一种利用联合法从胎盘绒毛膜中提取间充质干细胞的方法与流程

本发明涉及细胞分离提取领域，具体涉及一种利用联合法从胎盘绒毛膜中提取间充质干细胞的方法。

背景技术：

间充质干细胞(mscs)，是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，在胚胎发育中来源于中胚层，之后几乎分布于机体的所有器官与组织中；mscs具有分化为多种中胚层细胞系的潜能，如骨、软骨、肌腱、脂肪、肝、肾、皮肤、肌肉、神经甚至胰腺等，因而成为再生医学中器官修复等领域的理想种子细胞。

间充质干细胞具有广阔的临床应用前景，其有三个主要来源：骨髓、脂肪组织、胎盘，其中，以胎盘中存量最多，也最接近胚胎干细胞；一直以来由于对胎盘干细胞知识缺乏了解，使得胎盘分娩后便当做医疗废物丢弃，若充分利用这些干细胞资源，便能够造福于万千家庭、造福于社会；

近年来，随着对胎盘研究的深入，不仅充分认识并利用了脐带血，也充分认识了胎盘类干细胞在医学上的重要作用，胎盘中不仅含有丰富的造血干资源，也含有丰富的间充质干细胞；

胎盘是母体与胎儿间营养交换的通道，也形成胎盘屏障；母体面以底蜕膜将母体与胎儿分开，胎儿面则以羊膜与胎儿隔离开，并通过脐带连通胎儿，为胎儿提供营养；

胎盘绒毛膜构成胎盘的胎儿部分，是胎盘的主要部分，其中含有丰富的间充质干细胞资源，目前，胎盘间充质干细胞的提取主要有组织团法、消化法两种，但两者各有弊端：组织团法不能将组织块内部的细胞爬出，造成培养成功率低、形态较差且收获率低；消化法则存在过度消化，破坏细胞的正常状态，严重影响细胞的活性；因此亟待需要有新的有效的胎盘干细胞提取方法。

技术实现要素：

为了解决现有充质干细胞提取收获效率低、活性差等问题，本发明提供了一种利用联合法从胎盘绒毛膜中提取间充质干细胞的方法，将组织块部分消化内部松散之后再贴壁培养，具体包括以下步骤：

步骤一、选取胎盘，并对胎盘进行检测，确保其全阴性；剪取胎盘上新鲜的绒毛膜样品组织；

步骤二、将剪取获得的样品组织置于磷酸缓冲盐溶液中进行清洗；

步骤三、挑取颜色鲜艳的清洗好的样品组织，去除可见大血管、残余胎盘隔组织，再将样品组织剪成样品组织碎片；

步骤四、在样品组织碎片中加入消化液，并进行摇晃消化；待消化进行到30％-70％时，再通过培养液终止，获得其中松散的组织块；

步骤五、将松散组织块平铺接种于培养容器中，静置；

步骤六、待培养容器中的组织块的周围干燥后，加入培养液，以使得组织块与培养液充分接触，再将其放入到培养箱中进行培养；

步骤七、待组织块周围细胞形成密集集落时，进行传代；

步骤八、传代培养完成后，采用磷酸缓冲盐溶液进行清洗，再用重组消化酶或胰酶消化后，待细胞变圆、脱落，停止消化，终止后收集细胞悬液；将细胞悬液去上清，将细胞沉淀重悬，按每皿不低于2.0×105个细胞接种于平皿中；

步骤九、待细胞长至80-90％密度时，获得间充质干细胞，进行冻存。

较佳地，步骤一中选取好的胎盘需经过乙肝、丙型肝炎、梅毒、艾滋、巨细胞病毒的检测，确保全阴性。

较佳地，步骤一中将胎盘上的底蜕膜剪去，并去除羊膜下层的绒毛模板层后，选取胎盘上，胎儿面脐带下端0.5-2cm新鲜绒毛膜样品组织。

较佳地，步骤二中的磷酸缓冲盐溶液含有青霉素链霉素。

较佳地，步骤四中的摇晃消化过程具体为：采用恒温摇床消化，期间每隔10-30min，手动摇晃一次，消化时间为0.5-2h。

较佳地，步骤四中通过过滤或者低速离心机离心的方式，弃上清、取沉淀，从而获得组织块。

较佳地，步骤六中培养箱的培养环境为37℃、5％co2的含量。

较佳地，步骤六与步骤七之间进一步的包括以下步骤：

s1、2-3天后，观察组织块漂浮情况，并补加培养液；

s2、6-8天后，换1次培养液，或每隔4天半量换液一次。

较佳地，步骤八中，重组消化酶消化8-10min，或者0.25％的胰酶消化1min左右。

本发明由于采用以上技术方案，使之与现有技术相比，具有以下的优点和积极效果：

本发明提供的利用联合法从胎盘绒毛膜中提取间充质干细胞的方法，将胎盘绒毛膜组织通过部分消化法进行初步分解，再利用消化后的松散产物通过组织接种的方式，通过培养制备得到胎盘多能干细胞的步骤；然后再将原代细胞进行传代培养并收集的步骤；最后进行程序降温冻存，将温度降至-80℃后取出样本，转移至液氮罐中长期保存；

整个方法过程包括组织的分离、干细胞的培养和冻存，采用胎盘绒毛膜作为提取干细胞的组织来源，使用本发明提供的方法能获得均一、稳定、强克隆形成能力；

本发明采用酶消化法和组织块法联合，能够收集到较多的单个核细胞，并诱导组织块中爬出更多的间充质干细胞，大幅度提高胎盘多能干细胞的收获率。

附图说明

结合附图，通过下文的详细说明，可更清楚地理解本发明的上述及其他特征和优点，其中：

图1为联合消化法原代爬出的细胞放大40倍的示意图；

图2为联合消化法原代爬出的细胞放大100倍的示意图；

图3为联合消化法第一代爬出的细胞放大40倍的示意图；

图4为联合消化法第一代爬出的细胞放大100倍的示意图；

图5为联合消化法第三代爬出的细胞放大40倍的示意图；

图6为联合消化法第三代爬出的细胞放大100倍的示意图

图7为第一代细胞流式检测结果组图；

图8为第五代细胞流式检测结果组图。

具体实施方式

参见示出本发明实施例的附图，下文将更详细地描述本发明。然而，本发明可以以许多不同形式实现，并且不应解释为受在此提出之实施例的限制。相反，提出这些实施例是为了达成充分及完整公开，并且使本技术领域的技术人员完全了解本发明的范围。这些附图中，为清楚起见，可能放大了层及区域的尺寸及相对尺寸。

本发明提供了一种利用联合法从胎盘绒毛膜中提取间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

步骤一、选取胎盘，并对胎盘供着进行检测，确保其全阴性；剪取胎盘上新鲜的绒毛膜样品组织；

其中，选取足月顺产或剖宫产风胎盘，并经过乙肝(hbsag)、丙型肝炎(hcv)、梅毒、艾滋、巨细胞病毒检测，确保全阴性；当然，在其他实施例中也可选用其他类型的胎盘作为样品，且前期的病毒检查也可不局限于以上所列出的几种病毒检查，可根据具体情况进行选择；

其中，将胎盘上的底蜕膜(即靠近母体面的表层)剪去，并去除羊膜下层的绒毛模板层后，选取胎盘上，胎儿面脐带下端0.5-2cm新鲜绒毛膜样品组织(因此处组织血管丰富，营养供给充足，绒毛膜丰富发达)；

步骤二、将剪取获得的样品组织置于磷酸缓冲盐溶液中进行清洗，至鲜红或粉红色；

其中，磷酸缓冲盐溶液含有青霉素链霉素。当然，在其他实施例中，磷酸缓冲盐溶液的配备方法也可根据具体情况进行调整，此处不做限制。

步骤三、挑取颜色鲜艳的清洗好的样品组织，去除可见大血管、残余胎盘隔组织，再将样品组织剪成样品组织碎片；

其中，将样品组织放在合适的容器中剪成肉糜(即样品组织碎片)，注意无菌操作，其中剪成肉糜的方式可以为各种物理方法，此处不做限制；

其中，将样品组织剪碎至0.5-1cm³的小块。

步骤四、在样品组织碎片中加入消化液，并进行摇晃消化；再通过用10％a-mem培养液终止，获得其中的组织块；

其中，摇晃消化过程具体为：采用恒温摇床消化，期间每隔10-30min，手动摇晃一次，消化时间为0.5-2h；

其中，组织块的获取方法为：

用100-200目过滤，收集组织块；

或者，不进行过滤，直接用低速离心机1500--2500rpm5min，弃上清；

根据具体情况来选择沉淀组织的获取方法，此处不做限制。

步骤五、对收集的松散组织块平铺接种于培养皿或者t瓶等培养容器中，做好标记，静置。

步骤六、待培养容器中的组织块的周围干燥后，加入培养液，以使得组织块与培养液充分接触，再将其放入到培养箱中进行培养；

其中，培养液具体为3-5ml的20％a-mem，使组织块充分接触培养液，并尽量减少组织块漂浮；当然，在其他实施例中培养液也可根据具体情况进行选择，此处不做限制；

其中，培养箱的培养环境为37℃、5％的co2的含量，培养环境也可根据具体情况进行选择，此处不做限制；

步骤六进一步的包括以下步骤：

s1、2-3天后，观察组织块漂浮情况，并补加培养液(3-5ml的20％a-mem)；

s2、6-8天后，换1次培养液，或每隔4天半量换液一次。

步骤七、待组织块周围细胞形成密集集落时，进行传代；所谓传代，即当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，细胞之间会因接触性抑、营养不足以及代谢废物积累，导致生长速度减慢甚至停止，需要将原代培养物转移至新的体系中扩增，以保存原代的二倍体特性。

步骤八、传代培养完成后，采用磷酸缓冲盐溶液进行清洗，再用重组消化酶或胰酶消化后，待细胞变圆、脱落，停止消化，终止后收集细胞悬液；将细胞悬液去上清，将细胞沉淀重悬，按每皿不低于2.0×105个细胞接种于平皿中；

其中，重组消化酶消化8-10min，或者0.25％的胰酶消化1min左右。

步骤九、待细胞长至80-90％密度时，即可获得间充质干细胞，再进行冻存。

具体的，最后进行程序降温冻存，将温度降至-80℃后取出样本，转移至液氮罐中长期保存；

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了一种利用联合法从胎盘绒毛膜中提取间充质干细胞的方法，包括组织的分离、干细胞的培养和冻存，而且，本发明是采用胎盘绒毛膜作为提取干细胞的组织来源，使用本发明能获得均一、稳定、强克隆形成能力；

本发明采用酶消化法和组织块法联合，能够收集到较多的单个核细胞，并诱导组织块中爬出更多的间充质干细胞，大幅度提高胎盘多能干细胞的收获率。

对通过上述方法获得的间充质干细胞进行观察检测，具体的：

1、通过放大观察参照图1-6，分别为联合消化法原代、第一代、第三代爬出的细胞的放大40倍、放大100倍的示意图，图中原代、第一代、第二代的细胞呈长梭形，说明联合法分离得到细胞符合间充质干细胞的形态特征；因此从图中可以毫无异议的看出，经过上述方法提取出了有效的细胞。

2、细胞流式检测结果

图7为第一代细胞流式检测结果组图，其中，上左为pe，上右为cd34，中左为cd45，中右为hla-dr，下左为cd73，下右为cd90；图8为第五代细胞流式检测结果组图，其中，上左为pe，上右为hla-dr，中左为cd34，中右为cd45，下左为cd73，下右为cd90；

图中第一代、第五代的细胞的表面标记物符合间充质干细胞表面标记物的特征，因此经过细胞流式检测，由图7和图8中可以看出经过上述方法获得的细胞为充质干细胞。

本技术领域的技术人员应理解，本发明可以以许多其他具体形式实现而不脱离其本身的精神或范围。尽管已描述了本发明的实施案例，应理解本发明不应限制为这些实施例，本技术领域的技术人员可如所附权利要求书界定的本发明的精神和范围之内作出变化和修改。