一种抗体介导的痕量吡虫啉农药残留的PCR管式检测方法与流程

本发明涉及对粮食、蔬菜、水果、茶叶、土壤和果蔬饮料中的农药残留检测领域，特别是涉及一种利用分子生物学技术进行的灵敏的痕量吡虫啉农药残留的pcr管式检测方法。

背景技术：

随着化学农药的大规模使用，农产品中农药残留问题严重影响着人类的健康。吡虫啉是新一代烟碱类超高效杀虫剂，目前世界范围内的使用量已居所有杀虫剂的首位，可广泛用于水稻、棉花、蔬菜、水果、茶叶等多种作物的害虫防治。吡虫啉会对人类和哺乳动物产生慢性毒理效应，0.05mg/kg的吡虫啉就会损害人体淋巴细胞的遗传物质dna；日本肯定列表对吡虫啉最低限量为1mg/kg；我国ny/t419-2014(绿色食品稻米)规定大米中吡虫啉最大残留限量为0.05mg/kg。为使我国有机农产品、水果、茶叶等能顺利出口，探索农产品中吡虫啉残留的灵敏、快速、准确的检测方法显得尤为迫切。

目前，国内外对农药残留的检测方法主要有：gc-ms、hplc、超高效液相色谱-串联质谱法和酶联免疫检测法(elisa)等。但是，吡虫啉由于沸点较高不易气化，气相色谱法存在不足；采用液质联用法的质谱检测器设备昂贵，尤其是串联质谱在我国的普及率并不是很高，对人员操作要求高，耗时长，这些缺点严重制约了其大规模使用；基于抗原-抗体特异性反应研制出的烟碱类农药的酶联检测试剂盒(elisa)稳定性差，灵敏度较低。目前有限的吡虫啉残留检测方法普遍存在前处理过程繁琐，提取不完全，操作过程中容易出现误差，且使用高毒的有机溶剂的弊端，这些缺点严重制约了其使用。因此，需要有一种成本低于色谱法而检测灵敏度接近或高于色谱法的新型检测技术。

1992年，sano等人将免疫测定技术与pcr技术有机结合起来，创建了一种全新的抗原分子识别技术，即免疫pcr(immuno-pcr)。

技术实现要素：

为了克服上述缺陷，本发明提供一种有别于传统的吡虫啉农药残留检测的快速、灵敏、简便、有效的抗体介导的痕量吡虫啉农药残留的pcr管式检测方法，该方法可以显著降低农药残留检测的检出限，提高检测的灵敏度，大大缩短检测时间，在各种农产品、茶叶、食品和饮料的农药残留检测应用中具有良好的应用前景。

本发明基于免疫pcr的基本原理，将农药吡虫啉作为抗原，首次利用吡虫啉的单克隆抗体识别吡虫啉，通过吡虫啉农药单克隆抗体偶联亲和素，亲和素进一步与生物素标记dna的偶联，通过本实验室特定的已经克隆的已知基因序列标记生物素，利用荧光定量pcr的指数扩增和精确定量的特点，检测吡虫啉农药痕量残留，创新性地将分子生物学技术用于农药残留的检测。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：一种抗体介导的痕量吡虫啉农药残留的pcr管式检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)光敏pcr管壁处理

利用0.8％的戊二醛溶液在37℃条件下处理光敏pcr管3～5h；

(2)农药抗体与管壁结合

将1-10μg/ml吡虫啉农药抗体加入戊二醛处理后的光敏pcr管，4℃孵育过夜；

(3)封闭；

(4)吡虫啉农药包被

以不同浓度的吡虫啉农药包被pcr管，4℃过夜，洗涤pcr管，干燥待用；

(5)生物素标记dna；

(6)吡虫啉农药单克隆抗体+亲和素+生物素标记dna的偶联；

(7)定量pcr检测；

(8)数据处理与分析。

优选的，步骤(3)具体为：用含5％脱脂奶粉的pbs，37℃封闭6h；用pbst洗涤3次，每次5min；37℃烘干；所述的pbst为含0.05％tween-20pbs。

优选的，步骤(4)具体为：以不同浓度的吡虫啉农药包被pcr管，4℃过夜，ph7.2pbst缓冲液震荡洗涤pcr管3次，每次5min；用pbst吹打洗涤1次后，置于37℃下干燥待用。

优选的，步骤(5)具体：采用pcr扩增方法获得生物素标记某基因dna的pcr产物。

优选的，步骤(7)具体为：针对所述dna分子标记基因进行定量pcr检测，在已经过吡虫啉农药着膜处理的光敏pcr管中加入qrt-pcr试剂，进行qrt-pcr。

优选的，所述的光敏pcr管由聚氯乙烯材料制成。

优选的，步骤(8)具体为：qrt-pcr数据处理与分析，吡虫啉农药标准曲线的绘制，含量测定；

响应值y＝2^-△△ct；扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数cyclethreshold；c代表cycle，t代表threshold。

相对于现有技术,本方法检出限目前可以达到0.08mg/kg，是市场在售试剂盒检测方法中检出限最低的方法之一。按本方法检测每个样品耗时约1.5h，成本费用约10元，与同类型产品比较在成本上具有较大优势。具有快速、准确、高效等特点，拥有较大的市场开发潜力。采用本方法原理不仅可以解决农药吡虫啉的快速检测问题，还可以推广应用到其他多种农药的快速检测技术研发上，具有极为广泛的应用前景。

附图说明

图1本发明原理示意图；

图2吡虫啉农药浓度和响应值的关系图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1：以农林生产上常用“吡虫啉”农药为检测对象，以张一强、冯从经等人克隆的亚洲玉米螟丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,mapk)基因(genbank序列号:mf797866)dna为标记分子，进行吡虫啉检测限分析为例。

光敏pcr管壁处理

(1)光敏pcr管为聚氯乙烯材料，表面光滑，需增粘附力。可利用50μl0.8％的戊二醛溶液37℃包被5h(原液浓度25％戊二醛、现用现配、避光保存)。

(2)农药抗体与管壁黏连30μl稀释40倍的吡虫啉单克隆抗体(抗体母液浓度为1.2μg/ml)加至pcr管底部，包被pcr管，在4℃下包被过夜，回收抗体。将抗体吸出后，用50μlph7.2封闭液(含5％脱脂奶粉的pbs，现配现用)37℃封闭6h。

(3)用60μlpbst(含0.05％tween-20pbs)洗涤pcr管3次，每次5min。用37℃烘箱烘干2h(不要任何覆盖)。

(4)30μl的不同ppm浓度(2个对照空管子)的吡虫啉农药抗原包被pcr管(各4个重复，空白对照无农药处理，其他下面步骤正常，4℃过夜)。

(5)60μlph7.2pbst缓冲液用涡旋振荡器震荡洗涤pcr管3次，每次5min，移液器洗涤1次后，置于37℃下干燥待用。

生物素标记dna(biotin-引物和biotin-dntp掺入法)

采用掺入biotin合成的mapk上下游引物，以抽提的mapk质粒为模板，加入掺入biotin-ntp的底物，进行普通pcr扩增，在30μl体系进行pcr扩增。反应体系的组成如表1，引物(seqidno.1-2)如表2所示：

表1pcr反应体系

pcr条件如下：94℃3min；94℃30s，55℃45s，72℃30s，35个循环；72℃后延伸10min。

表2mapk基因的dna分子进行生物素标记所用引物

pcr产物大小约1044bp的片段；割胶回收biotin-pcr产物，测序得到biotin标记的mapk-dna。

吡虫啉农药单克隆抗体+亲和素+生物素标记dna的偶联(isbl)(lightning–linkstreptavidinconjugationkit法)

(1)在每10μl的吡虫啉单克隆抗体中加入1μl的ll-modifierreagent，轻轻混匀，进行标记反应，室温(20-25℃)树立放置30min。

(2)旋开lightning-linkmix瓶的瓶盖，用移液器吸取将已经加过ll-modifierreagent的11μl单抗体样品直接加入到瓶内冻干的物质中，再加入5μl割胶纯化后的生物素标记dna；用移液器将瓶内液体上下来回轻轻吹吸5次以混匀液体。

(3)将瓶盖旋回瓶上，将瓶子在室温(20-25℃)树立放置过夜进行偶联反应。室温过夜使得抗体偶联农药后，再加1μl的淬灭剂，结束反应。

(4)将上述过夜后偶联产物(isbl)16μl,稀释120倍，分装isbl到农药包被后的干燥后的光敏pcr，每管20μl，4℃过夜。

(5)吸取isbl回收备用；吸取上述60μlpbst缓冲液，采用涡旋振荡器震荡洗涤pcr管3次，每次5min，，置于37℃烘箱干燥2h待用。

定量pcr检测(设立对照组-仅进行空管管壁处理的对照组)

采用mapk基因检测的荧光定量pcr的上、下游引物，在已经农药着膜处理过的光敏pcr管中加入qrt-pcr试剂，进行qrt-pcr分析。对照空管子用于无吡虫啉农药的qrt-pcr实验。

qrt-pcr引物(seqidno.3-4)见表3：

表3mapkqrt-pcr所用引物

在含有mapkcdna的qrt-pcr管中采用sybrgreeni嵌合荧光法进行real-timepcr扩增反应。qrt-pcr实验的进行按照美国伯乐公司的ssofast^tm超混合液说明进行，反应的总体积为20μl。

反应体系的组成如表4：

表4real-timepcr反应体系

mapk基因qrt-pcr反应条件为95℃，3min；95℃,30s；62.6℃,10s；60-95℃,每秒升高0.5℃，meltingcurve；10℃forever。mapk退火温度62.6℃，以空白处理的qrt-pcr值进行校准，qrt-pcr产物长度247bp，2.5％琼脂糖凝胶电泳检测，拍照。上述样品的前处理方法可以参见方法附图1。

数据处理和分析

不同农药(吡虫啉)含量处理组qrt-pcr结果见表5和图2：

表5不同农药浓度的响应值

本发明方法由待检测吡虫啉农药特异单克隆抗体制备、抗体与连接分子的连接、dna报告分子的标记和荧光定量pcr扩增体系准备等几部分组成。本发明建立了一种适用于农产品、蔬菜、茶叶、浓缩果汁样品中吡虫啉农药残留的超灵敏新型分子生物学检测法。与上述提及的农药残留检测方法相比，本发明采用全新的分子生物学技术检测吡虫啉农药残留，测定样品前处理过程简单，灵敏度高，稳定性好，对人员操作要求不高，耗时短，不使用有毒有机溶剂，所用仪器设备为常规实验室配备的荧光定量pcr仪。较之传统的高效液相色谱法，本发明方法具有检测成本低、操作简单、实用性强，更加快速、准确等优点，能够将在高效液相色谱法上使得检出限和灵敏度提高一个等级，可用于痕量吡虫啉的农药残留的检测。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110>扬州大学

<120>一种抗体介导的痕量吡虫啉农药残留的pcr管式检测方法

<130>xhx2018121701

<141>2018-12-17

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggagtgaacgctctgtggtgaagt24

<210>2

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ctgcaagaatatcatattaaactgacaag29

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gcgcatcactgtggaggag19

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gcgtctcctcgaagatgtac20