一种与保山猪产仔数性状相关的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于猪的分子标记与应用技术领域，具体涉及一种与保山猪产仔数性状相关的分子标记及其应用。

背景技术：

保山猪，曾用名保山大耳猪，1986年被列为国家畜禽遗传资源名录，产于保山市的隆阳区、施甸、昌宁、腾冲、龙陵县，少量分布于德宏州的部分县市。保山猪适应性、抗病力强，耐粗饲，性成熟早，配种受胎率高，母猪利用年限长，与外来品种杂交优势明显，肉质细嫩、香甜，风味好。

猪的产仔数性状是由多个基因控制的，而esr基因早在1991年就被发现其多态性与产仔数有关(rothschildetal.pvuiipolymorphismsattheporcineoestrogenreceptorlocus(esr).animalgenetics,1991,22:448-448)。esr基因位于猪的1号染色体上，全长6kb，包括8个外显子和8个内含子。rothschild等以人的esr基因约1.3kb的cdna为探针，分析猪的esr基因pvuii多态性，发现了1条4.3kb(命名为a)和一条3.7kb(命名为b)的特异带。同时以带有50％梅山猪血缘两个合成系中161头母猪为实验材料，探究了esr基因的多态性，发现b等位基因在梅山猪合成系中可以使第一胎产仔数增加20％，bb型母猪初产总产仔数和产活仔数均比aa型多1.2头，b等位基因为优势等位基因(rothschildetal.theestrogenreceptorlocusisassociatedwithamajorgeneinfluencinglittersizeinpigs.proceedingsofthenationalacademyofsciences,1996,93:201-205)。wangetal.(2006)和humpoliecketal.(2006)分别利用pcr-rflp方法发现esr基因与经产母猪的总产仔数和产活仔数有显著关联(wangetal.effectsofesr1,fshbandrbp4genesonlittersizeinalargewhiteandalandraceherd.archivfurtierzucht,2006,49:64-70；humpoliecketal.influenceofesr1andfshbgenesonlittersizeinczechlargewhitesows.archivfurtierzucht,2006,49:152-157)。而且有研究发现该基因还可以影响公猪的精液品质(gunawanetal.associationstudyandexpressionanalysisofporcineesr1asacandidategeneforboarfertilityandspermquality.animalreproductionscience,2011,128:11-21)。

因此，研究esr基因上的变异位点在群体中的多态性，并与母猪产仔数性状进行关联分析，可以为通过标记辅助选择提高母猪产仔数提供有用的分子标记。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，根据esr基因已知序列，寻找esr基因上的单核苷酸多态性（snps），发明人通过关联分析，意外地发出一种esr基因上的snp与保山猪产仔数性状显著相关，可以作为保山猪选育的分子标记。

为此，本发明的一方面提供一种与母猪产仔数性状相关的分子标记，其由a、b两个等位基因组成，其中，等位基因a的碱基序列如seqidno：3所示，等位基因b的碱基序列如seqidno：4所示。

在本发明的实施方案中，分子标记的ab基因型个体的产仔数显著高于aa基因型或bb基因型个体。

本发明的第二方面提供一种用于本发明第一方面所述的分子标记的引物对，该引物对具有seqidno：1-2所示的核苷酸序列。

本发明的第三方面提供一种用于本发明第一方面所述的分子标记的试剂盒，包含本发明第二方面所述的引物对。

本发明的第四方面提供本发明第一方面所述的分子标记、第二方面所述的引物对或第三方面所述的试剂盒在母猪选育中的用途。

本发明的第五方面提供一种检测母猪产仔能力的方法，具体地，通过对待测母猪进行本发明第一方面所述的分子标记的检测，确定所述待测母猪产仔能力。

在本发明的实施方案中，通过对待测母猪进行本发明第一方面所述的分子标记的检测，确定所述待测母猪产仔能力，进一步包括：

1）提取待测母猪的基因组dna；

2）利用权利要求3所述的引物对，将所述待测母猪的基因组dna进行pcr扩增，以便获得pcr扩增产物；

3）分析获得的pcr扩增产物，确定所述待测母猪的所述分子标记的基因型；

4）基于所述待测母猪的所述分子标记的基因型，确定所述待测母猪的产仔能力。

在本发明的一个具体实施方案中，步骤3）中所述分析获得的pcr扩增产物是指对所述pcr扩增产物进行测序，以便获得测序结果，根据测序结果确定待测母猪的基因型。

在本发明的一个具体实施方案中，步骤3）中所述分析获得的pcr扩增产物是指利用pvuii对所述pcr扩增产物进行酶切，根据酶切结果确定待测母猪的基因型。

在本发明中，如果待测母猪的基因型为ab型，则产仔能力较高，否则，产仔能力相对较低。

本发明的有益效果

本发明为猪的分子辅助选择提供了新的标记。

本发明的分子标记可在母猪产仔数性状辅助选择中应用。

附图说明

图1示出了本发明中保山猪esr基因的三种基因型酶切后电泳图。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

实施例1esr基因snps的筛选

1.1利用苯酚抽提法提取总dna

取少量保山猪耳组织块，置于2ml离心管中，用手术剪剪碎，加入1ml组织裂解液，10μl蛋白酶k，反复颠倒数次，于56℃水浴中过夜消化，使混合液呈透明状；加入等体积饱和酚，缓慢颠倒离心管10min，4℃12000r/min离心10min，转移上清(1ml左右)至另一离心管；然后再重复一次；用等体积苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25:24:1)重复上述抽提步骤；用等体积氯仿/异戊醇(体积比为24:1)重复上述抽提步骤，将上清转移至2ml的ep管中；在上清中加1/10体积的3mnaac(≈100μl)及2.5体积的无水乙醇(≈2.5ml，-20℃预冷)，轻轻翻转至dna聚集成团，转移dna至新的离心管中；加入75％乙醇(-20℃预冷)，使dna沉淀悬浮于溶液10分钟，4℃12000r/min离心2min，离心后倒掉残留液体，再重复洗涤两次；4℃12000r/min离心2min，离心后倒掉后再短暂离心后吸出残留液体，将dna自然晾干后，加入100μlte溶解，检测和稀释分装完毕后于-20℃或-70℃长期保存，原液避免反复冻融(参见：sambrooketal.分子克隆实验指南，第三版.黄培堂等译；北京：科学出版社，2002：468-470)。

1.2引物设计

根据ensembl数据库中猪esr基因(登陆号：np_999385esr1)的序列信息，设计一对引物(引物组合)，用来克隆猪esr基因，该引物组合的序列如下所示：

正向引物esr_seq-f：5'-cacttcgagggtcagtc-3'(seqidno:1)，

反向引物esr_seq-r：5'-cctgtttttacagtgac-3'(seqidno:2)。

1.3pcr扩增

pcr反应总体积为20μl，体系具体如下：50ng的基因组dna2μl，2×powertaqpcrmastermix10μl，步骤1.2的正向引物0.4μl，反向引物4μl。pcr扩增程序如下：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min40s，34个循环；最后72℃继续延伸5min。

1.4pcr产物的纯化

pcr产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml离心管中，然后用pcr产物纯化试剂盒(购自北京百泰克生物技术有限公司，按该试剂盒的说明书操作)纯化pcr产物，所得纯化pcr产物于-20℃下保存备用。

1.5pcr产物的序列测定

序列测定由武汉擎科创新生物科技有限公司完成。pcr产物序列测序结果有两种，分别如seqidno:3所示或seqidno:4所示。

seqidno:3

5'-cacttcgagggtcagtccaattagaatagggtggaatggggacttgacaagaacagctggtctcataaaacttgattctgcatctttagatatactctgtaaaagtcactgtaaaaacagg-3'

seqidno:4

5'-cacttcgagggtcagtccaattagaatagggtggaatggggacttgacaagaaaagttggtctcataaaacttgattctgcatctttagatatactctgtaaaagtcactgtaaaaacagg-3'

由上可知，esr基因的核苷酸序列有两种类型，具体地，第54位碱基是a或者c，第57位碱基是t或c。当esr基因的核苷酸序列的第54位碱基是c，第57位碱基也是c的时候，54-57位碱基为cagctg，即为限制性内切酶pvuii的识别位点。

实施例2esr基因pcr-rflp检测方法的建立

2.1引物序列

利用seqidno:1和seqidno:2所示的引物进行扩增。

2.2pcr扩增条件

pcr反应总体积10μl，其中猪基因组dna约50ng，含2×taqpcrmix5ulμl(购自北京艾德莱生物科技有限公司)，用步骤2.1所述的正向引物0.2μl(浓度为10μm)，反向引物0.2μl，灭菌水：3.6μl。pcr扩增程序如下：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；最后72℃继续延伸10min。pcr反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，得到特异扩增片段。

2.3pcr-rflp检测条件

pcr产物酶切反应体积是10μl；其中10×cutsmartbuffer1μl，pcr产物5μl，限制性内切酶pvuii为0.1μl(1u)，用灭菌的双蒸水定容至10μl，将样品混匀后离心，37℃孵育12h，用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，在凝胶成像系统中拍照并记录基因型。基因型的带型分别为：aa(54bp+63bp)，ab(54bp+63bp+121bp)，bb(121bp)，分型结果如图1所示。

2.4本发明的分子标记在与母猪产仔数性状关联分析中的应用

试验共检测了180头保山猪母猪的esr基因多态性位点，其中180头具有表型记录。

表1esr基因的多态性位点在群体中基因型频率和等位基因频率分布

表2esr基因多态性位点与猪产仔数关联分析结果

注：同一列中上标字母不同表示差异显著(p<0.05)。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001

esr基因pvuⅱ酶切位点在保山猪群体中检测出aa、ab、bb三个基因型，其频率分别为：0.2056、0.4722、0.3222。等位基因a、b的频率分别为0.4417、0.5583，其中ab基因型为优势基因型，b等位基因为优势等位基因。保山猪esr基因多态信息含量为0.3720，属于中度多态，杂合度为0.4939，遗传变异程度较高，卡方值为0.1626，处于hardy-weinberg动态平衡状态。ab基因型为高产基因型，与aa基因型和bb基因型之间产仔数差异极显著（p＜0.01）。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>赵桂英

<120>一种与保山猪产仔数性状相关的分子标记及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cacttcgagggtcagtc17

<210>2

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cctgtttttacagtgac17

<210>3

<211>121

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cacttcgagggtcagtccaattagaatagggtggaatggggacttgacaagaacagctgg60

tctcataaaacttgattctgcatctttagatatactctgtaaaagtcactgtaaaaacag120

g121

<210>4

<211>121

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cacttcgagggtcagtccaattagaatagggtggaatggggacttgacaagaaaagttgg60

tctcataaaacttgattctgcatctttagatatactctgtaaaagtcactgtaaaaacag120

g121