本发明属于药物合成领域，具体涉及一类新型的核苷磷酸酯类似物的制备方法及其药物组合物和用途，特别是作为治疗丙型肝炎的用途。
背景技术：
近几年美国fda批准了多个hcv药物，包括蛋白酶抑制剂、核苷类和非核苷类聚合酶抑制剂以及ns5a抑制剂等。fda批准的蛋白酶抑制剂类药物有三个：vx－950(telaprevir)，sch－503034(boceprevir)和tmc435(simeprevir)，蛋白酶抑制剂的缺点是易产生突变、毒性大、生物利用度差，对个别的基因类型有效。telaprevir作为第一代的蛋白酶抑制剂已经退出市场。高活性和广谱的第二代和第三代蛋白酶抑制剂主要用作和其他丙肝药物的联合用药的组分之一。
丙型肝炎病毒(hcv)每年有3-4百万新增的患者，世界卫生组织估计在全世界的感染者已超过2亿，在中国超过1000万病人，hcv属于黄病毒科肝病毒属病毒。长期丙型肝炎病毒感染轻至炎症，重至肝硬化、肝癌。且丙肝肝硬化失代偿期时，可以出现各种并发症，如腹水腹腔感染，上消化道出血，肝性脑病，肝肾综合征，肝衰竭等表现。
丙型肝炎发病机理仍未十分清楚，当hcv在肝细胞内复制引起肝细胞结构和功能改变或干扰肝细胞蛋白合成，可造成肝细胞变性坏死，表明hcv直接损害肝脏，导致发病起一定作用。
丙肝的聚合酶抑制剂通常分为核苷类和非核苷类两种。目前，临床上仅有索菲布韦一个核苷类丙肝药物被fda批准上市，sofosbuvir与其它抗hcv在研药物联用的临床试验也表现出积极效果。但是，由于sofosbuvir在体内生物利用度低，需要用较大的给药剂量，丙肝患者需要接受长期治疗，随之带来的病毒耐药以及长期安全性问题不容忽视，因此，开发新的生物利用度高，药效高毒性低的hcv感染治疗药物仍是临床的迫切需求。
技术实现要素：
本发明的目的是对核苷磷酸酯类似物的结构进行更进一步的改造，得到具有更高生物利用度、更低毒性和更高抗hcv病毒活性的新型核苷磷酸酯类似物，为今后深入研究与开发本发明化合物的抗病毒应用奠定基础。
为解决上述问题，本发明采用的技术方案为：
本发明提供了具有通式结构(ia)的化合物，其盐、互变异构体或游离碱
其中，base是b1、b2、b3、b4、b5；
这里，r1、r2、r3、r4、r5各自独立地是h、d、f、cl、ch3、nh2或环丙氨基。
ri是五元核糖ri1、ri2、ri3；
这里，x2、y2、x3、y3、y4各自独立地是h、f、cl、oh、ch3或n3。
z1＝o，c＝ch2；
z2＝o，ch2；
z3、z4各自独立地是o或s；
x、y各自独立地是h或d；
a＝oc(o)o，oc(o)或c(o)o；
r22＝h，c1－c6烷基；
rb＝r0，r2，r4；这里，r0＝h，c1－c6烷基；r2＝ch2ar22；r4＝芳基。
作为进一步优选的方案，本发明所述的化合物(ia)，其盐、互变异构体或游离碱，优选a＝oc(o)o；r22优选异丙基、异丁基、新戊基；r4优选苯基。
作为进一步优选的方案，本发明所述的化合物，其盐、互变异构体或游离碱，其磷原子为手性原子，优选其单一构型s(p)构型或r(p)构型或s(p)构型与r(p)构型任一比例的混合物。
作为更进一步优选的方案，本发明所述的化合物，其盐、互变异构体或游离碱，所优选的化合物结构式如下：
本发明所述的核苷磷酸酯化合物的合成路线如下：
这里：base、ri、x，y，a、r22、rb定义同权利要求1。
在碱性条件下，k2与三氯氧磷反应后，加入rboh反应，再加入五氟苯酚反应得到化合物f2b－1和f2b－2；在低温条件下，化合物f2b－1或f2b－2与核苷反应，分别得到化合物n2b－2或n2b－1。
本发明所述的核苷磷酸酯化合物与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合制备成药物制剂以及纳米制剂，以适合于经口或胃肠外给药；给药方法包括，但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内和经口途径。
一种包含本发明所述的核苷磷酸酯化合物的医药组合物。
本发明所述医药组合物，还含有独立地选自以下药物的其他治疗剂：利巴韦林(ribavirin)、干扰素、丙肝ns3蛋白酶抑制剂、hcv逆转录酶ns5b非核苷抑制剂、hcv逆转录酶ns5b核苷抑制剂、ns5a抑制剂以及ns5a抑制剂的增效剂、进入抑制剂、环孢素免疫抑制剂、ns4a拮抗剂、ns4b抑制剂、亲环素抑制剂。
本发明所述的核苷磷酸酯化合物及其药用组合物在制备抗黄病毒科病毒的药物中的应用，所述黄病毒科病毒是丙型肝炎病毒。
本发明所述的药物组合物的剂型为片剂、针剂或胶囊。
具体实施例
以下通过实施例对本发明作进一步详细阐述，但本发明不限于这些实施例。本发明实施例中使用的试剂和原料均为市场商购所得。
实施例1
(r)－(异丙氧基羰基氧基)甲基五氟苯基磷酸酯(fp020－1)和(s)－(异丙氧基羰氧基)甲基五氟苯基磷酸酯(fp020－2)的合成。
在反应瓶中加入三氯氧磷(5g，3.04ml，32.6mmol)，加乙腈200ml，冷却到－70℃，缓慢滴加k2(4.37g，32.6mmol)和三乙胺(3.3g，4.53ml，32.6mmol)的乙腈(60ml)溶液，滴加完毕，缓慢升至室温，反应过夜后，冷却到0℃，将五氟苯酚(5.4g，29.4mmol)和三乙胺(7.3g，10ml，72mmol)的乙腈溶液60ml液体滴加到上述溶液中，在0℃搅拌1小时，升至室温，搅拌过夜后，加入100ml二氯甲烷及100ml水，分出有机相，用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，残余物用硅胶柱分离(0－30％乙酸乙酯/正己烷)得6.2g白色固体，固体用10％叔丁基甲基醚/正己烷重结晶，得白色固体fp020－2(2.5g)，母液用硅胶柱分离(50％乙酸乙酯/己烷)得fp020－1(1.8g)和fp020－2(0.3g)，fp020－2和fp020－1纯度均大于99％。
fp020－1：1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)：1.12－1.23(6h，m，2×ch3)，4.68－4.79(1h，m，och)，5.31－5.43(2h，m，och2o)。
31pnmr(162mhz，cdcl3)δ－1.57。
fp020－2：1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)：1.16－1.28(6h，m，2×ch3)，4.71－4.79(1h，m，och)，5.32－5.49(2h，m，och2o)。
31pnmr(162mhz，cdcl3)δ－1.83。
实施例2
二((异丙氧基羰基氧基)甲基)五氟苯基磷酸酯(fp2020)的合成。
在反应瓶中加入三氯氧磷(5g，3.04ml，32.6mmol)，加乙腈200ml，冷却到－70℃，缓慢滴加k2(8.7g，65.2mmol)和三乙胺(6.6g，9.06ml，65.2mmol)的乙腈(60ml)溶液，滴加完毕，缓慢升至室温，反应过夜后，冷却到0℃，将五氟苯酚(5.4g，29.4mmol)和三乙胺(7.3克，10ml，72mmol)的乙腈溶液60ml液体滴加到上述溶液中，在0℃搅拌1小时，升至室温，搅拌过夜后，加入100毫升二氯甲烷及100毫升水，分出有机相，用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，残余物用硅胶柱分离(0－30％乙酸乙酯/己烷)得8.3g白色固体，固体用10％叔丁基甲基醚/己烷重结晶，得白色固体fp11(3.2g)，母液用硅胶柱分离(50％乙酸乙酯/己烷)又得fp11(2.1g)，fp11纯度大于99％。
1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)：1.10－1.25(12h，m，4×ch3)，4.61－4.81(2h，m，2×och)，5.30－5.46(4h，m，2×och2o)。
实施例3
二((新戊氧基羰基氧基)甲基)五氟苯基磷酸酯(fp2323)的合成。
以实施例2类似的方法合fp2323。
1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)：0.82－0.95(18h，m，6×ch3)，4.30－4.49(4h，m，2×cooch2)，5.33－5.48(4h，m，2×och2o)。
实施例4
(r)－((五氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基氧基)甲基碳酸异丙酯(fp24－1)和(s)－((五氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基氧基)甲基碳酸异丙酯(fp24－2)的合成。
在反应瓶中加入二氯磷酸苯酯(6.88g，3.04ml，32.6mmol)，加乙腈200ml，冷却到－70℃，缓慢滴加k2(4.37g，32.6mmol)和三乙胺(3.3克，4.53ml，32.6mmol)的乙腈(60ml)溶液，滴加完毕，缓慢升至室温，反应过夜后，冷却到0℃，将五氟苯酚(5.4g，29.4mmol)和三乙胺(7.3克，10ml，72mmol)的乙腈溶液60ml液体滴加到上述溶液中，在0℃搅拌1小时，升至室温，搅拌过夜后，加入100毫升二氯甲烷及100毫升水，分出有机相，用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，残余物用硅胶柱分离(0－30％乙酸乙酯/己烷)得7.6g白色固体，固体用10％叔丁基甲基醚/己烷重结晶，得白色固体fp24－2(3g)，母液用硅胶柱分离(50％乙酸乙酯/己烷)得fp24－1(2.3g)和fp24－2(0.4g)，fp24－2和fp24－1纯度均大于99％。
fp24－1：1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)：1.12－1.23(6h，m，2×ch3)，4.68－4.79(1h，m，och)，5.31－5.43(2h，m，och2o)，7.17－7.30(3h，m，oph邻对位上的h)，7.33－7.37(2h，m，oph间位上的h)。31pnmr(162mhz，cdcl3)δ－1.62。
fp24－2：1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)：1.16－1.25(6h，m，2×ch3)，4.70－4.83(1h，m，och)，5.32－5.48(2h，m，och2o)，7.18－7.34(3h，m，oph邻对位上的h)，7.37－7.41(2h，m，oph间位上的h)。31pnmr(162mhz，cdcl3)δ－1.98。
实施例5
(((2r，3r，4r，5r)－5－(2，4(1h，3h)－嘧啶二酮－1－基)－4－氟－3－羟基－4－甲基四氢呋喃－2－基)甲基)二((异丙氧基羰基氧基)甲基)磷酸三酯(sof2020)的合成
向50ml烧瓶中加入核苷sof(260.2mg，1mmol)和5.0ml无水thf，混合物在冰水浴中冷却至0℃。滴加叔丁基氯化镁1.0minthf溶液(3.0ml，3.0mmol)，反应混合物在0℃下搅拌30min，随后在0℃下滴加磷试剂fp2020(794mg，1.6mmol)在5mlthf中的溶液。将所得到的澄清反应溶液升至室温，搅拌20小时后，加入饱和nh4cl(15ml)，搅拌5分钟，将混合物用乙酸乙酯(200ml)稀释，分出有机相，水层用乙酸乙酯(30ml)萃取两次。合并的有机层用水(30ml)、饱和nahco3(2x30ml)、盐水(30ml)洗涤，并经na2so4干燥后减压蒸去溶剂，残留物经由硅胶柱层析(0－10％甲醇的二氯甲烷)纯化，得白色固体产物sof2020(315mg)，收率55％)。
1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)：1.09－1.39(15h，m，5×ch3)，4.09－4.14(1h，m，糖环3’－位上的h)，4.28(1h，brs，糖环3’－位上的oh)，4.34－4.41(1h，m，糖环4’－位上的h)，4.47－4.52(2h，m，糖环5’－位上的h)，4.87－4.99(2h，m，2×cooch)，5.55－5.72(5h，m，2×och2oand嘧啶环5位上的h)，6.19(1h，s，糖环1’－位上的h)，7.22－7.51(1h，d，嘧啶环6位上的h)，9.75(1h，s，嘧啶环3位上的nh)。
31pnmr(162mhz，cdcl3)δ3.27；
esi+ms：(m+h)+573.4。
实施例6
(r)－(((2s，3s，5r)－5－(5－甲基－2，4(1h，3h)－嘧啶二酮－1－基)－3－叠氮四氢呋喃－2－基)甲基)((异丙氧基羰基氧基)甲基)磷酸酯(azt020－2)的合成。
以实施例5类似的方法合成azt020－1。
1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)：1.09－1.39(6h，m，2×ch3)，1.95(3h，s，嘧啶环5位上的ch3)，2.30－2.53(3h，m，糖环2’－位上的hand糖环3’－位上的h，4.06－4.23(1h，m，糖环4’－位上的h)，4.27－4.44(2h，m，糖环5’－位上的h)，4.87－4.99(1h，m，cooch)，5.55－5.72(2h，m，och2o)，6.15(1h，t，糖环1’－位上的h，7.25(1h，s，嘧啶环6位上的h)，9.25(1h，s，嘧啶环3位上的nh)。
31pnmr(162mhz，cdcl3)δ3.79；
esi+ms：(m+h)+464.3。
实施例7
(s)－(((2s，3s，5r)－5－(5－甲基－2，4(1h，3h)－嘧啶二酮－1－基)－3－叠氮四氢呋喃－2－基)甲基)((异丙氧基羰基氧基)甲基)磷酸酯(azt020－2)的合成。
以实施例5类似的方法合成azt020－2。
1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)：1.12－1.43(6h，m，2×ch3)，1.95(3h，s，嘧啶环5位上的ch3)，2.32－2.55(3h，m，糖环2’－位上的hand糖环3’－位上的h，4.09－4.26(1h，m，糖环4’－位上的h)，4.30－4.45(2h，m，糖环5’－位上的h)，4.89－5.01(1h，m，cooch)，5.58－5.75(2h，m，och2o)，6.17(1h，t，糖环1’－位上的h，7.27(1h，s，嘧啶环6位上的h)，9.25(1h，s，嘧啶环3位上的nh)。
31pnmr(162mhz，cdcl3)δ3.92；
esi+ms：(m+h)+464.3。
实施例8
(((2r，5s)－5－(5－氟－4－氨基－2(1h)－嘧啶酮－1－基)－1，3－氧硫杂环戊烷－2－基)甲基)二((新戊氧基羰基氧基)甲基)磷酸三酯(ftc2323)的合成。
以实施例5类似的方法合成ftc2323。
1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)：0.89(18h，m，6×ch3)，3.06－3.51(2h，m，糖环2’－位上的h)，3.86－4.06(4h，m，2×cooch2)，4.26－4.47(1h，m，糖环4’－位上的h)，5.29－5.42(2h，m，糖环5’－位上的h)，5.55－5.72(5h，m，2×och2oand糖环1’－位上的h)，5.81－6.21(2h，dbrs，嘧啶环4位上的nh2)，7.92－8.16(1h，s，嘧啶环6位上的h)。
31pnmr(162mhz，cdcl3)δ4.52；
esi+ms：(m+h)+616.6。
实施例9
((s)－(((2r，5s)－5－(4－氨基－2(1h)－嘧啶酮－1－基)－1，3－氧硫杂环戊烷－2－基)甲基氧基)(苯氧基)磷酰基氧基)甲基碳酸异丙酯(3tc24－1)的合成。
以实施例5类似的方法合成3tc24－1
1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)：1.08－1.39(6h，m，2×ch3)，3.06－3.51(2h，m，糖环2’－位上的h)，4.26－4.47(1h，m，糖环4’－位上的h)，4.87－4.99(1h，m，cooch)，5.29－5.42(3h，m，糖环5’－位and嘧啶环5位上的h)，5.55－5.72(3h，m，och2oand糖环1’－位上的h)，5.81－6.21(2h，dbrs，嘧啶环4位上的nh2)，7.23－7.29(2h，m，苯环邻位上的h)，7.32－7.39(3h，m，苯环间对位上的h)，8.32－8.72(1h，d，嘧啶环6位上的h)。
31pnmr(162mhz，cdcl3)δ4.28；
esi+ms：(m+h)+502.5。
实施例10
((r)－(((2r，5s)－5－(4－氨基－2(1h)－嘧啶酮－1－基)－1，3－氧硫杂环戊烷－2－基)甲基氧基)(苯氧基)磷酰基氧基)甲基碳酸异丙酯(3tc24－2)的合成。
以实施例5类似的方法合成3tc24－2。
1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)：1.10－1.42(6h，m，2×ch3)，3.09－3.55(2h，m，糖环2’－位上的h)，4.29－4.42(1h，m，糖环4’－位上的h)，4.90－5.03(1h，m，cooch)，5.31－5.44(3h，m，糖环5’－位and嘧啶环5位上的h)，5.58－5.74(3h，m，och2oand糖环1’－位上的h)，5.85－6.24(2h，dbrs，嘧啶环4位上的nh2)，7.27－7.31(2h，m，苯环邻位上的h)，7.36－7.47(3h，m，苯环间对位上的h)，8.34－8.64(1h，d，嘧啶环6位上的h)。
31pnmr(162mhz，cdcl3)δ4.57；
esi+ms：(m+h)+502.5。
实施例11
生物学评价
1.本发明的化合物在hcv复制子(hcvpp)系统中的抗病毒活性检测
hcv复制子测定程序
一般程序：使带有hcv基因型1b复制子和萤光素酶报道基因的huh－7来源的细胞系(zluc)在补充10％胎牛血清、2mmglutamax、1％mem非必需氨基酸、100iu/ml青霉素、100μg/ml链霉素和0.5mg/ml(g418)的dulbecco改进eagle培养基(dmem)中生长。通过采用基于脂质/组蛋白的转染过程，用人类羰酸酯酶1(ces1)瞬时转染zluc细胞。转染24和48小时后，使用抗ces1和抗标签抗体，通过蛋白质印迹(westernblot)确认ces1的表达。对于剂量反应测试，以7.5xl03个细胞/孔，在50μl体积中，将细胞接种在96孔板，并在37℃/5％co2下孵育。在huh－7培养基中新鲜配制药物溶液作为2x储液。在不含g418的dmem中从这些储液制备10个另外的5倍稀释液。在接种huc细胞后至少3小时，通过向板中一式两份加入50μl的药物稀释液以开始药物处理。药物终浓度的范围为100nm－0.0000512nμ。然后将细胞在37℃/5％co2下孵育。或者以两种浓度(10nm和100nm)测试化合物。在所有情况下，huh－7(其未带有hcv复制子)用作阴性对照。在孵育72小时后，通过量化通过萤火虫萤光素酶将5’－氟萤光素单氧合成为氧基氟萤光素(oxyfiuoroluciferin)所发射的光子，来测量hcv复制的抑制。为此，通过轻叩，从板中除去培养基，将50微升one－glo萤光素酶测定试剂加入各孔。在室温下将板轻轻振荡3分钟，使用700nm截止滤波器，在具有1秒钟读出时间的victor3v1420多标记记数器(perkinelmer)上测量发光。通过microsoftexcel和xlfit4.1软件求出的所得最佳拟合方程式的剂量反应曲线计算ec50值。
对于细胞毒性评价，将zluc细胞用上述化合物处理，采用celltiter－blue细胞存活力测定法(promega)，将20μl测定溶液加入各孔中，来监测细胞存活力。然后将板在37℃/5％co2下孵育至少3小时。分别用560和590nm的激发和发射波长，在victor3v1420多标记记数器(perkinelmer)中检测板的荧光，应用microsoftexcel和xlfit4.1软件求出cc50值。
根据上述复制子测定法测定下表提供的化合物。
+++表示1-10nm；++表示10-100nm；+表示0.1-1μm；
＊索菲布韦是依照参考文献j.org.chem.2011，76，8311制备。