一种酶催化氧化型烟酰胺辅酶的再生方法及应用与流程

本发明属于生物催化及生物制造领域，具体涉及一种酶催化氧化型烟酰胺辅酶nad(p)+及其人工类似物bna+再生的方法及其在脱氢酶催化氧化反应中的应用。
背景技术：
：氧化还原酶是一类重要的生物催化剂，可以催化具有特定区域选择性、化学选择性、立体选择性的反应，反应条件温和且催化效率高，因此在有机合成和制药领域发挥着重要的作用。氧化还原酶用于生物催化和转化通常需要辅酶参与，其中大多数脱氢酶需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad(p)h)作为辅酶。但是烟酰胺辅酶价格昂贵，故利用化学计量的辅酶进行反应，其经济性差，难以实现。因此，辅酶再生是烟酰胺依赖型脱氢酶在合成化学中应用的关键技术。烟酰胺辅酶(nad(p)h/nad(p)+)再生的方法有：酶法、化学法、电化学法和光化学法。化学法虽然成本较低、适应性强，但是常用有机贵金属配合物作为催化剂，不仅价格昂贵而且中心金属会脱落，中心金属常会与酶的氨基酸残基进行配位，使金属催化剂与酶均易失去活性(angew.chem.int.ed.,2011，50，2397)。电化学法常常需要介质的参与，且此法与很多生物催化系统不相容，选择性很差且效率较低。光化学法虽然利用洁净的光能，但常受限于缺乏高效的光敏剂；在可见光范围内，催化效率低。相较于传统的化学催化，辅酶的酶法再生具有反应条件温和、催化效率高、环境友好等优点。目前，用于再生氧化型辅酶nad(p)+的酶法常用nad(p)h氧化酶(bioresour.technol.,2015,191,512；adv.syn.catal.,2016,358,1810；acscatal.,2018,8,8680)。nad(p)h氧化酶在氧化nad(p)h反应中，o2作为电子受体被还原成h2o2(接受两个电子)或h2o(接受四个电子)，而不需要其他辅助底物，简化了后续分离步骤，是极具潜力的氧化型辅酶再生体系之一。除上述nad(p)h氧化酶外，研究者也在开发新的酶或蛋白用于nad(p)+的再生。allemann等报道了一种蛋白用于nadp+再生，即来源于大肠杆菌的谷氧还蛋白和来源于酿酒酵母的谷胱甘肽还原酶耦合，以廉价的二硫化物作为氧化剂实现nadp+的高效转化，辅酶转换系数高达5×105，是迄今报道的最高的辅酶转换系数，但是得到此辅酶转换系数所用的氧化反应体系底物浓度很低(5mm)，并不适合工业化应用(acscatal.,2017,7,1025)，并且该方法的普适性差，仅能用于nadp+再生，不能用于再生nad+。近年来，依赖nad(p)+的氧化还原酶催化氧化反应具有反应条件温和、选择性高、环境友好等特点，在学术界和工业界都受到了广泛的关注。开发高效的酶法辅酶再生不仅能够解决依赖nad(p)+的氧化还原酶催化生物合成的瓶颈问题，而且对其工业化应用具有重要意义。技术实现要素：针对上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种酶催化氧化型烟酰胺辅酶nad(p)+及其人工类似物bna+的方法，即利用肌红蛋白或细胞色素c催化氧化型辅酶nad(p)+及bna+再生。该方法弥补现有技术缺陷，具有反应条件温和、选择性高、工艺简单、环境友好、能在工业反应条件下高效催化辅酶再生等优点。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种酶催化氧化型烟酰胺辅酶的再生方法，具体步骤如下：将还原型烟酰胺辅酶加入ph为6.0～9.0的缓冲液中，混合均匀，再加入0.1～2.0mg/ml血红素蛋白、0～0.4mm介体及0.1～15mm过氧化氢，于25～40℃下反应，得到相应的氧化型辅酶。优选地，所述还原型烟酰胺辅酶为nadh、nadph或bnah；其浓度为0.001～1mm；所述缓冲液的ph为7.0～8.0，且含有0～2％二甲基亚砜。优选地，所述血红素蛋白为肌红蛋白或细胞色素c，其浓度为1.0～1.5mg/ml。优选地，所述介体为莨菪亭、愈创木酚或对乙酰氨基酚；其浓度为0.01～0.2mm；所述过氧化氢浓度为5～10mm。优选地，所述反应温度为30～35℃，缓冲液为磷酸盐或甘氨酸-naoh缓冲液。一种酶催化氧化型烟酰胺辅酶再生方法在脱氢酶催化氧化反应中的应用，包括如下步骤：将0.1～2.0mg/ml血红素蛋白、0～0.4mm介体、0.001～1.0mm烟酰胺辅酶、过氧化氢、脱氢酶及其底物加入ph为6.0～9.0的缓冲液中，于25～40℃搅拌条件下，反应24～60h，得到目标产物。优选地，所述脱氢酶为葡萄糖脱氢酶、l-谷氨酸脱氢酶、l-乳酸脱氢酶或马肝醇脱氢酶；其浓度为2.5～200u/ml；所述的底物为相应脱氢酶对应的底物葡萄糖、l-谷氨酸钠、l-乳酸钠或糠醇，其浓度为10～500mm。优选地，所述烟酰胺辅酶为浓度为0.01～0.1mm；所述血红素蛋白为肌红蛋白或细胞色素c，其浓度为1.0～1.5mg/ml；所述缓冲液ph介于7.0～8.0，且含有0～2％二甲基亚砜。优选地，所述过氧化氢与底物摩尔比介于10:1～1:4；过氧化氢的添加方式为多次分批添加。优选地，所述反应温度为30～35℃；缓冲液为磷酸盐或甘氨酸-naoh缓冲液。优选地，在产生酸产物的反应体系中加入碳酸钙。本发明与现有技术相比，具有如下的优点：1)肌红蛋白或细胞色素c催化氧化型烟酰胺辅酶再生的效率高，普适性及兼容性好，可以与多种烟酰胺辅酶依赖型脱氢酶偶联，用于催化氧化反应，合成各种高附加值产品。2)本发明所述的催化氧化体系，能够高效、高选择性催化高浓度底物氧化合成目标产物，目标产物产率高，辅酶转换系数高，极大地降低了工艺成本，具有广阔的工业应用前景。3)本发明具有反应过程简单、易控、反应条件温和、节能环保等优点。附图说明图1为氧化型烟酰胺辅酶nad(p)+及其结构类似物bna+的化学结构。图2为检测葡萄糖酸含量的液相色谱图(葡萄糖酸保留时间为3.5min)。图3为检测α-酮戊二酸含量的液相色谱图(l-谷氨酸钠及α-酮戊二酸保留时间分别为4.4及5.3min)。图4为检测丙酮酸含量的液相色谱图(丙酮酸及l-乳酸钠保留时间分别为5.2及6.1min)。图5为检测2-糠酸含量的液相色谱图(2-糠酸及糠醇保留时间分别为7.9及13.8min)。具体实施方式通过实施例进一步说明本发明，但不局限于实施例。实施例1nad+再生：在含有1mmnadh和10mmh2o2的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入肌红蛋白(最终浓度为1mg/ml，来源于马心脏，购于美国sigma-aldrich公司)启动反应，于30℃下每隔1min测定340nm处反应体系吸光值变化。反应20min后，nadh的转化率为75％。实施例2nad+再生：在含有0.2mmnadh和10mmh2o2的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)加入肌红蛋白(最终浓度为1.5mg/ml)启动反应，于25-40℃下反应3min后，测定340nm处反应体系吸光值的变化，计算不同温度下肌红蛋白催化nadh氧化的活性，结果如表1。表1不同温度下肌红蛋白催化nadh氧化相对活性温度(℃)相对活性(％)25653010035754060实施例3nad+再生：在含有0.2mmnadh和10mmh2o2的50mm、ph6.0～10.0缓冲液中加入肌红蛋白(最终浓度为1.5mg/ml)启动反应，于30℃下反应3min后，测340nm处反应体系吸光值变化，计算不同ph下肌红蛋白催化nadh氧化的活性，结果如表2。表2不同ph下肌红蛋白催化nadh氧化相对活性ph相对活性(％)6.0(磷酸盐缓冲液)757.0(磷酸盐缓冲液)818.0(磷酸盐缓冲液)1009.0(甘氨酸-naoh缓冲液)3110.0(甘氨酸-naoh缓冲液)15实施例4nadp+再生：在含有1mmnadph和10mmh2o2的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入肌红蛋白(最终浓度为1.0mg/ml)启动反应，于30℃下每隔1min测定340nm处反应体系吸光值变化。反应20min后，nadph的转化率为77％。实施例5bna+再生：在含有0.5mmbnah、10mmh2o2和2％(v/v)二甲基亚砜的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入肌红蛋白(最终浓度为1.0mg/ml)启动反应，于30℃下每隔1min测定361nm处反应体系吸光值变化。反应16min后，bnah的转化率为98％。实施例6nad+再生：在含有1mmnadh和10mmh2o2的磷酸盐缓冲液(50mm，ph7.0)中加入细胞色素c(最终浓度为1.0mg/ml，来源于动物心脏，购于上海生工生物工程有限公司)启动反应，于30℃下每隔1min测定340nm处反应体系吸光值变化。反应20min后，nadh转化率为52％。实施例7nadp+再生：在含有1mmnadph和10mmh2o2的磷酸盐缓冲液(50mm，ph7.0)中加入细胞色素c(最终浓度为1.0mg/ml)启动反应，于30℃下每隔1min测定340nm处反应体系吸光值变化。反应20min后，nadph转化率为42％。实施例8nad+再生：在含有1mmnadh和10mmh2o2的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入肌红蛋白(最终浓度为0.1mg/ml)启动反应，于30℃下每隔1min测定340nm处反应体系吸光值变化。反应20min后，nadh转化率为51％。实施例9nad+再生：在含有0.001mmnadh和0.01mmh2o2的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入肌红蛋白(最终浓度为0.1mg/ml)启动反应，于30℃下每隔1min测定340nm处反应体系吸光值变化。反应5min后，nadh转化率为96％。实施例10nad+再生：在含有1mmnadh、10mmh2o2和0.01mm莨菪亭的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入肌红蛋白(最终浓度为1.0mg/ml)启动反应，于30℃下每隔1min测定340nm处反应体系吸光值变化。反应12min后，nadh转化率为77％。实施例11nad+再生：在含有1mmnadh、10mmh2o2和0.1mm莨菪亭的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入肌红蛋白(最终浓度为1.0mg/ml)启动反应，于30℃下每隔1min测定340nm处反应体系吸光值变化。反应12min后，nadh转化率为87％。实施例12nad+再生：在含有1mmnadh、10mmh2o2和0.4mm莨菪亭的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入肌红蛋白(最终浓度为1.0mg/ml)启动反应，于30℃下每隔1min测定340nm处反应体系吸光值变化。反应12min后，nadh转化率为38％。实施例13nad+再生：在含有1mmnadh、10mmh2o2和0.2mm对乙酰氨基酚的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入肌红蛋白(最终浓度为1.0mg/ml)启动反应，于30℃下每隔1min测定340nm处反应体系吸光值变化。反应12min后，nadh转化率为85％。实施例14nad+再生：在含有1mmnadh、10mmh2o2和0.2mm愈创木酚的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入肌红蛋白(最终浓度为1.0mg/ml)启动反应，于30℃下每隔1min测定340nm处反应体系吸光值变化。反应12min后，nadh转化率为75％。实施例15nadp+再生：在含有1mmnadph、10mmh2o2和0.1mm莨菪亭的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入肌红蛋白(最终浓度为1.0mg/ml)启动反应，于30℃下每隔1min测定340nm处反应体系吸光值变化。反应12min后，nadph转化率为84％。实施例16bna+再生：在含有0.5mmbnah、10mmh2o2、0.1mm莨菪亭和2％(v/v)二甲基亚砜的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入肌红蛋白(最终浓度为1.0mg/ml)启动反应，于30℃下每隔1min测定361nm处反应体系吸光值变化。反应10min后，bnah的转化率为100％。实施例17葡萄糖酸的合成：在4ml含有100mm葡萄糖、0.1mmnad+、50mmh2o2、0.1mm莨菪亭和1mg/ml肌红蛋白的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入葡萄糖脱氢酶(最终浓度为20u/ml)启动反应，于30℃、150r/min下反应。液相色谱图监控反应过程(图2)，反应12h后再补加0.2mmolh2o2，反应36h后，葡萄糖酸产率为93％，辅酶转化系数为930。实施例18葡萄糖酸的合成：在4ml含有100mm葡萄糖、0.1mmnad+、50mmh2o2、0.1mm莨菪亭和1mg/ml肌红蛋白的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入葡萄糖脱氢酶(最终浓度为80u/ml)启动反应，于30℃、150r/min下反应。反应12h后补加0.2mmolh2o2，反应24h后，葡萄糖酸产率为92％，辅酶转化系数为920。实施例19葡萄糖酸的合成：在4ml含有100mm葡萄糖、0.01mmnad+、50mmh2o2、0.1mm莨菪亭和1mg/ml肌红蛋白的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入葡萄糖脱氢酶(最终浓度为60u/ml)启动反应，于30℃、150r/min下反应。反应12h后补加0.2mmolh2o2，反应36h后，葡萄糖酸产率为93％，辅酶转化系数为9300。实施例20葡萄糖酸的合成：在4ml含有100mm葡萄糖、0.001mmnad+、50mmh2o2、0.1mm莨菪亭和1mg/ml肌红蛋白的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入葡萄糖脱氢酶(最终浓度为60u/ml)启动反应，于30℃、150r/min下反应。反应12h后补加0.2mmolh2o2，反应48h后，葡萄糖酸产率为44％，辅酶转化系数为44000。实施例21葡萄糖酸的合成：在4ml含有100mm葡萄糖、0.01mmnad+、25mmh2o2、0.1mm莨菪亭和1mg/ml肌红蛋白的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入葡萄糖脱氢酶(最终浓度为60u/ml)启动反应，于30℃、150r/min下反应。反应48h后，葡萄糖酸产率为96％，辅酶转化系数为9600。实施例22葡萄糖酸的合成：在4ml含有250mm葡萄糖、0.01mmnad+、50mmh2o2、0.1mm莨菪亭和1mg/ml肌红蛋白的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入葡萄糖脱氢酶(最终浓度为60u/ml)启动反应，于30℃、150r/min下反应。每隔12h补加0.2mmolh2o2，反应48h后，葡萄糖酸产率为72％，辅酶转化系数为7200。实施例23葡萄糖酸的合成：在4ml含有250mm葡萄糖、0.01mmnad+、50mmh2o2、0.1mm莨菪亭、1mg/ml肌红蛋白和1.5mmol碳酸钙的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入葡萄糖脱氢酶(最终浓度为60u/ml)启动反应，于30℃、150r/min下反应。每隔12h补加0.2mmolh2o2，反应36h后，葡萄糖酸产率为98％，辅酶转化系数为24500。实施例24葡萄糖酸的合成：在4ml含有500mm葡萄糖、0.01mmnad+、80mmh2o2、0.1mm莨菪亭、1mg/ml肌红蛋白和3mmol碳酸钙的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入葡萄糖脱氢酶(最终浓度为100u/ml)启动反应，于30℃、150r/min下反应。每隔12h补加0.32mmolh2o2，反应60h后，葡萄糖酸产率为97％，辅酶转化系数约为48500。实施例25葡萄糖酸的合成：在4ml含有500mm葡萄糖、0.01mmnad+、62.5mmh2o2、0.1mm莨菪亭、1mg/ml肌红蛋白和3mmol碳酸钙的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入葡萄糖脱氢酶(最终浓度为200u/ml)启动反应，于30℃、150r/min下反应。反应12h后补加0.25mmolh2o2，反应48h后，葡萄糖酸产率为97％，辅酶转化系数约为48500。实施例26α-酮戊二酸的合成：在2ml含有50mml-谷氨酸钠、0.01mmnad+、50mmh2o2、0.1mm莨菪亭和1mg/ml肌红蛋白的磷酸盐缓冲液(50mm，ph7.0)中加入l-谷氨酸脱氢酶(最终浓度为80u/ml)启动反应，于30℃、150r/min下反应。液相色谱图监控反应过程(图3)，反应24h后补加0.1mmolh2o2，反应36h后，α-酮戊二酸产率为97％，辅酶转化系数约为4850。实施例27丙酮酸的合成：在2ml含有50mml-乳酸钠、0.01mmnad+、50mmh2o2、0.1mm莨菪亭和1mg/ml肌红蛋白的磷酸盐缓冲液(50mm，ph7.0)中加入l-乳酸脱氢酶(最终浓度为80u/ml)启动反应，于30℃、150r/min下反应。液相色谱图监控反应过程(图4)，反应24h后补加0.1mmolh2o2，反应48h后，丙酮酸产率为95％，辅酶转化系数约为4750。实施例282-糠酸的合成：在2ml含有10mm糠醇、0.1mmbnah、50mmh2o2、0.1mm莨菪亭和0.5mg/ml肌红蛋白的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入马肝醇脱氢酶(最终浓度为2.5u/ml)启动反应，于30℃、150r/min下反应。反应48h后，2-糠酸产率为93％，辅酶转化系数约为186。实施例292-糠酸的合成：在2ml含有10mm糠醇、0.1mmbnah、50mmh2o2、0.1mm莨菪亭和0.5mg/ml肌红蛋白的甘氨酸-naoh缓冲液(50mm，ph9.0)中加入马肝醇脱氢酶(最终浓度为2.5u/ml)启动反应，于30℃、150r/min下反应。反应48h后，2-糠酸产率为90％，辅酶转化系数约为180。对照实施例1葡萄糖酸的合成：在4ml含有100mm葡萄糖、0.1mmnad+、50mmh2o2和1mg/ml血红蛋白(来源于牛红细胞，购于上海生工生物工程有限公司)的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入葡萄糖脱氢酶(最终浓度为20u/ml)启动反应，于30℃、150r/min下反应。反应12h后补加0.2mmolh2o2，反应48h后，葡萄糖酸产率为46％，辅酶转化系数约为460。对照实施例2葡萄糖酸的合成：在4ml含有100mm葡萄糖、0.1mmnad+、0.2mm乙酰丁香酮和1mg/mllaccase(5u/mg，来源于trametesversicolor，购于美国sigma-aldrich公司)的磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)中加入葡萄糖脱氢酶(最终浓度为20u/ml)启动反应，于30℃、150r/min下反应。反应48h后，葡萄糖酸产率为36％，辅酶转化系数约为360。当前第1页12