一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法及其试剂盒与流程

本发明涉及基因检测
技术领域：
，尤其涉及一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法和试剂盒。
背景技术：
：遗传性扩张型心肌病(dilatedcardiomyopathy，dcm)是一种诱因多样，以心肌扩张和收缩功能障碍为主要特征的心肌病，最终导致心力衰竭。其发病率约为1/250，约20％-35％的dcm患者表现为家族性，其余多为散发性dcm。遗传性dcm的外显度与年龄成正相关，且在同一家族内，患者的发病年龄与临床表现都可能存在较大差异。dcm还可能伴有肌营养不良、传导系统疾病和可能致命的心律不齐。dcm的主要临床症状包括心律不齐、呼吸困难、易疲劳、昏厥以及腿脚出汗等。大多数患者在中年期开始出现心脏扩大，但也可以发生于从婴幼儿期到老年期的任何一个时间点。dcm的临床表型复杂，同一家庭内不同成员间的发病时间和疾病严重程度都存在显著差异。对于某些患者来说，其疾病的首发症状即为心源性猝死。因此，对于dcm患者来说，早发现、早诊断和早治疗都可以有效的降低疾病的危害、减少猝死的发生。通常情况下，dcm表现为常染色体显性遗传，但是也有少数关于x连锁、常染色体隐性遗传和线粒体遗传模式的报道。dcm的遗传因素主要是编码心肌肌小节、细胞骨架及其相关蛋白的基因变异，但也包括一些其他在心肌细胞功能中起到重要功能的蛋白编码基因变异。虽然家族性dcm被认为是非综合征型的，且仅影响心脏，但实际上，dcm也可能作为影响人体其他器官和组织的综合征的临床表现的一部分出现，且多为非肌小节或细胞骨架相关蛋白突变引起的。此外，dcm也存在非遗传性诱因，如病毒感染和慢性酒精中毒。单凭借其临床表型有时很难对不同诱因的dcm进行区分，尤其对于相关经验不足的医生来说。这种情况下，基因检测就显示出无可比拟的优势，可在患者症状表现完全之前就明确诊断，且可以提供一定程度上的临床指导。ankrd1(ankyrinrepeatdomain1)该基因编码的蛋白定位于内皮细胞的细胞核，通过il-1和tnf-的刺激诱导。对大鼠心肌细胞的研究表明，该基因作为转录因子发挥作用。该蛋白与肌钙蛋白肌肽和肌钙蛋白之间的相互作用表明，它也在肌原纤维拉伸传感器系统中起作用。bag3(bcl2associatedathanogene3)bag编码蛋白与hip竞争性结合hsc70/hsp70atp结构域。肌小节的z盘结构上并在该结构上呈现高表达水平的bcl-2相关抗凋亡蛋白3(bcl-2associatedathanogene3，bag3)的基因变异同dcm相关。2011年，villarde首次报道了bag3基因上的rs2234962多态位点与dcm导致的心衰有关，提示bag3基因可能是导致dcm发病的候选基因，随后在日本家族性dcm患者中也发现bag3基因突变点arg218trp和leu462pro以及相关的多态点(rs3858339、rs196295、rs117671123、rs78439745、rs3858340)与dcm有关。ldb3(limdomainbinding3)该基因编码含有pdz域的蛋白质。pdzmotifs是由80-120个氨基酸残基组成的模块化蛋白-蛋白相互作用域。含有pdz域的蛋白质在细胞骨架组装中相互作用，或与其他涉及膜蛋白靶向和聚类的蛋白相互作用。该基因编码的蛋白通过其n端pdz域与-actinin-2相互作用，通过其c端lim域与蛋白激酶c相互作用。lim域是一个富含半胱氨酸的基序，由包含两个锌结合模块的50-60个氨基酸定义。这种蛋白质也与肌凝蛋白家族的所有三个成员相互作用。该基因的突变与肌原纤维肌病和扩张型心肌病有关。myh6(myosinheavychain6)心肌肌球蛋白是由两个重链亚基、两个轻链亚基和两个调控亚基组成的六聚体。该基因编码心肌肌球蛋白的重链亚基。该基因位于编码心肌肌球蛋白-重链亚基的基因下游约4kb处。该基因突变导致家族性肥厚性心肌病和房间隔缺损3。rbm20(rnabindingmotifprotein20)该基因编码的蛋白，能与rna结合并调节剪接。该基因突变与家族性扩张型心肌病有关。tcap(titin-cap)该基因编码在横纹肌和心肌中发现的一种蛋白质，它与肌动蛋白z1-z2结构域结合，是肌动蛋白激酶的底物，这种相互作用被认为对肌动蛋白组装至关重要。有研究表明该基因变异导致该基因编码蛋白功能异常，与心肌病有关。tnnc1(troponinc1,slowskeletalandcardiactype)肌钙蛋白是横纹肌收缩的中枢调节蛋白，与原肌凝蛋白一起位于肌动蛋白丝上。肌钙蛋白由3个亚基组成:tni，是肌动球蛋白atp酶的抑制剂；tnt，含有原肌凝蛋白的结合位点；tnc是由这个基因编码的蛋白质。钙与tnc的结合消除了tnt的抑制作用，从而使肌动蛋白与肌球蛋白相互作用，atp水解，产生张力。这种基因的突变与1z型扩张型心肌病有关。ttn(titin)这个基因编码横纹肌的大量蛋白质。该基因的产物分为n端i带和c端a带两个区域。i带是分子的弹性部分，在pevk区域的两侧包含两个富含脯氨酸、谷氨酸、缬氨酸和赖氨酸的串联免疫球蛋白结构域。a带被认为是蛋白功能的主要部分，它包含了免疫球蛋白和纤维连接蛋白重复序列的混合物，并且具有激酶活性。一个n端z-disc区域和一个c端m-line区域分别与肌节的z-line和m-line结合，使单个titin分子的长度达到肌节长度的一半。titin还含有肌肉相关蛋白的结合位点，因此它可以作为肌肉细胞中收缩机制组装的粘附模板。它也被确认为是染色体的结构蛋白。这种基因的选择性剪接会导致多种转录变体。titin的i-带、m-line和z-disc区域存在较大的变异性。i-带区域的变异性导致了不同titin亚型弹性的差异，从而导致了不同肌肉类型弹性的差异。该基因的突变与家族性肥厚性心肌病有关。vcl(vinculin)粘着蛋白是一种与细胞-细胞和细胞-基质连接相关的细胞骨架蛋白，也是几种参与将f-肌动蛋白固定到细胞膜上的相互作用蛋白之一。vcl缺陷是1w型心肌病扩大的原因。扩张型心肌病是一种以心室扩张和收缩功能受损为特征的疾病，导致充血性心力衰竭和心律失常。该基因已发现多种可选择性剪接的转录本变体，但一些变体的生物学有效性尚未确定。myh7(myosinheavychain7)是一种编码心脏β-肌球蛋白重链的基因。myh7是肥厚性心肌病(hcm)最重要的致病基因，约30％-50％的hcm患者主要是由myh7基因突变所致。心脏β-肌球蛋白重链是人心室肌球蛋白的主要成分，在心肌细胞的能量供应和维持心肌细胞内外钙离子的浓度起到非常重要的作用。myh7基因定位于14q12，含有40个外显子，其中38个外显子参与编码含1935个氨基酸残基的蛋白质。编码的蛋白具有3个功能区：球状头部区s1、头杆结合s2和杆状尾部区，头部区包含atp酶活性位点和与肌动蛋白结合位点以及与必须链(elc，essentiallightchain)结合的界面，是肌球蛋白的重要功能区域。国内外已报道超过200多种单碱基突变，某些突变可表现出外显率高、症状出现早、进展快、心肌肥厚重、已出现心力衰竭甚至猝死等恶性表现。总体来说该基因的突变与家族性肥厚性心肌病、肌球蛋白贮存性肌病、扩张型心肌病和laing早期远端肌病有关。tnni3(troponini3)是一种编码心脏肌钙蛋白i的基因。肌钙蛋白i(tni)与肌钙蛋白t(tnt)、肌钙蛋白c(tnc)是构成横纹肌细丝肌钙蛋白复合体的三个亚基。tni是抑制亚单位，阻断肌动蛋白-肌球蛋白的相互作用，从而调节横纹肌松弛。该基因编码tni-心脏蛋白，在心肌组织中唯一表达。ctni基因全长612kb，含8个外显子，该基因突变导致家族性肥厚性型心肌病和家族性限制性心肌病。tnnt2(troponint2,cardiactype)是一种编码心脏肌钙蛋白t的基因，位于染色体1q32，约17kb，由17个外显子组成。肌钙蛋白t能与肌钙蛋白c、肌钙蛋白i、原肌球蛋白结合，在ca2+调节细肌丝的活动过程中起关键作用。目前已经发现了tnnt2的30种不同的突变。在各种tnnt2基因突变(错义突变、剪接信号突变、小片段缺失)导致的hcm约占所有hcm的15％。tpm1(tropomyosin1)是一种编码α原肌球蛋白的基因。该基因位于染色体15q22，大小为32.7kda，含284个氨基酸。该基因编码的产物属于原肌球蛋白家族，属于高度保守、分布广泛的肌动蛋白结合蛋白，存在于收缩系统的横纹肌和平滑肌，以及非肌肉细胞的细胞骨架。原肌球蛋白由两条平行的多肽链组成α螺旋构型，每条原肌球蛋白首尾相接形成一条连续的链同肌动蛋白细肌丝结合,正好位于双螺旋的沟(grooves)中。该基因编码的产物结构是α螺旋链，是形成横纹肌的主要原肌球蛋白，具有调节肌动蛋白和肌球蛋白之间的钙依赖相互作用的功能。mybpc3(myosinbindingproteinc,cardiac)是一种编码心肌肌球蛋白结合蛋白的基因。心肌肌球蛋白结合蛋白-c位于心肌肌小节中的c区，约占肌原纤维中蛋白总数的2％。该蛋白属于免疫球蛋白超家族，只在心脏中表达。其编码基因mybpc3位于染色体11p11.2，含35个外显子，表达1274个氨基酸残基。其蛋白由11个主要子域构成，编号c0-c10。心肌肌球蛋白结合蛋白属细胞内球蛋白超家族，与肌球蛋白结合位点位于c8～c10结构域。结合了mybp-c的肌凝蛋白和肌联蛋白，有更加稳定的肌小节结构。心肌肌球蛋白结合蛋白在c1、c2结构域之间有1个特有的n末端模序，作为camp依赖的蛋白激酶以及钙调蛋白依赖的蛋白激酶的作用位点。磷酸化心肌特定的模序调节心肌收缩力，故mybp-c不仅参与心肌结构的维持，还参与细胞内信息传递，影响肌丝的舒缩运动。mybpc3基因突变多为缺失、插入、重复等，导致产生一种缺少肌球蛋白和肌蛋白集合位点的平截蛋白，从而造成肌小节结构和功能损害。scn5a(sodiumvoltage-gatedchannelalphasubunit5)基因负责编码钠通道蛋白的ɑ亚单位(nav1.5)，nav1.5调控着心肌细胞的钠内流。nav1.5除影响到钠内流和细胞除极外，还和诸多的心肌细胞骨架蛋白、肌节蛋白相互联系，因而，scn5a基因突变导致的nav1.5结构的异常，不但会引起心脏节律的异常，还可导致心脏结构的异常。该基因的缺陷是长qt综合征3型(lqt3)的原因之一，这是一种常染色体显性心脏病。传统的sanger测序技术检测ankrd1、bag3、ldb3、lmna、mybpc3、myh6、myh7、rbm20、scn5a、tcap、tnnc1、tnni3、tnnt2、tpm1、ttn、vcl基因的编码氨基酸的外显子区域及附近内含子区域的基因突变存在很大局限性，表现在：检测通量受到限制，该方法仅适用于少数明确突变热点的检测，而对于候选基因数量多且为候选基因的全部编码区段时难以实现的。需要消耗大量时间，且对于待检测样本的基因组dna消耗巨大，在实践中同一样本难以获得满足检测需求的足量dna。因而在日常实践中难以采用sanger方法进行多基因全部编码区段的检测需求。采用高通量基因测序技术检测ankrd1、bag3、ldb3、lmna、mybpc3、myh6、myh7、rbm20、scn5a、tcap、tnnc1、tnni3、tnnt2、tpm1、ttn、vcl的基因突变，需要进行测序前样本文库的制备。如在样本文库制备过程中采用多重pcr方法进行目标区域扩增，会存在扩增偏向性，导致目标区域扩增不均，而对后续测序数据产生偏向性影响。因此，有必要寻找一种新的检测遗传性扩张型心肌病的基因突变的方法，提高诊断准确率，降低成本和劳动强度。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法，该方法建库步骤简便快速，变异类型全面、待测目标区域覆盖完全、测序数据无偏向性、可同时对多个样本进行检测通量高。本发明的另一目的是提供该方法获得的遗传性扩张型心肌病的基因检测文库。本发明的另一目的是提供所述文库制备的遗传性扩张型心肌病的基因检测试剂盒。为实现上述目的，本发明提供了一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库，涉及ankrd1、bag3、ldb3、lmna、mybpc3、myh6、myh7、rbm20、scn5a、tcap、tnnc1、tnni3、tnnt2、tpm1、ttn、vcl的基因突变。为保证目标区域全部覆盖，制备文库后采用杂交探针捕获的方法获得目标区域文库，而后采用lmpcr方法扩增文库，再进行文库纯化得到测序基因检测文库。本发明的一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法，包括如下步骤：(1)dna质量标准：提供受试者样本的基因组dna，经过核酸提取、质检后，要求dna符合一定质控标准；(2)文库制备：将上述符合标准基因组dna，超声随机打断至180bp-220bp短片段，然后进行末端补平加a,连接接头，并通过pcr扩增达到一定总量的dna文库，该文库满足illumina测序平台专用测序要求；(3)杂交捕获：将步骤2得到的dna文库，与疾病相关定制探针进行特异性杂交，捕获含目的区域的文库，再通过磁珠抓取、富集留下含目的区域的dna文库，即得目标区域文库；(4)lmpcr扩增：将步骤3得到的目标区域文库，作为lmpcr模板，加入与测序接头匹配的引物及相应试剂，进行扩增；扩增后加入磁珠纯化，即得纯化文库；(5)文库质控：将步骤4得到的纯化文库进行质控，选择qubit3.0进行定量检测，agilent2100或agilent4200进行定性检测，查看文库片段分布是否符合要求。本发明上述的遗传性扩张型心肌病的基因检测文库构建方法，所述目标区域包含以下基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)：ankrd1、bag3、ldb3、lmna、mybpc3、myh6、myh7、rbm20、scn5a、tcap、tnnc1、tnni3、tnnt2、tpm1、ttn、vcl。上述步骤(1)中所述的核酸提取的样本类型包括但不限于外周血、组织器官样本等，优选核酸样本为新鲜外周血。上述步骤(1)中所述的dna质控标准为，dna完整性较好，无蛋白rna污染，dna浓度≥20ng/μl；dna纯度：od260/2801.8-2.0，od260/230>2.0；dna总起始量:0.1ug-1ug。上述步骤(1)中所述的核酸提取方法、dna质控方法均按照现有技术的操作规程进行。上述步骤(2)中将符合标准的基因组dna进行超声随机打断，超声打断的反应体系及反应条件见表1。表1超声打断的反应体系及反应条件上述步骤(2)中所述的末端补平加a的反应是指dna随机片段化至180-220bp，通过5'→3'聚合酶及3'→5'外切酶作用，进行末端补平,同时5'端进行磷酸化，其次3'加a，以便和测序接头进行连接。反应体系及反应条件见表2。表2末端补平加a的反应体系及反应条件上述步骤(2)中所述连接接头反应包括连接接头反应、消化反应、及纯化反应。进一步说明，所述的接头是指在dna片段两端连接通用接头，结构为发夹环状接头，以此来提高接头连接效率。所述的消化反应是指连接接头反应后加入消化酶反应。所述纯化反应是指消化后的dna文库中加入ampurexp纯化磁珠进行片段选择，先加入部分磁珠吸附后留取上清，磁珠吸附大片段丢弃，再加入部分磁珠正常纯化洗脱，即可。所述步骤(2)的连接接头的反应体系及反应条件见表3表3连接接头的反应体系及反应条件测序接头序列：5′-/5phos/gatcggaagagcacacgtctgaactccagtc/index/acactctttccctacacgacgctcttccgatc*t-3′上述步骤(2)中所述的pcr扩增反应包括pcr扩增反应及磁珠纯化，修饰后的dna片段经过纯化后，通过特定序列引物进行扩增，并引入样本标签。样本标签为6bp碱基组成，可作为样本的唯一标识。最后得到的dna文库含有和illumina测序平台芯片结合的特定序列p5、p7以及测序引物序列，其中p7端含有样本标签，长度6bp，其测序模板具体结构如下：p5+read1测序引物+插入dna+read2测序引物+index(6bp)+p7具体序列一端为：aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct另一端序列为：atcggaagagcacacgtctgaactccagtcac*nnnnnn*atctcgtatgccgtcttctgcttg,其中nnnnnn代表6bp碱基样本标签。具体反应体系及反应条件见表4表4pcr扩增的反应体系及反应条件通用引物序列：5′-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatc*t-3′含样本标签引物：5‘-caagcagaagacggcatacgagattgxxxxxxgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc-s-t-3′(xxxxxx表示样本标签，有6个碱基随机组合，具体如下表；-s-表示硫代磷酸修饰)见表5表5样本标签引物序列本发明上述步骤(3)所用探针为本发明关键之处，探针是根据与疾病相关的目标区域特异定制的，可以完整覆盖目标区域(外显子区域及外显子上下游各20碱基区域)，从而提高捕获目标片段的效率，达到检测相关疾病突变位点的目的。通过一系列封闭方法，例如利用cotdna将基因组中重复序列封闭，利用特定引物序列封闭接头序列等，配制最优的杂交反应条件，反应16h-20h，进一步提高捕获目标区域的特异性，提高捕获效率。定制探针有生物素修饰，待杂交后，通过链霉亲和素标记的磁珠富集文库。所述目标区域包含以下基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)：ankrd1、bag3、ldb3、lmna、mybpc3、myh6、myh7、rbm20、scn5a、tcap、tnnc1、tnni3、tnnt2、tpm1、ttn、vcl。进一步优选，本发明步骤(3)将步骤2得到的dna文库进行文库混样(样品≤6)，总量至少1-1.5μg(优选1.25μg)。将不同样本标签的文库等量混合，加入样本标签对应的封闭引物试剂封闭dna，浓缩烘干至干粉，再加入杂交缓冲液(tris、edta、nacl)，混匀孵育，然后加入定制探针反应，反应结束后，加入预先处理的特定磁珠纯化，富集捕获到的目的区域dna片段，反应体系及反应条件见表6。该步骤将不同样本标签样本进行混样杂交捕获，在一定程度上节省成本。本发明上述所述的杂交反应结束后(探针与目标区域片段特异性结合)，选用有链霉亲和素标记的特定磁珠，可特异性抓取有生物素标记的探针，进行纯化清洗，从而富集目标区域片段。表6杂交反应体系组分及反应条件所述封闭引物试剂为aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct标签封闭引物试剂：caagcagaagacggcatacgagatnnnnnngtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct,nnnnnn于样本标签index碱基反向互补配对。针对基因rbm20的定制探针的序列seqidno1至seqidno7。针对基因bag3的定制探针的序列seqidno8至seqidno9.针对基因vcl的定制探针的序列seqidno10至seqidno20。针对基因ldb3的定制探针的序列seqidno21至seqidno27。针对基因ankrd1的定制探针的序列seqidno28至seqidno32。针对基因mybpc3的定制探针的序列seqidno33至seqidno41。针对基因myh6的定制探针的序列seqidno42至seqidno57.针对基因myh7的定制探针的序列seqidno58至seqidno74针对基因tpm1的定制探针的序列seqidno75至seqidno80.针对基因tnni3的定制探针的序列seqidno81至seqidno82.针对基因lmna的定制探针的序列seqidno83至seqidno87.针对基因tpm1的定制探针的序列seqidno87至seqidno94.针对基因ttn的定制探针的序列seqidno95至seqidno256.针对基因scn5a的定制探针的序列seqidno257至seqidno272针对基因tnnc1的定制探针的序列seqidno273至seqidno278。针对基因tcap的定制探针的序列seqidno279至seqidno281.本发明步骤(4)中利用lmpcr将捕获的目的区域片段进行pcr扩增以使文库总量能够满足上机测序要求，其反应体系及条件见表6：反应结束后进行磁珠纯化得到最终的上机文库。所述的磁珠纯化方法：将dna文库加入纯化磁珠，置于磁力架上，直到溶液澄清后弃掉上清，使用乙醇清洗磁珠，离心，吸尽残余液体，干燥，加入tris-edta缓冲液,吹吸混匀，室温放置，澄清后即得纯化文库；表7lmpcr扩增反应体系所述p5引物序列：5'-aatgatacggcgaccaccga所述p7引物序列：5'-caagcagaagacggcatacga上述步骤(5)所述文库质控，要先进行定量检测，可选择qubit3.0仪器，得到文库浓度总量≥0.5ug，其次进行定性质控，可选择agilent2100/4200仪器，要求片段范围在150-500bp之间；上机测序前可进行实时荧光定量pcr进行文库定量，用与p5、p7引物特异扩增满足测序要求的文库，绘制标准曲线，确定合适的文库上机浓度。具体反应体系及反应条件按照下表8(配套仪器abi7500/7300standard)。表8p5、p7引物扩增体系及条件上游引物序列5'-aatgatacggcgaccaccga下游引物序列5'-caagcagaagacggcatacga本发明的构建方法还包括上机测序过程及数据分析过程。本发明的一种实施方式，一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特包括如下步骤：(1)核酸提取及质检：外周血样本经过核酸提取、质检后，要求其符合一定质控标准：dna完整性较好，无蛋白rna污染，dna浓度≥20ng/μl；dna纯度：od260/2801.8-2.0，od260/230>2.0；dna总起始量:0.1μg-1μg；(2)文库制备：利用上述dna，取样后用tris-edta补至52.5μl，于covaris仪器上根据相应参数，进行超声打断，将基因组dna随机打断至180-220bp短片段；然后进行末端补平加a,反应体系为：tris-edta稀释的dna50μl，末端补平加a反应缓冲液7μl，末端补平加a酶混合液3μl，合计60μl，反应条件为：20℃保持30min，65℃保持30min，最后保持4℃；再进行接头连接，反应体系为末端补平的dna60μl，连接反应缓冲液及连接酶30μl，测序接头2.5μl，高浓度mg2+缓冲液1μl，合计93.5μl，反应条件：20℃保持15min，并保持20℃；反应结束后，加入3μluser消化酶，37℃保持15min；反应结束后，加入ampurexp纯化磁珠进行片段选择，先加入45μl磁珠吸附后留取上清，磁珠吸附大片段丢弃，再加入15μl磁珠正常纯化洗脱；最后以纯化的dna为模板进行pcr扩增，反应体系为：dna模板20μl，2xpcr扩增反应酶及缓冲液25μl，通用引物2.5μl，含样本标签引物2.5μl，合计50μl，反应条件为：98℃保持30s，然后进行4个循环，每个循环为98℃保持10s，65℃保持75s，然后65℃保持5min，最后保持在10℃；结束后加入90μl磁珠进行纯化；(3)杂交捕获：进行文库混样，将带有不同样本标签的文库，等量进行混合(不超过6个样本)，总量需要达到1.25ug；混匀后取样1ug，加入样本标签对应的封闭引物试剂2μl，封闭dna5ug，真空浓缩仪60℃浓缩烘干至干粉；再加入2x杂交缓冲液7.5μl，杂交试剂a3μl，混匀95℃孵育10min，然后加入定制探针4.5μl，混匀后热盖57℃，反应47℃孵育16h-20h；反应结束后，加入100μl预先处理的特定磁珠，富集捕获到的目的区域dna片段；(4)lmpcr扩增：将步骤(3)获得的杂交捕获富集的dna作为模板，配制反应体系：模板20μl，2xpcr反应酶及缓冲液25μl，p5p7引物5μl，反应条件：98℃保持45s，然后进行14个循环，每个循环为98℃保持15s，60℃保持30s，72℃保持30s，然后72℃保持1min，最后保持在4℃；反应结束后加入90μl磁珠纯化得到最终上机测序文库；(5)将步骤(4)中获得的最终文库按照以下方法进行质控：取样1μl，使用qubithsdsdna试剂盒定量，得到文库浓度；根据定量浓度进行合理稀释，在agilent2100或者4200仪器，选择合适的试剂进行检测，核查文库片段分布范围；上机前，使用荧光定量pcr方法进行有效模板定量，梯度稀释标准品分别是20pm，2pm,0.2pm,0.002pm,0.0002pm，0.00002pm；将样本文库稀释至2-10pm，按照下述配制试剂：2×sybrgreenmastermix25μl、p5p7引物2μl、无核酸酶水4μl，样本标准品4μl；反应条件(abi7500)：95℃保持5min，然后35个循环，每个循环95℃保持30sec，60℃保持45s，熔解曲线95℃保持15s，60℃保持60s，95℃15s；(6)上机测序：根据定量浓度，确定上机最终浓度，于nextseq550ar测序仪上上机，按照仪器操作规程进行测序，使用nextseq500/550midoutputkitv2(300cycles)；然后将数据上传服务器，由遗传咨询师对得到的数据进行分析及解读。本发明的另一技术方案是该方法获得的遗传性扩张型心肌病的基因检测文库。本发明的另一技术方案是所述文库制备的遗传性扩张型心肌病的基因检测试剂盒，其包括文库构建试剂、杂交探针序列、引物序列。本发明所述的构架试剂包括：tris-edta稀释液、末端补平加a反应缓冲液、末端补平加a酶混合液、连接反应缓冲液及连接酶、高浓度mg2+缓冲液、pcr扩增反应酶及缓冲液、封闭引物试剂、杂交缓冲液、杂交试剂a。所述的杂交探针序列包括seqidno1至seqidno281。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1、本发明的文库采用高通量测序探针杂交捕获的方法检测ankrd1、bag3、ldb3、lmna、mybpc3、myh6、myh7、rbm20、scn5a、tcap、tnnc1、tnni3、tnnt2、tpm1、ttn、vcl的基因突变，探针针对目标区域进行定制，充分考虑目标区域的覆盖比例，保证突变的有效捕获，使之变异类型全面，准确率高，灵敏度高。同时可以选择一捕多个样本，节省了成本。2、该文库涵盖了心律失常的相关基因，结合illumina高通量测序仪，可快速准确得到相关基因变异，对遗传性扩张型心肌病有重要意义。3、所用探针为本发明关键之处，探针是根据与疾病相关的目标区域特异定制的，可以完整覆盖目标区域(外显子区域及外显子上下游各20碱基区域)，从而提高捕获目标片段的效率，达到检测相关疾病突变位点的目的。通过一系列封闭方法，例如利用cotdna将基因组中重复序列封闭，利用特定引物序列封闭接头序列等，配制最优的杂交反应条件，反应16h-20h，进一步提高捕获目标区域的特异性，提高捕获效率。定制探针有生物素修饰，待杂交后，通过链霉亲和素标记的磁珠富集文库。4、本发明的文库避免了多重pcr法扩增目标区域，避免pcr引入的碱基错配，同时通用于不同的复杂dna样本。5、本发明的文库依托于illumina高通量测序平台，检测通量大大提高。附图说明图1是根据本发明的方法构建的外周血dna文库2100生物分析仪检测结果。图2是根据本发明的文库构建及测定流程图。具体实施方式下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。实施例1采用4个外周血样本样本进行文库构建，采用包含ankrd1、bag3、ldb3、lmna、mybpc3、myh6、myh7、rbm20、scn5a、tcap、tnnc1、tnni3、tnnt2、tpm1、ttn、vcl基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)作为目标区域的引物池进行多重反应pcr，并结合高通量测序平台miseq进行dna测序，然后检测点突变(snp)、小片段插入缺失(indel)。具体操作流程如下：(1)核酸提取及质检：外周血样本经过核酸提取、质检后，要求其符合一定质控标准：dna完整性较好，无蛋白rna污染，dna浓度≥20ng/μl；dna纯度：od260/2801.8-2.0，od260/230>2.0；dna总起始量:0.1μg-1μg。(2)文库制备：利用上述dna，取样后用tris-edta补至52.5μl，于covaris仪器上根据相应参数，进行超声打断，将基因组dna随机打断至180-220bp短片段。然后进行末端补平加a,反应体系为：tris-edta稀释的dna50μl，末端补平加a反应缓冲液7μl，末端补平加a酶混合液3μl，合计60μl，反应条件为：20℃保持30min，65℃保持30min，最后保持4℃；再进行接头连接，反应体系为末端补平的dna60μl，连接反应缓冲液及连接酶30μl，测序接头2.5μl，高浓度mg2+缓冲液1μl，合计93.5μl，反应条件：20℃保持15min，并保持20℃；反应结束后，加入3μluser消化酶，37℃保持15min；反应结束后，加入ampurexp纯化磁珠进行片段选择，先加入45μl磁珠吸附后留取上清(磁珠吸附大片段丢弃)，再加入15μl磁珠正常纯化洗脱。最后以纯化的dna为模板进行pcr扩增，反应体系为：dna模板20μl，2xpcr扩增反应酶及缓冲液25μl，通用引物2.5μl，含样本标签引物2.5μl，合计50μl。反应条件为：98℃保持30s；然后进行4个循环，每个循环为98℃保持10s，65℃保持75s；然后65℃保持5min；最后保持在10℃。结束后加入90μl磁珠进行纯化。(3)杂交捕获：进行文库混样，将带有不同样本标签的文库，等量进行混合(不超过6个样本)，总量需要达到1.25ug。混匀后取样1ug，加入样本标签对应的封闭引物试剂2μl，封闭dna5ug，真空浓缩仪60℃浓缩烘干至干粉。再加入2x杂交缓冲液7.5μl，杂交试剂a3μl，混匀95℃孵育10min，然后加入定制探针4.5μl，混匀后热盖57℃，反应47℃孵育16h-20h。反应结束后，加入100μl预先处理的特定磁珠，富集捕获到的目的区域dna片段。(4)lmpcr扩增：将步骤(3)获得的杂交捕获富集的dna作为模板，配制反应体系：模板20μl，2xpcr反应酶及缓冲液25μl，p5p7引物5μl。反应条件：98℃保持45s；然后进行14个循环，每个循环为98℃保持15s，60℃保持30s，72℃保持30s；然后72℃保持1min；最后保持在4℃。反应结束后加入90μl磁珠纯化得到最终上机测序文库。(5)将步骤(4)中获得的最终文库按照以下方法进行质控：取样1μl，使用qubithsdsdna试剂盒定量，得到文库浓度。根据定量浓度进行合理稀释，在agilent2100或者4200仪器，选择合适的试剂进行检测，核查文库片段分布范围。上机前，使用荧光定量pcr方法进行有效模板定量，梯度稀释标准品分别是20pm，2pm,0.2pm,0.002pm,0.0002pm，0.00002pm。将样本文库稀释至2-10pm，按照下述配制试剂：2×sybrgreenmastermix25μl、p5p7引物2μl、无核酸酶水4μl，样本(标准品)4μl。反应条件(abi7500)：95℃保持5min；然后35个循环，每个循环95℃保持30sec，60℃保持45s；熔解曲线95℃保持15s，60℃保持60s，95℃15s。(6)上机测序：根据定量浓度，确定上机最终浓度，于miseq测序仪上上机，按照仪器操作规程进行测序，使用miseqreagentmicrokit(300cycles)。然后将数据上传服务器，由遗传咨询师对得到的数据进行分析及解读。数据见下表9。表94个样本的测序结果与已知结果100％一致实施例2采用16个口腔拭子样本进行文库构建，采用包含ankrd1、bag3、ldb3、lmna、mybpc3、myh6、myh7、rbm20、scn5a、tcap、tnnc1、tnni3、tnnt2、tpm1、ttn、vcl基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)作为目标区域的引物池进行多重反应pcr，并结合高通量测序平台nextseq550ar进行dna测序，然后检测点突变(snp)、小片段插入缺失(indel)。具体操作流程如下：(1)核酸提取及质检：外周血样本经过核酸提取、质检后，要求其符合一定质控标准：dna完整性较好，无蛋白rna污染，dna浓度≥20ng/μl；dna纯度：od260/2801.8-2.0，od260/230>2.0；dna总起始量:0.1μg-1μg。(2)文库制备：利用上述dna，取样后用tris-edta补至52.5μl，于covaris仪器上根据相应参数，进行超声打断，将基因组dna随机打断至180-220bp短片段。然后进行末端补平加a,反应体系为：tris-edta稀释的dna50μl，末端补平加a反应缓冲液7μl，末端补平加a酶混合液3μl，合计60μl，反应条件为：20℃保持30min，65℃保持30min，最后保持4℃；再进行接头连接，反应体系为末端补平的dna60μl，连接反应缓冲液及连接酶30μl，测序接头2.5μl，高浓度mg2+缓冲液1μl，合计93.5μl，反应条件：20℃保持15min，并保持20℃；反应结束后，加入3μluser消化酶，37℃保持15min；反应结束后，加入ampurexp纯化磁珠进行片段选择，先加入45μl磁珠吸附后留取上清(磁珠吸附大片段丢弃)，再加入15μl磁珠正常纯化洗脱。最后以纯化的dna为模板进行pcr扩增，反应体系为：dna模板20μl，2xpcr扩增反应酶及缓冲液25μl，通用引物2.5μl，含样本标签引物2.5μl，合计50μl。反应条件为：98℃保持30s；然后进行4个循环，每个循环为98℃保持10s，65℃保持75s；然后65℃保持5min；最后保持在10℃。结束后加入90μl磁珠进行纯化。(3)杂交捕获：进行文库混样，将带有不同样本标签的文库，等量进行混合(不超过6个样本)，总量需要达到1.25ug。混匀后取样1ug，加入样本标签对应的封闭引物试剂2μl，封闭dna5ug，真空浓缩仪60℃浓缩烘干至干粉。再加入2x杂交缓冲液7.5μl，杂交试剂a3μl，混匀95℃孵育10min，然后加入定制探针4.5μl，混匀后热盖57℃，反应47℃孵育16h-20h。反应结束后，加入100μl预先处理的特定磁珠，富集捕获到的目的区域dna片段。(4)lmpcr扩增：将步骤(3)获得的杂交捕获富集的dna作为模板，配制反应体系：模板20μl，2xpcr反应酶及缓冲液25μl，p5p7引物5μl。反应条件：98℃保持45s；然后进行14个循环，每个循环为98℃保持15s，60℃保持30s，72℃保持30s；然后72℃保持1min；最后保持在4℃。反应结束后加入90μl磁珠纯化得到最终上机测序文库。(5)将步骤(4)中获得的最终文库按照以下方法进行质控：取样1μl，使用qubithsdsdna试剂盒定量，得到文库浓度。根据定量浓度进行合理稀释，在agilent2100或者4200仪器，选择合适的试剂进行检测，核查文库片段分布范围。上机前，使用荧光定量pcr方法进行有效模板定量，梯度稀释标准品分别是20pm，2pm,0.2pm,0.002pm,0.0002pm，0.00002pm。将样本文库稀释至2-10pm，按照下述配制试剂：2×sybrgreenmastermix25μl、p5p7引物2μl、无核酸酶水4μl，样本(标准品)4μl。反应条件(abi7500)：95℃保持5min；然后35个循环，每个循环95℃保持30sec，60℃保持45s；熔解曲线95℃保持15s，60℃保持60s，95℃15s。(6)上机测序：根据定量浓度，确定上机最终浓度，于nextseq550ar测序仪上上机，按照仪器操作规程进行测序，使用nextseq500/550midoutputkitv2(300cycles)。然后将数据上传服务器，由遗传咨询师对得到的数据进行分析及解读。数据见下表10。表1016个样本的测序结果与已知结果100％一致样本编号基因核酸改变氨基酸改变sanger验证结果hj36ldb3c.793c>tp.arg265cys一致hj37bag3c.181g>ap.glu61lys一致hj39tnnt2c.259c>tp.arg87trp一致plnc.2t>cp.met1thr一致hj41lmnac.232c>tp.arg78trp一致hj43tnnt2c.415c>tp.arg139trp一致ttnc.67910t>cp.met22637thr一致ttnc.31675c>tp.arg10559term一致myh6c.2353c>tp.arg785cys一致hj45myh6c.5071c>tp.arg1691cys一致hcms50lmnac.794g>tp.arg265leu一致hcms15mybpc3c.2702t>cp.leu901pro一致hj24myh7c.2051t>gp.met684arg一致myh7c.77c>tp.ala26val一致hts508lmnac.c232tp.r78w一致rbm20c.g305ap.r102q一致hj10-1lmnac.936+1g>t—一致hj12-1myh7c.2981ap.lys994arg一致hj8ttnc.31558c>tp.gln10520term一致hj11-1tnnc1c.a430gp.n144d一致ttnc.g67553ap.r22518h一致myh6c.c1210tp.r404w一致ebstein5159ttnc.t50407cp.y16803h一致vclc.c1225tp.r409x一致ldb3c.g415ap.e139k一致hj52*ankrd1c.527g>ap.gly176glu一致前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。序列表<110>北京安智因生物技术有限公司<120>一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法及其试剂盒<160>281<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>62<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>1ttctttccttctgacctaggactgggagctgcatgtgaaagggaagctgcacgctcagaa60at62<210>2<211>66<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>2aaatcttggaacatcatacgtgcccattccagcaaggtcattcactcagtcaagccccac60atttcc66<210>3<211>88<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>3acagaagctgcacaggccatggtccagtattatcaagaaaaatctgctgtgatcaatggt60gagaagttgctcattcggatgtccaaga88<210>4<211>58<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>4tgtgaagattctaaatcctgctccttggctccctcacagatatggcccagaaaggccg58<210>5<211>64<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>5atcagtgggcagacaggagaaagaagcagagttctctgatccggaaaacacaaggacaaa60gaag64<210>6<211>65<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>6aaatctctggaggtgaggtcaccagagtacactgaagtggaactgaaacagcccctttct60ttgcc65<210>7<211>61<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>7ccacgcttcgaaaggaaaaagctctgatgcttctgcttctgctgctactgctgctgctgc60a61<210>8<211>73<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>8ttcacttcccagtttctaaccagcctgtgtttctccactttttatttcaggagactccat60cctctgccaatgg73<210>9<211>56<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>9acctgatgatcgaagagtatttgaccaaagagctgctggccctggattcagtggac56<210>10<211>72<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>10ttctgtgtggttctgccggtgtgttaacctgtgttcttccctatagggttgagaatgctt60gcaccaagcttg72<210>11<211>77<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>11aactcgatgaacaccgtgaaagagttgctgccagttctcatttcaggtacttcctgcctg60tactttattttataggg77<210>12<211>85<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>12tgcaaagaaaataatggtgggatttcttcccaaaaggacactgaagccatgaagagagca60ttggcctccatagactccaaactga85<210>13<211>92<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>13ccaactcaaagcagagcattgcaaagaagatcgatgctgctcaggtagtcacagtgattt60tcaggaggggtgggaaatatttcataaatatc92<210>14<211>77<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>14aatgtaaatagtgtttatgtgtgacaggatggctgtctttttctctgtagggggaaagga60gattctccagaggctcg77<210>15<211>65<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>15aattgtctcctctgggtcttgtaagtttcattgtttttctcttggtccaggtcaggctgc60catcc65<210>16<211>71<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>16tgaagacggcccgagaactcacaccccaggttgggttttgctcattcctcatacagtgtt60cagtaaagaaa71<210>17<211>60<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>17ccgaggatcccaagttccgtgaggctgtgaaagctgcctctgatgaattgagcaaaacca60<210>18<211>73<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>18atgatggctgccagacagctccatgatgaagctcgcaaatggtccagcaaggtaagtagt60gaagcttttcttg73<210>19<211>62<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>19actgtatctttgcttccctctagggcaatgacatcattgcagcagccaagcgcatggctc60tg62<210>20<211>88<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>20aacataccaaattaaactttctctttaggtatgtgagcgaatcccaaccataagcaccca60gctcaaaatcctgtccacagtgaaggcc88<210>21<211>57<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>21agatcaagtctgccagctacaacttgagcctcaccctgcagaagtaggtgggagctc57<210>22<211>59<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>22tctttgcccttttcctccccaggtggtagtcaactctccagccaagttagtatcaaagg59<210>23<211>55<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>23tctaccaggctgtgattaagagccagaacaagccagaagatgaggctgacgagtg55<210>24<211>55<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>24atgttaaaagctaaaaggctgcctggaatccccccaccccaacaggctggactcc55<210>25<211>64<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>25ctgtgcctactgcaagacttccctggcagatgtgtgctttgtggaagagcagaacaacgt60ttac64<210>26<211>55<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>26tttatcgaagccctgggccacacttggcacgacacctgcttcatttgcgcagtat55<210>27<211>57<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>27ctactccaagaaggacagacccctgtgcaagaagcacgcacacaccatcaacttgta57<210>28<211>58<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<400>28aatcaggagtcggatcatcttatagcggttcagtctcaccgcatcatgcaacggggta58<210>29<211>73<212>dna<213>人工序列(artifialsequence)<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