荧光原位检测人EGFR基因21号外显子p.L858R突变的方法及试剂盒与流程

本发明属于分子生物学和肿瘤学领域，具体涉及一种荧光原位检测人egfr基因21号外显子p.l858r突变的方法及试剂盒。

背景技术：

近年来，随着分子病理诊断的快速发展。恶性肿瘤的诊断，治疗都有了很明显的进步。肺癌患者尤其受益于分子病理诊断，特别是核酸突变的检测。这其中以人egfr基因热点突变的检测为代表。

传统的检测方法需要从肿瘤组织提取基因组dna或者血液中提取游离dna，再进行pcr检测或者二代测序检测。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种荧光原位检测人egfr基因21号外显子p.l858r突变的方法及试剂盒。

本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种荧光原位检测人egfr基因21号外显子p.l858r突变的方法，包括下述步骤：

(1)待检测样本固定好后，使用蛋白酶处理体系通透细胞，清洗；

(2)使用二类限制性内切酶处理体系处理细胞基因组dna，暴露平末端，清洗；

(3)使用核酸外切酶处理体系，从平末端开始沿着5`-3`方向降解单链dna，保留另一条基因组单链dna，清洗；

(4)使用探针结合处理体系，荧光探针结合在上一步中保留的基因组单链dna上，清洗；

(5)使用连接酶处理体系，将探针形成环状dna，清洗；

(6)使用乙醇脱水处理体系，固定单链基因组dna和环状探针dna；

(7)使用聚合酶处理体系，环状探针dna以单链基因组dna结合位置为起点，在聚合酶的作用下进行大量自我复制，产生60-70kb左右的含重复序列的单链dna，清洗；

(8)使用荧光探针结合处理体系，大量的荧光探针结合在含重复序列的单链dna上，清洗；

(9)使用封片处理体系，封片；

(10)最终在荧光显微镜下观察记录结果。

所述的二类限制性内切酶处理体系具体包括：10xcutsmartbuffer、10xbsa、pvuii酶和无核酸酶超纯水。

所述核酸外切酶处理体系具体包括：10xcutsmartbuffer、10xbsa、甘油、入核酸外切酶和无核酸酶超纯水。

所述蛋白酶处理体系具体包括：0.1nhcl和胃蛋白酶。

所述的探针结合处理体系具体包括：甲酰胺、20xssc、鲑鱼精子dna、探针序列5`pho-gcccaaaatctgtgattccttttacgacgcgatcgtaatcacctacgagttcttccagcagtttggccc-3`和无核酸酶超纯水。

所述连接酶处理体系具体包括：10xt4dnaligasebuffer、100mmatp、10xbsa、t4dna连接酶和无核酸酶超纯水。

所述梯度乙醇脱水体系具体包括：乙醇和超纯水。

所述聚合酶处理体系具体包括：10xdnapolymerasebuffer、100mmdtt、10mmdntps、10xbsa、甘油、dna聚合酶和无核酸酶超纯水。

所述荧光探针结合处理体系具体包括：甲酰胺、20xssc、鲑鱼精子dna、荧光探针序列5`fam-cgcgatcgtaatcacctacgagt-3`和无核酸酶超纯水。

所述封片处理体系具体包括：dapi、抗淬灭剂、甘油和无核酸酶超纯水。

其特征在于所述清洗处理体系具体包括：tris-hcl、nacl、tween20和无核酸酶超纯水。

本发明还包括一种荧光原位检测人egfr基因21号外显子p.l858r突变的试剂盒，包括所述的蛋白酶处理体系、二类限制性内切酶处理体系、核酸外切酶处理体系、探针结合处理体系、连接酶处理体系、梯度乙醇脱水体系、聚合酶处理体系、荧光探针结合处理体系、封片处理体系和洗液处理体系。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明提供的试剂盒可以通过特异性的探针，原位检测人egfr基因21号外显子p.l858r的突变。因此，可以用少量的细胞或者临床组织样本检测上述突变的优点。

2.本发明提供的试剂盒通过荧光探针显示突变的dna。因此，可以观察细胞或者临床组织样本中突变dna的定位和拷贝数的优点。

3.本发明提供的试剂盒可以用于所有实体肿瘤中人egfr基因21号外显子p.l858r的突变。因此，具有广泛适用性的优点。

附图说明

图1为本发明一种荧光原位检测人egfr基因21号外显子p.l858r突变试剂盒的工作示意图；

图2为本发明试剂盒在体外细胞系中结果显示图；

图3为本发明试剂盒在临床样本中的结果显示图。

具体实施方式

为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。

图1示出本发明所述的一种荧光原位检测人egfr基因21号外显子p.l858r突变试剂盒的工作原理是：egfr是定位于人7号染色体p11.2的编码基因。在大量的肺癌患者的组织样本中检测到了其21号外显子编码的858位氨基酸的突变，具体为亮氨酸突变为精氨酸，是由dna水平上胸腺嘧啶(t)核糖核酸突变成鸟苷酸(g)核糖核酸所导致的。因此，通过特异性的探针结合，可以区分野生型和突变型的dna。试剂盒通过二类限制性内切酶pvuii，在探针序列结合的基因组dna靶点附近将基因组dna切割，暴露出平末端。紧接着在λ核酸外切酶的作用下，从平末端沿着开始5`-3`端方向降解单链dna。因此，探针结合的靶基因组单链dna被暴露出来。突变型的dna由于和探针完全配对，在连接酶的作用下，探针可以形成环状进行线性自我复制，而野生型的dna和探针有一个碱基不匹配，导致探针无法形成环状进行线性自我复制。线性自我复制后的探针序列中有大量人类基因上没有的特异性dna重复序列，荧光探针通过跟这些重复序列结合来显示与突变dna结合的探针的位置。从而检测出待检样本是否含有上述突变。

一种荧光原位检测人egfr基因21号外显子p.l858r突变的试剂盒，由蛋白酶处理体系、二类限制性内切酶处理体系、核酸外切酶处理体系、探针结合处理体系、连接酶处理体系、梯度乙醇脱水体系、聚合酶处理体系、荧光探针结合处理体系组成。

而且，所述蛋白酶处理体系具体包括：0.1nhcl和胃蛋白酶，其中蛋白酶浓度为0.05％(w/v)。这些试剂均为本领域常用生化试剂。

而且，所述二类限制性内切酶处理体系具体包括：10xcutsmartbuffer、10xbsa、pvuii酶和无核酸酶超纯水，其中10xcutsmartbuffer的配方为500mm/l乙酸钾+200mm/ltri-acetate+100mm/l乙酸镁+1mg/mlbsa，10xbsa浓度为10mg/ml、pvuii酶为neb公司提供的20u/μl。这些试剂均为本领域常用生化试剂。

而且，所述核酸外切酶处理体系具体包括：10xcutsmartbuffer、10xbsa、甘油、λ核酸外切酶和无核酸酶超纯水，其中10xcutsmart的配方为500mm/l乙酸钾+200mm/ltri-acetate+100mm/l乙酸镁+1mg/mlbsa，10xbsa浓度为10mg/ml、λ核酸外切酶为neb公司提供的10u/μl。这些试剂均为本领域常用生化试剂。

而且，所述探针结合处理体系具体包括：甲酰胺、20xssc、鲑鱼精子dna、探针序列一和无核酸酶超纯水，其中20xssc配方为3m/lnacl+0.3m/l柠檬酸、甲酰胺的终浓度为15％～25％(v/v)、鲑鱼精子dna浓度为10mg/ml、探针序列为5`pho-gcccaaaatctgtgattccttttacgacgcgatcgtaatcacctacgagttcttccagcagtttggccc-3`，终浓度为100μm/l。这些试剂均为本领域常用生化试剂。

而且，所述连接酶处理体系具体包括：10xt4dnaligasebuffer、100mm/latp、10xbsa、t4dna连接酶和无核酸酶超纯水，其中10xt4dnaligasebuffer配方为400mm/ltris-hcl+100mm/l氯化镁+100mm/ldtt+5mm/latp，10xbsa浓度为10mg/ml、t4dna连接酶为thermo公司提供的5weissu/μl。这些试剂均为本领域常用生化试剂。

而且，所述梯度乙醇脱水体系具体包括：乙醇和超纯水，其中乙醇的浓度分别为70％(v/v)+80％(v/v)+100％(v/v)。这些试剂均为本领域常用生化试剂。

而且，所述聚合酶处理体系具体包括：10xdnapolymerasebuffer、100mm/ldtt、10mm/ldntps、10xbsa、甘油、dna聚合酶和无核酸酶超纯水，其中10xdnapolymerasebuffer的配方为330mm/ltris-乙酸+100mm/l乙酸镁+660mm/l乙酸钾+1％(v/v)tween20，dntps终浓度为0.25mm/l，甘油终浓度为10％(v/v)，dna聚合酶为thermo公司提供的10u/l。这些试剂均为本领域常用生化试剂。

而且，所述荧光探针结合处理体系具体包括：甲酰胺、20xssc、鲑鱼精子dna、荧光探针序列和无核酸酶超纯水，其中20xssc配方为3m/lnacl+0.3m/l柠檬酸、甲酰胺的终浓度为20％(v/v)、鲑鱼精子dna浓度为10mg/ml、探针序列为5`fam-cgcgatcgtaatcacctacgagt-3`，终浓度为250μm/l。这些试剂均为本领域常用生化试剂。

而且，所述封片处理体系具体包括：dapi、抗淬灭剂、甘油和无核酸酶超纯水，其中上述试剂包含于thermo公司的产品。这些试剂均为本领域常用生化试剂。

而且，所述清洗处理体系具体包括：tris-hcl、nacl和tween20和无核酸酶超纯水，其中tris-hcl的浓度为0.1m/l，nacl的浓度为0.15m/l，tween20浓度为0.05％(v/v)。这些试剂均为本领域常用生化试剂。

一种荧光原位检测人egfr基因21号外显子p.l858r突变的试剂盒，其步骤如下：

(1)待检测样本固定好后，使用蛋白酶处理体系通透细胞。体外细胞固定好后在37℃环境下处理5～20分钟；临床组织样本在37℃环境下处理1至2个小时。完成后弃掉液体，用清洗液清洗，再弃掉清洗液。

(2)使用二类限制性内切酶处理体系处理细胞基因组dna，暴露平末端。配制二类限制性内切酶反应体系，将10xcutsmartbuffer用无核酸酶超纯水稀释至1x，10xbsa稀释至0.2μg/μl，pvuii酶的终浓度为0.5u/μl，37℃处理30分钟。完成后弃掉液体，用清洗液清洗，再弃掉清洗液。

(3)使用核酸外切酶处理体系，从平末端开始沿着5`-3`方向降解单链dna，保留另一条基因组单链dna。配制入核酸外切酶反应体系，将10xcutsmartbuffer用无核酸酶超纯水稀释至1x，10xbsa稀释至0.2μg/μl，甘油终浓度10％(v/v)，λ核酸外切酶的终浓度为0.2u/μl，37℃处理15分钟。完成后弃掉液体，用清洗液清洗，再弃掉清洗液。

(4)使用探针结合处理体系，探针序列一结合在上一步中保留的基因组单链dna上。配制探针结合处理体系，将20xssc用无核酸酶超纯水稀释至2x，甲酰胺终浓度15％～25％(v/v)，鲑鱼精子dna稀释至0.5μg/μl，探针的终浓度为100μm/l，37℃处理15分钟。完成后弃掉液体，用清洗液清洗，再弃掉清洗液。

(5)使用连接酶处理体系，将探针形成环状dna。配制连接酶处理体系，将10xt4ligasebuffer用无核酸酶超纯水稀释至1x，10xbsa稀释至0.2μg/μl，100mm/latp稀释至0.5mm/l，t4dna连接酶的终浓度为0.5weissu/μl，室温(约22～25℃)处理1小时。完成后弃掉液体，用清洗液清洗，再弃掉清洗液。

(6)使用乙醇脱水处理体系，固定单链基因组dna和环状探针dna。将样本依次浸泡在70％(v/v)、80％(v/v)和100％(v/v)乙醇中，各2秒钟。晾干。

(7)使用聚合酶处理体系，环状探针dna以单链基因组dna结合位置为起点，在聚合酶的作用下进行大量自我复制，产生60-70kb左右的含重复序列的单链dna。配制聚合酶处理体系，将10xdnapolymerasebuffer用无核酸酶超纯水稀释至1x，10xbsa稀释至0.2μg/μl，100mm/ldtt稀释至1mm/l，10mm/ldntps稀释至0.25mm/l，dna聚合酶的终浓度为1u/μl，42℃轻轻震荡处理3小时。完成后弃掉液体，用清洗液清洗，再弃掉清洗液。

(8)使用荧光探针结合处理体系，大量的荧光探针结合在含重复序列的单链dna上。配制探针结合处理体系，将20xssc用无核酸酶超纯水稀释至2x，甲酰胺终浓度20％(v/v)，鲑鱼精子dna稀释至0.5μg/μl，荧光探针的终浓度为250μm/l，37℃处理15分钟。完成后弃掉液体，用清洗液清洗，再弃掉清洗液。

(9)重复步骤(6)。晾干

(10)加入含dapi的封片剂，封片。

(11)最终在荧光显微镜下观察记录结果。

为了更好的理解本发明试剂盒的使用方法和效果，下面通过具体的案例实验对本发明做具体阐述。

h1975和h1703体外细胞系实验2例。

从美国atcc处获得人肺癌细胞系h1975和h1703细胞系，经过pcr验证后证实h1975为egfrp.l858r突变型，而h1703细胞系为野生型。两组细胞分别接种在玻璃载玻片上，待细胞贴壁后，用70％(v/v)乙醇固定20分钟，待样本晾干后，滴加蛋白酶处理反应液50μl，湿盒中37℃处理5分钟；100μl洗液清洗一次，加入pvuii酶反应液50μl，湿盒中37℃处理30分钟；100μl洗液清洗一次，加入λ核酸外切酶反应液50μl，湿盒中37℃处理15分钟；100μl洗液清洗一次，加入探针结合反应液50μl，湿盒中37℃处理15分钟；100μl洗液清洗一次，加入t4dna连接酶反应液50μl，湿盒中室温(22～25℃)处理1小时；100μl洗液清洗一次，乙醇梯度处理脱水；晾干后，加入dna聚合酶反应液50μl，湿盒中37℃轻轻震荡处理3小时；100μl洗液清洗一次，加入荧光探针结合反应液50μl，湿盒中37℃避光处理15分钟。100μl洗液清洗一次，乙醇梯度处理脱水；晾干后，加入适量封片剂，封片；荧光显微镜下观察结果。以显微镜下白色的细胞核为定位，灰色荧光斑点为阳性结果，结果见图2。

临床样本实验2例。

从临床获得经过arms-pcr验证为egfrp.l858r突变阳性的样本，石蜡组织切片切5μm厚度，经过前期处理后，滴加蛋白酶处理反应液50μl，湿盒中37℃处理1小时；100μl洗液清洗一次，加入pvuii酶反应液50μl，湿盒中37℃处理30分钟；100μl洗液清洗一次，加入λ核酸外切酶反应液50μl，湿盒中37℃处理15分钟；100μl洗液清洗一次，加入探针结合反应液50μl，湿盒中37℃处理15分钟；100μl洗液清洗一次，加入t4dna连接酶反应液50μl，湿盒中室温(22-25℃)处理1小时；100μl洗液清洗一次，乙醇梯度处理脱水；晾干后，加入dna聚合酶反应液50μl，湿盒中37℃轻轻震荡处理3小时；100μl洗液清洗一次，加入荧光探针结合反应液50μl，湿盒中37℃避光处理15分钟。100μl洗液清洗一次，乙醇梯度处理脱水；晾干后，加入适量封片剂，封片；荧光显微镜下观察结果。以显微镜下白色的细胞核为定位，灰色荧光斑点为阳性结果，结果见图3。

以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。