一种人肺泡上皮细胞分离与培养方法与流程

本发明属于组织工程技术领域，特别涉及一种人肺泡上皮细胞分离与培养方法。

背景技术：

气道上皮细胞是功能活跃的细胞，不仅构成呼吸道的物理屏障，还具有对化学性毒物或药物的转化代谢作用，具有自分泌或旁分泌功能，同时参与对毗邻细胞功能的调控。刚离体的原代细胞保留有原有的生物学遗传特性，能反映体内细胞生长的一般特征，因此适用于药物及疗法等研究。建立正常肺泡上皮细胞及病变的肺泡上皮细胞的体外细胞模型，有利于更好地了解肺泡上皮细胞的病理改变，较动物实验而言也更为简便、可靠。但目前对肺泡上皮细胞的体外培养尚不成熟。因此，探索一种能提高肺泡上皮细胞活性和增殖能力的体外培养方法，已成为本领域技术人员急需解决的技术问题。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种人肺泡上皮细胞分离与培养方法。

本发明具体技术方案如下：

本发明提供了一种人肺泡上皮细胞分离与培养方法，包括如下步骤：

s1：在无菌条件下采集肺叶样本，将气管切成片状组织，得到肺泡上皮组织的组织碎片；

s2：配置用于细胞贴壁生长的活化基底，涂布在培养皿上并进行固化；

s3：在固化的所述活化基底上设置接种位置，并将所述组织碎片接种到所述接种位置上，使所述组织碎块贴附在培养皿底壁；

s4：向接种后的组织碎片中添加活化培养液，置于混合氧气内进行活化培养；

该步骤可以有效避免采集的组织样本由于缺血而引起损伤，以利于后续的培养操作；

s5：将经过活化培养的组织碎片转移到新的涂布有活化基底的培养皿中，添加原代培养液，在co2培养箱中进行原代培养，培养8～10d后将组织碎片转移至新的涂布有活化基底的培养皿中，重复原代培养过程若干次，得到原代细胞；

s6：将所述原代细胞以每瓶10⁴个细胞的浓度进行接种，采用经过照射的3t3细胞作滋养层，加入传代培养液进行悬浮培养，得到传代细胞；

将3t3细胞作为滋养层，可以为原代肺泡上皮细胞提供良好的生长基底；将原代肺泡上皮细胞接种于其上之后，肺泡上皮细胞能明显抑制3t3细胞的生长，且自身生长良好，并将3t3细胞不断推至培养皿边缘。通过上述方法，可以有效促进肺泡上皮细胞的生长分裂，从而大大提高培养效果。

进一步地，步骤s1的具体方法如下：

在无菌条件下采集肺叶样本，浸入l-15培养液中，切开气管，并切成1cm²的正方形片状，得到肺泡上皮组织的组织碎片。

进一步地，步骤s2的具体方法如下：

配置用于细胞贴壁生长的活化基底，取1ml涂布在6cm培养皿底面，置于36.5℃的co2培养箱内放置2h，使所述活化基底固化，并加入5ml活化培养液。

进一步地，步骤s3的具体方法如下：

在培养皿底部表面边缘用解剖刀刻画出1cm²的正方形，并去除其中的活化基底，形成接种位置；将所述组织碎片上皮面向上移入所述接种位置中，去除活化培养液，在室温下静置3～5min，使组织块贴附在培养皿底壁。

进一步地，步骤s4的具体方法如下：

向接种后的组织碎片中添加3mldmem培养液，放入可控气室，向气室中注入混合氧气，将气室置于摇床上，在36.5℃、10r/min条件下培养24h，使培养液从组织碎片表面流过、充分浸润组织碎片；然后更换dmem培养液和混合氧气，继续培养6～8d，每2d更换一次培养液和混合氧气；

所述混合氧气包括50％o2、45％n2以及5％co2。

上述混合氧气可以有效避免采集的组织样本由于缺血而引起损伤，以利于后续的培养操作。

进一步地，步骤s5的具体方法如下：

s5.1：用新的10cm培养皿凸部活化基底，并对活化基底底部进行真空吸引，用解剖刀刻画新的接种位置，并将组织碎片转移至新的培养基中，添加无菌培养液，室温下放置3～5h；

s5.2：加入10mllhc-9培养液(购自thermofisher)，在湿化的5％co2培养箱中进行原代培养，每3～4d更换培养液；

s5.3：培养8～10d后，将组织块移入新的涂布有活化基底的培养皿中，重复步骤s5.2若干次，得到原代细胞。

进一步地，步骤s6的具体方法如下：

s6.1：用pbs缓冲液对所述原代细胞进行洗涤，并用消化液进行消化，消化结束后，用培养液悬浮细胞并计数；按照每瓶10⁴个的接种量接种到新的培养瓶中；

s6.2：加入5～10倍数量的经过co60照射的3t3细胞，混合均匀后加入传代培养液，置于37℃下培养15～30天，即得到传代细胞；

3t3细胞的处理方法如下：

(1)用含有10％小牛血清的dmem培养基培养3t3细胞，48h后更换培养液，继续培养15～30天；

(2)通过60gyco60照射、对3t3细胞进行灭活；

(3)用所述消化液对灭活的3t3细胞进行消化，用不含血清的dmem培养基清洗两次，并进行混悬。

co60照射可以使3t3细胞丧失分裂能力，同时不影响原有细胞的活性，从而为原代肺泡细胞提供性质优异的滋养层。

进一步地，所述活化基底为添加有如下成分的lhc-9培养液：

人纤粘素0.2％；胶原1％；胎牛血清12％。

人纤粘素可以促进细胞贴壁生长；胶原可以有效包被细胞、保护细胞；血清可以抑制肺泡上皮细胞的分裂和分化，以保持细胞的形态和活力。上述成分可以提高细胞活力、促进细胞贴壁生长。

进一步地，所述消化液为添加有0.02％胰蛋白酶和0.02％edta的1％聚乙烯吡咯烷酮溶液。

上述成分可以有效地对贴壁的细胞进行消化，从而使细胞充分分散，以利于后续的传代培养。

进一步地，所述传代培养液为添加有如下成分的dmem培养基：

乳酸钠格林8～12％、尿囊素1.5～2.5％、肌酸0.5～1％、积雪草苷0.2～0.5％以及绿原酸0.1～0.2％。

乳酸钠格林为乳酸钠、氯化钠、氯化钾与氯化钙的灭菌水溶液，可用于提供接近人体的渗透压适中的环境，以利于细胞的存活；尿囊素可以促进细胞生长、软化角质蛋白，从而加快组织更新和伤口愈合；肌酸可以为细胞代谢快速提供能量、促进细胞生长和更新；积雪草苷可以加速细胞代谢和分裂、促进组织生长和伤口愈合；绿原酸具有优异的抗菌、抗病毒效果，并且能有效抗氧化、提升细胞活性。使用上述配比的传代培养液，可以有效提高细胞活力、促进细胞分裂，从而快速获得优质的传代细胞。

本发明的有益效果如下：本发明提供了一种人肺泡上皮细胞分离与培养方法，采集的组织在活化基底的包围下可以有效地进行贴壁生长，血清成分可抑制肺泡上皮细胞的分裂和分化，从而大大提高了细胞活力；组织碎片在特定的气体环境下震荡培养，可以有效避免采集的组织样本由于缺血而引起损伤，以利于后续的培养操作；传代培养基中添加的尿囊素、肌酸和积雪草苷可以有效提高细胞活力和分裂能力，从而促进细胞生长和增殖；将3t3细胞作为滋养层，可以为原代肺泡上皮细胞提供良好的生长基底，有效促进肺泡上皮细胞的生长分裂，从而大大提高培养效果。通过上述方法，可以显著提高肺泡上皮细胞的活性和增值速率，从而为相关研究项目提供优质的实验材料。

附图说明

图1为肺泡上皮细胞的电镜照片；

图2为采用不同方法对肺泡上皮细胞进行培养的生长曲线。

具体实施方式

主要试剂及培养基的配制

a.l-15培养基：具体成分如下：

10％胎牛血清，900mg/ld-半乳糖，300mg/ll-谷氨酰胺，550mg/l丙酮酸钠。

b.dmem培养基：具体成分如下：

c.pbs缓冲液：

称取8gnacl、0.2gkcl、1.44gna2hpo4和0.24gkh2po4,溶于800ml蒸馏水中，用hcl调节溶液的ph值至7.4，最后加蒸馏水定容至1l即可。在15lbf/in2(1034×105pa)高压下蒸气灭菌(至少20min)，保存于室温或4℃冰箱中。

下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

一种人肺泡上皮细胞分离与培养方法，包括如下步骤：

s1：在无菌条件下采集肺叶样本，将气管切成片状组织，得到肺泡上皮组织的组织碎片；

s2：配置用于细胞贴壁生长的活化基底，涂布在培养皿上并进行固化；

s3：在固化的所述活化基底上设置接种位置，并将所述组织碎片接种到所述接种位置上，使所述组织碎块贴附在培养皿底壁；

s4：向接种后的组织碎片中添加活化培养液，置于混合氧气内进行活化培养；

s5：将经过活化培养的组织碎片转移到新的涂布有活化基底的培养皿中，添加原代培养液，在co2培养箱中进行原代培养，培养8～10d后将组织碎片转移至新的涂布有活化基底的培养皿中，重复原代培养过程若干次，得到原代细胞；

s6：将所述原代细胞以每瓶10⁴个细胞的浓度进行接种，采用经过照射的3t3细胞作滋养层，加入传代培养液进行悬浮培养，得到传代细胞。

实施例2

一种人肺泡上皮细胞分离与培养方法，包括实施例1提供的各步骤，其中步骤s1的具体方法如下：

在无菌条件下采集肺叶样本，浸入l-15培养液中，切开气管，并切成1cm2的正方形片状，得到肺泡上皮组织的组织碎片。

步骤s2的具体方法如下：

配置用于细胞贴壁生长的活化基底，取1ml涂布在6cm培养皿底面，置于36.5℃的co2培养箱内放置2h，使所述活化基底固化，并加入5ml活化培养液。

步骤s3的具体方法如下：

在培养皿底部表面边缘用解剖刀刻画出1cm²的正方形，并去除其中的活化基底，形成接种位置；将所述组织碎片上皮面向上移入所述接种位置中，去除活化培养液，在室温下静置3～5min，使组织块贴附在培养皿底壁。

步骤s4的具体方法如下：

向接种后的组织碎片中添加3mldmem培养液，放入可控气室，向气室中注入混合氧气(50％o2、45％n2以及5％co2)，将气室置于摇床上，在36.5℃、10r/min条件下培养24h，然后更换dmem培养液和混合氧气，继续培养6～8d，每2d更换一次培养液和混合氧气。

步骤s5的具体方法如下：

s5.1：用新的10cm培养皿凸部活化基底，并对活化基底底部进行真空吸引，用解剖刀刻画新的接种位置，并将组织碎片转移至新的培养基中，添加无菌培养液，室温下放置3～5h；

s5.2：加入10mllhc-9培养液，在湿化的5％co2培养箱中进行原代培养，每3～4d更换培养液；

s5.3：培养8～10d后，将组织块移入新的涂布有活化基底的培养皿中，重复步骤s5.2若干次，得到原代细胞。

步骤s6的具体方法如下：

s6.1：用pbs缓冲液对原代细胞进行洗涤，并用消化液进行消化；消化结束后，用培养液悬浮细胞并计数；按照每瓶10⁴个的接种量接种到新的培养瓶中；

s62：加入5～10倍数量的经过co60照射的3t3细胞，混合均匀后加入培养液，置于37℃下培养15～30天，即得到传代细胞。

其中，3t3细胞的处理方法如下：

(1)用含有10％小牛血清的dmem培养基培养3t3细胞，48h后更换培养液，继续培养15～30天；

(2)通过60gyco60照射、对3t3细胞进行灭活；

(3)用消化液对灭活的3t3细胞进行消化，用不含血清的dmem培养基清洗两次，并进行混悬。

实施例3

一种人肺泡上皮细胞分离与培养方法，包括实施例2提供的各步骤，其中采用的活化基底为添加有如下成分的lhc-9培养液：

人纤粘素0.2％；胶原1％；胎牛血清12％。

实施例4

一种人肺泡上皮细胞分离与培养方法，包括实施例2所述各步骤，其中采用的所述消化液为添加有0.02％胰蛋白酶和0.02％edta的1％聚乙烯吡咯烷酮溶液。

实施例5

一种肺泡上皮细胞分离与培养方法，包括实施例2所述各步骤，其中采用的传代培养液为添加有如下成分的dmem培养基：

乳酸钠格林8％、尿囊素1.5％、肌酸1％、积雪草苷0.2％以及绿原酸0.2％。

实施例6

一种肺泡上皮细胞分离与培养方法，包括实施例2所述各步骤，其中采用的活化基底为添加有如下成分的lhc-9培养液：

人纤粘素0.2％；胶原1％；胎牛血清12％；

采用的所述消化液为添加有0.02％胰蛋白酶和0.02％edta的1％聚乙烯吡咯烷酮溶液；

采用的传代培养液为添加有如下成分的dmem培养基：

乳酸钠格林12％、尿囊素2.5％、肌酸0.5％、积雪草苷0.5％以及绿原酸0.1％。

对照例1

一种肺泡上皮细胞分离与培养方法，包括实施例2所述各步骤，其中采用的传代培养液为添加有如下成分的dmem培养基：

乳酸钠格林8％、尿囊素2.5％、肌酸0.5％以及绿原酸0.2％

对照例2

一种肺泡上皮细胞分离与培养方法，包括实施例2所述各步骤，其中采用的传代培养液为添加有如下成分的dmem培养基：

乳酸钠格林12％、胎牛血清3％、积雪苷0.5％以及绿原酸0.1％。

对照例3

一种肺泡上皮细胞分离与培养方法，包括实施例2所述各步骤，其中采用的传代培养液为rpmi1640培养基。

实验例

染色鉴定

分别采用实施例2、4、5、6提供的方法为实验组1～4，以对照例1～3提供的方法分别作为对照组1～3，并以刘涛等(积雪草苷对tgf-β1诱导的肺泡细胞增殖和vimentin蛋白表达影响.中国免疫学杂质,2019,35:25-29)提供的培养方法作为对照组4，分别对同一来源的肺泡上皮组织标本进行培养，培养结束后对角蛋白抗体进行染色，并在电镜下进行观察，结果如图1所示。

电镜结果显示，各组细胞的角蛋白阳性率达到90％以上，证明各组细胞均为上皮源性，即肺泡上皮细胞。

生长曲线

用96孔板对各组细胞进行传代培养，采用cck-8法分别为各组细胞绘制生长曲线，取样时间分别为传代培养的第1、2、3、5、7、10、15d，结果如图2所示。

由曲线可知，实验组各组的细胞数量和增速均高于对照组各组，其中以实验组4的增殖活性最高，表明本申请提供的方法可以显著提高肺泡上皮细胞的生殖活性，特别以实验组4(即实施例6)提供的方法最佳。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。