香蕉品种抗性鉴定方法与流程

本申请属于植物学领域，具体地说，涉及一种香蕉品种抗性鉴定方法。

背景技术：

香蕉枯萎病是香蕉的重要土传病害，一旦发生，将会对生产造成严重损失，且难以防治。应用抗病品种是公认的最有效的防治方法。香蕉品种抗性鉴定是抗病品种筛选和选育的工作基础。目前主要采用盆栽伤根浸菌液法研究病菌的致病力和品种的抗性，但是对于香蕉苗龄、伤根程度以及抗性分级尚没有一套成熟、完善、规范的接种体系。

技术实现要素：

针对现有技术的上述缺陷，本申请提供一种香蕉品种抗性鉴定方法。

本发明公开的香蕉品种抗性鉴定方法，包括：

步骤一、香蕉苗繁殖：采用增殖培养基繁殖香蕉组培苗，采用生根培养基促使香蕉组培苗生根，将香蕉组培苗置于温度为28℃、光照为每天16h光照+8h黑暗、光照强度为2000lux的环境中培养；

步骤二、生根苗培养：香蕉组培苗生根后，将生根苗培养15-20d，待株高至7-9cm且有新生根长出后，转入经过灭菌处理的蛭石中，然后置于温度为度28℃、光照为每天16h光照+8h黑暗、光照强度为2000lux的环境中培养，7d后撒施控释肥，每株用肥料为1-2g，且每隔15d喷施一次绿肥；

步骤三、香蕉枯萎病菌孢子悬浮液制备：将香蕉枯萎病菌孢子悬浮液接种于pda培养基上，置于28℃黑暗环境中培养7d，加入无菌水刮划菌丝表面获得无性孢子，用血球计数板调制成孢子浓度为10⁶cfu/ml的孢子悬浮液；

步骤四、病菌接种：选择苗龄为60d、株高为15-20cm的香蕉苗，将根系底部切断，使根系长度保留至5cm，浸入孢子浓度为10⁶cfu/ml的孢子悬浮液中保持30min，然后将香蕉苗栽种于经过灭菌处理的蛭石中，并置于温度为28℃、湿度为80％、光照强度为2000lux的培养箱中培养；

步骤五、香蕉苗的病情级数判断：取接种培养21d天后的香蕉苗，用无菌刀片纵切球茎，根据球茎内部症状判断每株香蕉苗病情级数；

步骤六、根据每株香蕉苗的病情级数计算香蕉苗所属品种的病情指数；

步骤七、根据香蕉苗所属品种的病情指数，鉴定香蕉苗所属品种的抗性。

如上所述的香蕉品种抗性鉴定方法，其中，在步骤一中，所述增殖苗培养基中，含维生素的ms基本培养基(phytotechnologym519)的含量为4.43g/l，蔗糖的含量为30g/l，琼脂糖的含量为7g/l，6-苄基氨基嘌呤的含量为4mg/l，所述增殖苗培养基的ph值为5.8；所述生根培养基中，含维生素的ms基本培养基(phytotechnologym519)的含量为4.43g/l，蔗糖的含量为30g/l，琼脂糖的含量为7g/l，所述生根培养基的ph值为5.8。

如上所述的香蕉品种抗性鉴定方法，具体的，

在步骤五中，香蕉苗的球茎内部病情分级标准为：0级，球茎全部干净；1级，球茎与根交界处产生褐变；2级，球茎组织褐变比例小于1/3；3级，球茎组织褐变比例在1/3-2/3之间；4级，球茎组织褐变比例大于2/3；

在步骤六中，香蕉苗所属品种的病情指数的计算公式为：

病情指数＝∑(各级病情株数×相应病情级数)/(调查总株数×最高级别值)×100，所述调查总株数为步骤四中选择的苗龄为60d、株高为15-20cm的香蕉苗的总株数；

在步骤七中，香蕉品种抗性分级标准为：免疫，病情指数为0；高抗，病情指数为1-10％；抗，病情指数为11-20％；中抗，病情指数为21-30％；中感，病情指数为31-40％；感，病情指数为41-50％；高感，病情指数为51-100％。本发明提供的香蕉品种抗性鉴定方法具有以下优点：

给出了一套成熟、完善、规范的接种、计算、鉴定体系，对香蕉苗龄、株高、根系长度、以及浸入孢子浓度都给予详细的界定，并给出了香蕉苗的病情级数判断方法和抗性分级标准，因此能够准确的鉴定香蕉苗所属品种的抗性。另外，本发明提供的技术方案还具有可实施性强的特点。

附图说明

图1为本发明实施例提供的香蕉品种抗性鉴定方法的流程图；

图2a为香蕉品种baxi接种水培养21天后的示意图；

图2b为香蕉品种baxi接种病菌培养21天后的示意图；

图2c为香蕉品种pahang接种水培养21天后的示意图；

图2d为香蕉品种pahang接种病菌培养21天后的示意图。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明将从香蕉快速繁殖、生根苗的培养、伤根程度、病菌孢子液制备以及浸菌液后的培养条件等方面，给出详细的技术方案。具体的，参照图1所示，本发明提供的香蕉品种抗性鉴定方法，包括以下步骤：

步骤一、香蕉苗繁殖：采用增殖培养基繁殖香蕉组培苗，采用生根培养基促使香蕉组培苗生根，将香蕉组培苗置于温度为28℃、光照为每天16h光照+8h黑暗、光照强度为2000lux的环境中培养。

具体的，所述增殖苗培养基中，含维生素的ms基本培养基(phytotechnologym519)的含量为4.43g/l，蔗糖的含量为30g/l，琼脂糖的含量为7g/l，6-苄基氨基嘌呤的含量为4mg/l，所述增殖苗培养基的ph值为5.8；所述生根培养基中，含维生素的ms基本培养基(phytotechnologym519)的含量为4.43g/l，蔗糖的含量为30g/l％，琼脂糖的含量为7g/l，所述生根培养基的ph值为5.8。

步骤二、生根苗培养：香蕉组培苗生根后，将生根苗培养15-20d，待株高至7-9cm且有新生根长出后，转入经过灭菌处理的蛭石中，然后置于温度为28℃、光照时间为每天16h光照+8h黑暗、光照强度为2000lux的环境中培养，7d后撒施控释肥，每株用肥料为1-2g，且每隔15d喷施一次绿肥。

在具体应用中，用于培养香蕉组培苗的培养瓶的优选规格为：容量为500ml、口径为67mm、瓶身规格为80×120mm。

步骤三、香蕉枯萎病菌孢子悬浮液制备：将香蕉枯萎病菌孢子悬浮液接种于pda培养基上，置于28℃黑暗环境中培养7d，加入无菌水轻轻刮花菌丝获得无性孢子，用血球计数板调制成孢子浓度为10⁶cfu/ml的孢子悬浮液。

步骤四、病菌接种：选择苗龄为60d、株高为15-20cm的香蕉苗，将根系底部切断，使根系长度保留至5cm，浸入孢子浓度为10⁶cfu/ml的孢子悬浮液中保持30min，然后将香蕉苗转入经过灭菌处理的蛭石中，并置于温度为28℃、湿度为80％、光照强度为2000lux的培养箱中培养。

步骤五、香蕉苗的病情级数判断：取接种培养21d天后的香蕉苗，用无菌刀片纵切球茎，根据球茎内部症状判断每株香蕉苗的病情级数。

在该步骤中，香蕉苗的球茎内部病情分级标准为：0级，球茎全部干净；1级，球茎与根交界处产生褐变；2级，球茎组织褐变比例小于1/3；3级，球茎组织褐变比例在1/3-2/3之间；4级，球茎组织褐变比例大于2/3。

步骤六、根据每株香蕉苗球茎的病情级数计算香蕉苗所属品种的病情指数。

在该步骤中，香蕉苗所属品种的病情指数的计算公式为：

病情指数＝∑(各级病情株数×相应病情级数)/(调查总株数×最高级别值)×100，所述调查总株数为步骤四中选择的苗龄为60d、株高为15-20cm的香蕉苗的总株数。

步骤七、根据香蕉苗所属品种的病情指数，鉴定香蕉苗所属品种的抗性。

在该步骤中，香蕉品种抗性分级标准为：免疫，病情指数为0；高抗，病情指数为1-10％；抗，病情指数为11-20％；中抗，病情指数为21-30％；中感，病情指数为31-40％；感，病情指数为41-50％；高感，病情指数为51-100％。

下面给出的是本发明提供的技术方案的应用实施例：

1、香蕉快速繁殖

采用增殖培养基繁殖香蕉组培苗，采用生根培养基促使香蕉组培苗生根，将香蕉组培苗置于温度为28℃、光照时间为每天16h光照+8h黑暗、光照强度为2000lux的环境中培养。增殖苗培养基中，含维生素的ms基本培养基(phytotechnologym519)的含量为4.43g/l，蔗糖的含量为30g/l，琼脂糖的含量为7g/l，6-苄基氨基嘌呤的含量为4mg/l，所述增殖苗培养基的ph值为5.8；生根培养基中，含维生素的ms基本培养基(phytotechnologym519)的含量为4.43g/l，蔗糖的含量为30g/l，琼脂糖的含量为7g/l，所述生根培养基的ph值为5.8。

2、生根苗培养

生根苗培养15-20d、株高8cm左右、且有健康新生根长出，即可转入盛满蛭石的穴盘中，组培苗生长条件：温度28℃、16h/8h(光照/黑暗)、光照强度2000lux，7d后撒施适量控释肥，每株1-2g，且每隔15d喷施一次绿肥，叶面滴水为宜。32穴盘规格为：盘体长54cm、宽28cm、穴深60mm，口径60mm×60mm、底部30mm×30mm、容量110cc。

3、病菌孢子液制备

将-70℃中的30％甘油保存的香蕉枯萎病菌孢子悬浮液接种于pda培养基上，置于28℃黑暗环境中培养7d。将活化的病菌用无菌水用三角玻璃棒将孢子刮划下来，收集孢子液注入装有200ml的pdb(液体pda培养基)中，28℃、150rpm摇培3d，两层纱布过滤除去菌丝，8000rpm离心10min，弃上清液，加入无菌水重新悬浮孢子液，用血球计数板调制孢子浓度为10⁶cfu/ml。

4、病菌接种

当香蕉苗龄60d、株高15cm左右，每个品种每个处理选择10株蕉苗，用剪刀将根剪断保留至5cm，浸入10⁶cfu/ml孢子悬浮液30min，重新转入盛满蛭石的小盆钵中，浸无菌水为对照。接种苗置于光照培养箱中，温度为28℃、湿度为80％、光照强度为2000lux，21d天后纵切球茎，调查病情指数。小盆钵规格为：口径90mm×底径60mm×高度80mm。

5、病情分级标准

球茎内部症状病情调查分级标准为：0级，球茎全部干净；1级，球茎与根交界处轻微褐变；2级，球茎组织褐变小于1/3；3级，球茎组织褐变在1/3-2/3；4级，球茎组织褐变大于2/3。病情指数＝∑(各级病情株数×相应病情级数)/(调查总株数×最高级别值)×100。

参照图2a、图2b、图2c、图2d所示，对香蕉品种baxi(aaa,高感)和pahang(aa,高抗)在上述接种体系下症状差异比较记录如下：

香蕉品种baxi接种病菌培养21天后，病情指数为77.5％，为高感品种；

香蕉品种pahang接种病菌培养21天后，病情指数为7.5％，为高抗品种。综上所述，本发明提供一种香蕉品种抗性鉴定方法包括：香蕉苗繁殖；生根苗培养；香蕉枯萎病菌孢子悬浮液制备；病菌接种；香蕉苗的病情级数判断；根据香蕉苗的病情级数计算香蕉苗所属品种的病情指数；根据香蕉苗所属品种的病情指数，鉴定香蕉苗所属品种的抗性。本发明提供的技术方案是一套成熟、完善、规范的接种、计算、鉴定体系，对香蕉苗龄、株高、根系长度、以及浸入孢子浓度都给予详细的界定，并给出了香蕉苗的病情级数判断方法和抗性分级标准，因此能够准确的鉴定香蕉苗所属品种的抗性。另外，本发明提供的技术方案还具有可实施性强的特点。

上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改，并能够在本申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。