正丁醇层。本发明对各萃取层中rk6含量进行了检测，结果见表8。表8不同萃取溶剂中人参皂苷rk6含量(％)样品人参皂苷rk6含量％石油醚层0.0020乙酸乙酯层0.0128水饱和正丁醇层0.7106(5)分离纯化：取所述水饱和正丁醇层浓缩，得到相对密度1.21-1.25(80℃-85℃)浸膏，取浸膏加入甲醇溶解，利用mci色谱柱不同浓度乙醇梯度洗脱，洗脱液经硅胶gf254薄层检识得到富含人参皂苷rk6部分。再将此部分通过开放式ods柱用不同浓度甲醇进行梯度洗脱(纯水→30％甲醇→50％甲醇→70％甲醇→纯甲醇)，洗脱液经硅胶gf254薄层检识再次得到富含人参皂苷rk6部分，将此部分通过半制备液相，以70％甲醇为流动相，检测波长203nm，获得人参皂苷rk6单体化合物。经检测，步骤(3)发酵产物中人参皂苷rk6含量为0.8508％。实施例5本发明制备方法(1)灵芝菌种子液的制备：培养基配方为葡萄糖2.1％，kh2po40.09％，mgso40.11％，蛋白胨0.45％，酵母粉0.22％，维生素b10.11％，ph自然。以上物质置于大烧杯中，加入适量的水制成种子液，待种子液冷却后，分装于250ml广口瓶中，包扎后置于压力蒸汽灭菌器中，于121℃灭菌30分钟。待冷却后，在无菌操作台中用直径为1mm接种环接入保存好的灵芝斜面3-4块菌种，将接有灵芝菌种的液体培养基放入恒温振荡培养箱中，以150r/min，28℃，湿度40％的条件下避光培养5-7天，待种子液澄清并有大量大小均匀星芒状菌球出现，获得灵芝菌种子液。(2)三七固体培养基的制备：取三七药材，烘干，粉碎，粉末过10目筛不过60目筛，加入caco3水溶液，混合均匀后置于三角瓶内，121℃高压蒸汽灭菌两次，每次30分钟，制得含水量为70％的三七固体培养基；其中，caco3的质量为三七药材质量的1.5％。(3)发酵：在无菌操作台中将100ml灵芝菌种子液接种到150g三七固体培养基中于恒温培养箱中避光发酵培养，至菌丝布满容器底部为止，将其取出并干燥，得到发酵产物。其中，以ml/g计，灵芝菌种子液与三七固体培养基的体积质量比为1:1.5，发酵培养的温度为26℃。(4)提取：将步骤(3)所得发酵产物用8倍量70％乙醇加热回流提取3次，每次2.5小时，回收溶剂并挥干至无醇味后用适量水混悬，再经1.2倍体积石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇顺序萃取，收集水饱和正丁醇层。(5)分离纯化：取所述水饱和正丁醇层浓缩，得到相对密度1.21-1.25(80℃-85℃)浸膏，取浸膏加入甲醇溶解，利用mci色谱柱不同浓度乙醇梯度洗脱，洗脱液经硅胶gf254薄层检识得到富含人参皂苷rk6部分。再将此部分通过开放式ods柱用不同浓度甲醇进行梯度洗脱(纯水→30％甲醇→50％甲醇→70％甲醇→纯甲醇)，洗脱液经硅胶gf254薄层检识再次得到富含人参皂苷rk6部分，将此部分通过半制备液相，以70％甲醇为流动相，检测波长203nm，获得人参皂苷rk6单体化合物。经计算，步骤(3)发酵产物中人参皂苷rk6含量为0.7102％。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。当前第1页12