一种用于改良种子大小和品质的基因的获得方法和应用与流程

本发明涉及植物基因工程和细胞生物学技术领域，具体涉及一种用于改良种子大小和品质的基因的获得方法和应用。

背景技术：

植物的种子大小是标志产量最重要的特征之一(alonso-blancocetal,pnas，1999，96：4710-4717；molesatetal，pnas，2005，102:10540-10544)。被子植物中，种子通常包括胚、胚乳和种皮，它们分别由受精卵、已受精的中央细胞和珠被发育而来。近十几年来，尽管人们在理解控制种子大小的分子机制方面取得一定进展，但发现的调控种子大小的关键基因并不多。未来的主要挑战是进一步挖掘调控种子大小的关键基因，并建立完善的分子调控网络，为使用现代生物技术(基因组学相关研究，基因编辑，蛋白组学，代谢组学和数学模型建立等)改良作物提供重要的基因资源。

拟南芥是一种十字花科植物，广泛应用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物。mee45(maternaleffectembryoarrest45)，是拟南芥中含有四个b3-domain的转录因子。现有技术中有对该基因家族其他成员的研究，但是其主要侧重于该类基因在植物体细胞胚胎的发生的研究。然而，mee45与改良种子大小和品质有关的功能分析尚未见报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明经长期研究和探索，发现了能够改良种子大小和品质的基因mee45和bnac04g36220d。本发明用包含上述基因的全长片段的dna序列构建过表达载体，然后将mee45基因过表达载体导入农杆菌菌株，并用农杆菌介导法侵染拟南芥花序，建立了转基因拟南芥株系。发明人进一步培育后将转基因株系与野生型植株进行比较，发现利用该基因所得的转基因株系具有叶器官变大、种子变大、千粒重增加和油脂含量增高等表型。将该基因过量表达应用于生产、改良种子的大小、千粒重和油脂含量等重要农艺性状，用于提高作物的产量和品质，具有重要的经济价值和社会效益。

基于上述基因，本发明的第一方面，提供用于改良种子大小和品质的基因，是如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其核苷酸序列如seqidno.1所示；

2)其核苷酸序列如seqidno.3所示；

3)由seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白的编码基因；

4)由seqidno.4所示的氨基酸序列组成的蛋白的编码基因。

本发明的第二方面，提供携带上述基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌。

其中，携带mee45基因的重组表达载体如图1所示；携带bnac04g36220d基因的重组表达载体如图2所示。

携带上述基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在改良种子大小和品质中的应用也是本发明的保护范围。

上述应用中，所述改良种子大小和品质包括：叶器官变大、种子变大、千粒重变大和油脂含量增高。

本发明的第三方面，提供如下a)-f)中任一项所述的dna片段在改良种子大小和品质中的应用；

a)seqidno.1所示的dna片段；

b)编码seqidno.2所示氨基酸序列的dna片段；

c)dna片段，与a)或b)限定的dna片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与seqidno.2所示的蛋白等价；

d)seqidno.3所示的dna片段；

e)编码seqidno.4所示氨基酸序列的dna片段；

f)dna片段，与d)或e)限定的dna片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与seqidno.4所示的蛋白等价。

上述应用中，所述改良种子大小和品质包括：叶器官变大、种子变大、千粒重变大和油脂含量增高。

本发明的第四方面，提供如下1)-6)中任一项所述的蛋白在改良种子大小和品质中的应用；

1)氨基酸序列是seqidno.2所示的蛋白；

2)将seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与seqidno.2所示的蛋白具有相同功能的蛋白；

3)在seqidno.2所示的蛋白的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白；

4)氨基酸序列是seqidno.4所示的蛋白；

5)将seqidno.4所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与seqidno.4所示的蛋白具有相同功能的蛋白；

6)在seqidno.4所示的蛋白的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白。

上述应用中，所述改良种子大小和品质包括：叶器官变大、种子变大、千粒重变大和油脂含量增高。

本发明的第五方面，提供一种促进种子增大和/或油脂合成的方法，包括用如下a)-f)任一项所述的多核苷酸转化植物并使所述多核苷酸在所述植物中表达的步骤；

a)seqidno.1所示的dna片段；

b)编码seqidno.2所示氨基酸序列的dna片段；

c)dna片段，与a)或b)限定的dna片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与seqidno.2所示的蛋白等价；

d)seqidno.3所示的dna片段；

e)编码seqidno.4所示氨基酸序列的dna片段；

f)dna片段，与d)或e)限定的dna片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与seqidno.4所示的蛋白等价。

在农业生产中，有时需要降低植物种子中油脂含量以获得更为有利的性状，例如在用于生产蛋白粉的大豆中。基于此，本发明的第六方面，提供一种降低种子中油脂含量的方法，包括在产生所述种子并且含有如下a)-f)任一项所述的多核苷酸的植物中使所述多核苷酸表达降低或不表达的步骤；

a)seqidno.1所示的dna片段；

b)编码seqidno.2所示氨基酸序列的dna片段；

c)dna片段，与a)或b)限定的dna片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与seqidno.2所示的蛋白等价；

d)seqidno.3所示的dna片段；

e)编码seqidno.4所示氨基酸序列的dna片段；

f)dna片段，与d)或e)限定的dna片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与seqidno.4所示的蛋白等价；

或者包括在产生所述种子并且含有由如下1)-4)中任一项所述的蛋白的植物中使所述蛋白质活性降低或丧失的步骤；

1)氨基酸序列是seqidno.2所示的蛋白；

2)将seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与seqidno.2所示的蛋白具有相同功能的蛋白；

3)氨基酸序列是seqidno.4所示的蛋白；

4)将seqidno.4所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与seqidno.4所示的蛋白具有相同功能的蛋白。

优选的，使所述多核苷酸表达降低或不表达的方法包括：突变或敲除所述多核苷酸的全部或部分序列；或者使用干扰rna干扰所述多核苷酸的表达；或者使用基因沉默系统使所述多核苷酸的表达沉默。

本发明的第七方面，提供一种培育种子大小和品质改良的转基因植物的方法，是将如下a)-f)任一项所述的多核苷酸导入目的植物得到种子大小和品质改良的转基因植物；

a)seqidno.1所示的dna片段；

b)编码seqidno.2所示氨基酸序列的dna片段；

c)dna片段，与a)或b)限定的dna片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与seqidno.2所示的蛋白等价；

d)seqidno.3所示的dna片段；

e)编码seqidno.4所示氨基酸序列的dna片段；

f)dna片段，与d)或e)限定的dna片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与seqidno.4所示的蛋白等价。

上述方法中，所述种子大小和品质改良为如下1)-4)中的至少一种：

1)所述转基因植物的种子大于所述目的植物；

2)所述转基因植物的叶器官大于所述目的植物；

3)所述转基因植物的种子的千粒重大于所述目的植物；

4)所述转基因植物的种子中油脂含量大于所述目的植物。

作为优选，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物选自水稻、小麦或玉米；所述双子叶植物选自拟南芥、大豆、油菜、花生或向日葵。

本发明的有益效果：

本发明首次提供了一种用于改良种子大小和质量的基因：拟南芥转录因子基因mee45及其在甘蓝型油菜中的同源基因bnac04g36220d，利用该基因所得的转基因植物具有叶器官变大、种子变大、千粒重变大和油脂含量增高等表型。将该基因应用于生产，改良种子的大小、千粒重和油脂含量等重要农艺性状，用于提高作物的产量和品质，具有重要的经济价值和社会效益。

附图说明

图1：植物表达载体pmee45::mee45-gfp载体结构图。

图2：植物表达载体35s::bnac04g36220d载体结构图。

图3：野生型(wt)、mee45突变体(mee45)、mee45恢复型(pmee45::mee45mee45)和mee45过表达植株(pmee45::mee45)种子大小和粒重的比较及野生型和mee45突变体种子中油脂含量的测定。

图4：野生型、mee45突变体、mee45恢复型和mee45过表达植株不同时期胚胎发育的比较；

图5：mee45突变体与野生型植株进行父母本的正反交实验；

图6：mee45基因的在胚珠和胚胎表达模式和蛋白的亚细胞定位；

图7：野生型、mee45突变体和过表达35s::mee45种子油脂含量分析；

图8：过表达甘蓝型油菜同源基因bnac04g36220d在mee45突变体和野生型中的比较。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，现有报道的调控种子大小的关键基因并不多。未来的主要挑战是进一步挖掘调控种子大小的关键基因。

本发明人通过长期的研究和探索，发现了一种用于改良种子大小和品质的基因，该基因为拟南芥转录因子基因mee45，该基因扩增自拟南芥基因组，该基因含有四个保守的b3结构域，属于lec2家族，其核苷酸序列如sedidno.1所示，该基因编码序列全长为1587bp；氨基酸序列如sedidno.2所示，编码528个氨基酸。用包含该mee45基因的全长片段的dna序列构建过表达载体，然后将mee45基因过表达载体导入农杆菌菌株，并用农杆菌介导法侵染拟南芥花序，建立了转基因拟南芥株系。发明人进一步培育后将转基因株系与野生型植株进行比较，发现利用该基因所得的转基因株系具有叶器官变大、种子变大、千粒重增加和油脂含量增高等表型。将该基因过量表达应用于生产、改良种子的大小、千粒重和油脂含量等重要农艺性状，用于提高作物的产量和品质，具有重要的经济价值和社会效益。

通过进化树分析和同源性比较，本发明还找到了甘蓝型油菜中与mee45亲缘关系较近的同源性达56％基因bnac04g36220d，该基因的核苷酸序列如sedidno.3所示，该基因全长为1530bp，氨基酸序列如sedidno.4所示，编码509个氨基酸。研究发现过表达bnac04g36220d基因转拟南芥mee45突变体，能够恢复mee45种子变小的表型；过表达bnac04g36220d基因转拟南芥野生型，转基因植株种子变大。因此，bnac04g36220d基因也可以用于改良种子大小和品质。

基于上述发现的mee45基因和bnac04g36220d基因，本发明的保护范围还包括与上述两个基因同源的dna片段，只要它们编码的蛋白与seqidno.2或seqidno.4所示的蛋白功能等价。本文所指的“与seqidno.2或seqidno.4所示的蛋白功能等价”意味着目标dna片段所编码的蛋白在生物学功能和生理生化特征等方面与本发明中seqidno.2或seqidno.4所示的蛋白相同或相近。seqidno.2或seqidno.4所示的蛋白典型的生物学功能是促使植物种子增大、叶器官增大、千粒重增加和种子中油脂含量提高。通过上调seqidno.2或seqidno.4所示的蛋白的表达量和/或活性，可以于改良种子大小和品质。

这些与mee45基因和bnac04g36220d基因同源的dna片段包括本发明核苷酸序列(seqidno.1、seqidno.3)对应的等位基因、同源基因、突变基因和衍生基因；它们编码的蛋白类似于本发明seqidno.2或seqidno.4所示的蛋白，或存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入现象，都属于本发明内容。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的mee45基因和bnac04g36220d基因的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明mee45基因和bnac04g36220d基因的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码的蛋白与seqidno.2或seqidno.4所示的蛋白功能等价，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明seqidno.1、seqidno.3和seqidno.5所示的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。氨基酸或核苷酸序列的等同率可采用blast算法测定(altschuletal.1990.journalofmolecularbiology215:403-410；karlinandaltschul.1993.proceedingsofthenationalacademyofsciences90:5873-5877)。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

在本发明的一个实施方案中，是从拟南芥col生态型受精后三天的角果基因组中扩增获得该基因，其具体步骤如下：

(1)ctab法提取拟南芥果实基因组；

(2)mee45基因的克隆

以基因组dna为模板，采用以下引物对进行pcr扩增：

上游引物:5'-taggatccatggcgcatcaacatttcttct-3'，如seqidno.5所示；

下游引物:5'-taggtacctcatttgatttctagcttcacctt-3'，如seqidno.6所示；

其中划横线部分为bamhⅰ和kpnⅰ酶切位点；

pcr扩增体系为4μl上游引物(50pmol/μl)，4μl下游引物(50pmol/μl)，10μl10×pcrbuffer，4μldntp混合液(10mmol/l)，4μlevodna聚合酶(5u)，2μlcdna模板，加ddh2o将总体积补充至50μl；

扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸1min，循环32次；72℃延伸7min。

取4μlpcr产物与peasy-bluntsimplevector载体连接，操作步骤按照transgenbiotech公司产品peasy-bluntsimplevector说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(100mg/l)的lb固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落，在含有氨苄青霉素(100mg/l)的lb液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒dna，酶切鉴定后进行序列测定。扩增产物经测序分析，其序列如seqidno.1所示，表明扩增产物为mee45基因。

现有技术中也有该基因家族其他成员的研究，但是其主要侧重于该类基因在植物体细胞胚胎的发生的研究，并未发现其具有与本发明类似的功能，发明人认为这与本发明的基因与现有基因功能具有较大的不同有关。

获得上述的目标基因后，发明人利用其构建了植物表达载体pmee45:：mee45-gfp，该载体为利用限制性内切酶bamhⅰ和kpnⅰ酶切扩增得到的mee45基因dna片段，并将其连接在prok2空表达载体获得；发明人进一步利用获得的该载体转化农杆菌。

最后发明人利用农杆菌介导转化拟南芥花序，并最终筛选获得了具有抗性的植株，并最终验证发现该植株具有叶器官变大、种子变大(图3所示)和油脂含量增高(图3所示)等表型。将该基因应用于生产，改良种子的大小、千粒重和油脂含量等重要农艺性状，用于提高作物的产量和品质，具有重要的经济价值和社会效益。

在本发明的另一实施方案中，研究了mee45突变体和mee45过表达的细胞学基础，具体步骤如下：

(1)利用透明剂将植物组织透明后观察照相对mee45突变体、mee45过表达和野生型授粉前的胚珠、授粉后的胚胎发生过程进行详细对比研究(图4所示)，研究发现mee45突变体胚珠及胚胎变小，种子变小；相反过表达植株pmee45::mee45胚珠及胚胎变大，种子变大。

(2)将mee45突变体与野生型植株进行父母本的正反交实验，观察杂交后代的胚珠、胚和胚乳的表型，分析mee45是否通过母体组织或者合子组织调控种子大小发育(图5所示)，研究表明mee45是通过母系遗传控制种子大小的。

在本发明的又一实施方案中，研究了mee45基因的表达模式和蛋白的亚细胞定位，具体如下：

构建pmee45::mee45-gfp融合表达载体并转化植株，对mee45蛋白的表达模式进行分析(图6所示)，研究表明mee45在胚珠及胚胎中都表达，定位模式为核定位。

在本发明的又一实施方案中，对mee45基因调控油脂含量进行了研究，具体如下：

发明人测了野生型col、突变体mee45和过表达35s::mee45种子中总油脂的含量，发现突变体中油脂的含量相比野生型有所减少，而过表达里油脂的含量有所上升(图7所示)。

在本发明的又一实施方案中，对mee45的甘蓝型油菜同源基因bnac04g36220d进行了研究，具体如下：

通过进化树分析和同源性比较，找到了甘蓝型油菜中与mee45亲缘关系较近的同源性达56％基因bnac04g36220d，将该基因克隆出来转拟南芥mee45突变体和野生型，观察是否影响种子大小的发育(图8所示)，研究发现过表达bnac04g36220d基因转拟南芥mee45突变体，能够恢复mee45种子变小的表型；过表达bnac04g36220d基因转拟南芥野生型，转基因植株种子变大。我们也正在转化该基因过表达的甘蓝型油菜，在得到转基因植株后观察种子的大小和品质的变化。其核苷酸序列如sedidno.3所示，该基因全长为1530bp，氨基酸序列如sedidno.4所示，编码510个氨基酸。

该基因从甘蓝型油菜10天的小苗幼叶cdna中扩增获得，其具体步骤如下：

1.油菜rna的提取和纯化

2.cdna第一链的合成

3.bnac04g36220d基因的克隆

以cdna为模板，采用以下引物对进行pcr扩增：

上游引物:5'-taggatccatggtgaacaaacgtttcttcaagc-3'，如seqidno.7所示；

下游引物:5'-tagagctctcattcggtctcatgctttacctt-3'，如seqidno.8所示；

其中划横线部分为bamhⅰ和sacⅰ酶切位点；

pcr扩增体系为4μl上游引物(50pmol/μl)，4μl下游引物(50pmol/μl)，10μl10×pcrbuffer，4μldntp混合液(10mmol/l)，4μlevodna聚合酶(5u)，2μlcdna模板，加ddh2o将总体积补充至50μl；

扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸1min，循环32次；72℃延伸7min。

取4μlpcr产物与peasy-bluntsimplevector载体连接，操作步骤按照transgenbiotech公司产品peasy-bluntsimplevector说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(100mg/l)的lb固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落，在含有氨苄青霉素(100mg/l)的lb液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒dna，酶切鉴定后进行序列测定。扩增产物经测序分析，其序列如seqidno.3所示，表明扩增产物为bnac04g36220d基因。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1、mee45和bnac04g36220d基因克隆及植物表达载体构建

1.1拟南芥rna的提取和纯化

鲜的拟南芥幼嫩角果在液氮中研磨，迅速将研磨好的样品移入15mlctab提取液中(2％(w/v)ctab，2％(w/v)pvp，100mmtris-hcl(ph8.0)，25mmedta，2.0mnacl，2％(w/v)β-巯基乙醇，0.5g/l亚精胺)，立即涡旋震荡30s，65℃水浴片刻，加与ctab提取液等体积的氯仿：异戊醇的混合物，其中氯仿：异戊醇的体积比为24:1，振荡混匀；室温下10000rpm离心15分钟，转移上清液到另一干净管中，加入与上清液等体积的氯仿：异戊醇混合物(体积比24:1)混匀静置，重复抽提一次，室温下10000rpm离心15分钟，转移水相到另一离心管中。根据溶液体积加入8mlicl，使licl终浓度为2m，4℃过夜沉淀(最多16小时)。4℃离心20分钟，去掉上清液，用500μl70％乙醇漂洗沉淀，用500μlsste液(1.0mnacl，0.5％(w/v)sds，10mmtris-hcl(ph8.0)，1mmedta(ph8.0))溶解沉淀，将溶液转移到1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇混合物(体积比24:1)，再抽提一次。上清液中加入2倍体积的乙醇，-70℃沉淀30分钟或-20℃沉淀2小时，4℃12000rpm离心20分钟，沉淀dna，先用400μl70％乙醇漂洗沉淀，再加入400μl100％乙醇漂洗沉淀，干燥沉淀后，用50μldepcddh2o溶解沉淀。

为确保rna质量达到测序要求，分别使用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测纯化后的rna样品纯度和浓度，其中纯度和浓度标准为：rna纯度为od260/280和od260/230均在1.8-2.0范围内，rna浓度在1.0-2.0μg/μl范围内。

1.2cdna第一链的合成

在0.2mldepc处理的离心管中顺序加入1μl50μmoligodtprimer和15.5μl总rna，70℃变性6分钟，迅速冰浴10分钟。在上述离心管中顺序加入2μldntpmixture(10mm)，5μl5×primerscriptbuffer，0.5μlrnaseinhibitor(40u)，1μlprimerscriptrtase(200u)，加depc-h2o至25μl。在pcr仪上运行程序为25℃，10分钟；42℃，90分钟；95℃，5分钟。程序结束后，样品于-80℃冻存待用。

1.3mee45和bnac04g36220d基因的克隆

以反转录的cdna为模板，采用以下引物对进行pcr扩增：

mee45以基因组为模板，采用以下引物对进行pcr扩增：

上游引物:5'-taggatccatggcgcatcaacatttcttct-3'，如seqidno.5所示；

下游引物:5'-taggtacctcatttgatttctagcttcacctt-3'，如seqidno.6所示；

其中划横线部分为bamhⅰ和kpnⅰ酶切位点；

pcr扩增体系为4μl上游引物(50pmol/μl)，4μl下游引物(50pmol/μl)，10μl10×pcrbuffer，4μldntp混合液(10mmol/l)，4μlevodna聚合酶(5u)，2μlcdna模板，加ddh2o将总体积补充至50μl；

扩增条件为：94℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸1min，循环32次；72℃延伸7min。

取4μlpcr产物与peasy-bluntsimplevector载体连接，操作步骤按照transgenbiotech公司产品peasy-bluntsimplevector说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(100mg/l)的lb固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落，在含有氨苄青霉素(100mg/l)的lb液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒dna，酶切鉴定后进行序列测定。扩增产物经测序分析，其序列如seqidno.1所示，表明扩增产物为mee45基因。

甘蓝型油菜基因以cdna为模板，采用以下引物对进行pcr扩增：

上游引物:5'-taggatccatggtgaacaaacgtttcttcaagc-3'，如seqidno.7所示；

下游引物:5'-tagagctctcattcggtctcatgctttacctt-3',如seqidno.8所示；

其中划横线部分为bamhⅰ和sacⅰ酶切位点；

pcr扩增体系为4μl上游引物(50pmol/μl)，4μl下游引物(50pmol/μl)，10μl10×pcrbuffer，4μldntp混合液(10mmol/l)，4μlevodna聚合酶(5u)，2μlcdna模板，加ddh2o将总体积补充至50μl；

扩增条件为：95℃变性3min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸1min，循环32次；72℃延伸7min。

取4μlpcr产物与peasy-bluntsimplevector载体连接，操作步骤按照transgenbiotech公司产品peasy-bluntsimplevector说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(100mg/l)的lb固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落，在含有氨苄青霉素(100mg/l)的lb液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒dna，酶切鉴定后进行序列测定。扩增产物经测序分析，其序列如seqidno.3所示，表明扩增产物为bnac04g36220d基因。

1.4植物表达载体pmee45::mee45-gfp和35s::bnac04g36220d基因的获得

用限制性内切酶bamhi和kpni切mee45dna片段。用限制性内切酶bamhi和kpni切prokⅱ空表达载体，二者均通过电泳检测并回收目的片段。利用t4连接酶连接酶切后的片段，操作步骤按照fermentas公司产品t4dnaligase说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，在含有卡那霉素(50mg/l)的lb固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落，在含有壮观霉素(50mg/l)的lb液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒dna并进行酶切鉴定。将酶切鉴定正确的表达载体pmee45::mee45-gfp转化农杆菌gv3101并获得可供转化使用的农杆菌菌株。本发明采用的是电击法转化农杆菌。

用限制性内切酶bamhi和saci切bnac04g36220ddna片段。用限制性内切酶bamhi和saci切prokⅱ空表达载体，二者均通过电泳检测并回收目的片段。利用t4连接酶连接酶切后的片段，操作步骤按照fermentas公司产品t4dnaligase说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，在含有卡那霉素(50mg/l)的lb固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落，在含有壮观霉素(50mg/l)的lb液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒dna并进行酶切鉴定。将酶切鉴定正确的表达载体35s::bnac04g36220d转化农杆菌gv3101并获得可供转化使用的农杆菌菌株。

实施例2、农杆菌介导的拟南芥花序的转化及抗性植株的获得

浸染前一天挑取农杆菌(携带重组质粒的农杆菌单菌落)接种于含有50mg/l卡那霉素的yep培养基中，28℃，220rpm摇菌过夜，第二天一早沉淀并用预浸染培养基中重悬。然后浸染正在开花的拟南芥花序组织，花序组织在浸染液中浸染15s，然后暗培养24h，接着16h光照8h黑暗培养生长到拟南芥花序生长到拟南芥角果成熟，最后收了所有种子，用于筛选阳性植株。因为prokⅱ空载体带有的植株抗性为卡那抗性，所以用含有卡那抗性的gm培养基筛选种子，能够活下来的有可能为阳性植株，为了严谨起见，可以从基因上设计一端引物，从载体骨架上设计另一端引物，用这一对嵌套引物筛选基因组，能够显示出正确条带的是阳性植株。

pmee45::mee45-gfp和35s::bnac04g36220d阳性植株的嵌套引物序列如下：

mee45上游引物：5'-taggatccatggcgcatcaacatttcttct-3'，如seqidno.9所示；

bnac04g36220d上游引物：5'-taggatccatggtgaacaaacgtttcttcaagc-3'，如seqidno.10所示；

下游引物序列：5'-caagagtccactattaaagaacgtgg-3'，如seqidno.11所示；(两个基因可共用)。

实施例3、突变体及阳性转基因植株的表型分析

测量突变体及阳性转基因植株和野生型植株成熟的种子大小，统计千粒重和长宽(图3)；并观察胚珠和种子发育过程及测量种子中油脂的含量。由图3可以看出，mee45突变体种子相比野生型种子变小，千粒重减小；相反过表达植株pmee45::mee45-gfp种子变大，千粒重增大。由图4可以看出，mee45突变体胚珠和胚均变小，油脂含量降低；相反过表达pmee45::mee45-gfp植株的胚珠和胚均变大。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

sequencelisting

<110>山东农业大学

<120>一种用于改良种子大小和品质的基因的获得方法和应用

<130>2018

<160>11

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1587

<212>dna

<213>mee45基因

<400>1

atggcgcatcaacatttcttcaagcctcttcttcctggcttccacgcctccttgacaatt60

cctgtagccttcttcttgaagtatatagaaggaagatatgagcagaagacggcgaagctg120

agatcagacgcgtcaaagagaacttgggaagtgaagatagatggccagagactcaccgac180

ggttggaaagagtttgctgtctcacatgatcttcgaatcggtgacattgttgttttcaga240

caagagagtgacttggctttccatgtaacactgttgggacctagttgttgtgggattcaa300

tatggttcgtgttcagtcgaaaagaacaacctcggtgacgagaaaaagaaagtgaaggag360

aatccaaatggagaagcagagtcttcttcacgagatccctcttgttttgtggctaatgtt420

gcgccttcgagtctacgttatgacttgatgagatttccaaggggttttgtgagggataat480

ggtgtagtcggatctggagagattgttctgatgaatgaaaagggcagatcatggaatttt540

aacttgagacaaaagccatcaaacggaacagtttatgttagaggagggtgggtgagtttt600

tgtgatgccaatgggcttaaagctggagataactacactttcaaactgatcaaaagagca660

ggaactcttgttctacgtttgttacccaatgagccaaaagaggaagctaatgaagtgtct720

cttcccgaagaaccggaaagcgatgcagagcgcaaccttgaaaagattcaaaggaaggag780

aaagtgaagaagaatgtaacaagagaggcagagtcttcttcacaagatccctcttgtttt840

gtggctaatgtctccccttcgagtctacgctatgacacactgtatcttccaaagcgtttt900

atgagggaaaatggtgtagacaaaagatgtggagagatgattctgattaatgaaaaggga960

aaatcatggactttagatttgaaagtaaagaaatcatccggaacttctctcatcaaacga1020

ggatggagaagtttctgtagtgccaatggactaagagctggaagtatcataactctcaaa1080

ctgataaagaaaagagcaactcttgttctacgtttgatccccaacgagccagaagaagct1140

aatgaagtagtctctctttcgacagagcaagaaagcgatgaagagagtatccacgacgag1200

aaaatctcaagaagaaagtctttactatccgaaaaccgatttgtgacattaactctaaca1260

ccttatacaatccaaagttctctactgaatgagaatcttttgtgtgaatctatgtttcag1320

cgtcttccggttcctttcacgaggatgaatggtatcaatgaagaaactaaaatgactctg1380

ttggataaacatggtgtgaagtggttaacgactctgcggttcgaggacgacaaaagaaaa1440

agactacgaatggtaggaggatggcaaggattcatccaagctaacgatgtgaaggcaaac1500

gaatccatcatgttggaactgatttgggaagaagaaacaagttgcgtccttaagttctgc1560

tccaaggtgaagctagaaatcaaatga1587

<210>2

<211>528

<212>prt

<213>mee45基因编码蛋白

<400>2

metalahisglnhisphephelysproleuleuproglyphehisala

151015

serleuthrileprovalalaphepheleulystyrilegluglyarg

202530

tyrgluglnlysthralalysleuargseraspalaserlysargthr

354045

trpgluvallysileaspglyglnargleuthraspglytrplysglu

505560

phealavalserhisaspleuargileglyaspilevalvalphearg

65707580

glngluseraspleualaphehisvalthrleuleuglyprosercys

859095

cysglyileglntyrglysercysservalglulysasnasnleugly

100105110

aspglulyslyslysvallysgluasnproasnglyglualagluser

115120125

serserargaspprosercysphevalalaasnvalalaproserser

130135140

leuargtyraspleumetargpheproargglyphevalargaspasn

145150155160

glyvalvalglyserglygluilevalleumetasnglulysglyarg

165170175

sertrpasnpheasnleuargglnlysproserasnglythrvaltyr

180185190

valargglyglytrpvalserphecysaspalaasnglyleulysala

195200205

glyaspasntyrthrphelysleuilelysargalaglythrleuval

210215220

leuargleuleuproasngluprolysgluglualaasngluvalser

225230235240

leuproglugluprogluseraspalagluargasnleuglulysile

245250255

glnarglysglulysvallyslysasnvalthrargglualagluser

260265270

serserglnaspprosercysphevalalaasnvalserproserser

275280285

leuargtyraspthrleutyrleuprolysargphemetarggluasn

290295300

glyvalasplysargcysglyglumetileleuileasnglulysgly

305310315320

lyssertrpthrleuaspleulysvallyslysserserglythrser

325330335

leuilelysargglytrpargserphecysseralaasnglyleuarg

340345350

alaglyserileilethrleulysleuilelyslysargalathrleu

355360365

valleuargleuileproasngluprogluglualaasngluvalval

370375380

serleuserthrgluglngluseraspglugluserilehisaspglu

385390395400

lysileserargarglysserleuleusergluasnargphevalthr

405410415

leuthrleuthrprotyrthrileglnserserleuleuasngluasn

420425430

leuleucysglusermetpheglnargleuprovalprophethrarg

435440445

metasnglyileasnglugluthrlysmetthrleuleuasplyshis

450455460

glyvallystrpleuthrthrleuargphegluaspasplysarglys

465470475480

argleuargmetvalglyglytrpglnglypheileglnalaasnasp

485490495

vallysalaasngluserilemetleugluleuiletrpglugluglu

500505510

thrsercysvalleulysphecysserlysvallysleugluilelys

515520525

<210>3

<211>1530

<212>dna

<213>bnac04g36220d基因

<400>3

atggtgaacaaacgtttcttcaagcctcttcttcctggcttccacagccacttgacaatt60

cctgtagccttcttcgtcaagtatatagaaggaaaaaacgagcaccatacgacgaagcta120

agatcagacgcgtcaaagataacctgggaagtgaaaatagaagatggccagaaactcact180

gacggttggaaagagttcgctcttgcacacgatcttcgtatcggcgacattctcattttc240

aagcaagagaaagacatggctttccacgtaacactcttgggacccagtggctgtgagatt300

caatatgagtcgtgttcagaagaagagaacaacttcgggaatattccaaagaagaagaat360

tcaaaaagagaagcagagtcttcttcactagatccttcttgtttcttggctaatatctgg420

ccttcgtccttacgctatgactcattgaaccttccaaggagttttgtgagggcaaatggt480

ctagagacaagatgtggaagagagatcgttctgatcaatgaaaagggtaaatcatggact540

ttggctttaaaacaaaagctatctggacctacttacatcagacgagggtggagaagtttc600

tgtattgccaatggtcttaaaactggaggcgtctacactttcaaactaatcaagagaggg660

agagctccggttcttcgtttgtcctccacagagtcagagttagaagagagaaacatcgag720

aagattcagaggaacaaagcagagtcttcctcactaaatccctcttgttttgtggctaat780

atctcgcgtgcaaccctacgttatgacacactgggtcttccaatgaaattttcaagggaa840

aatggtctagaggcaagatgtggagagattgttctaatgaatgaaaagggtagatcgtgg900

aagctaaatctgaaacgaaagagatcatgcggaactatgtatatcacacaagggtggagg960

agtttctgtagtgcaaatggacttagagctggaagttcttccactttcaaactgatcaaa1020

agaggaggaactctggctctacgtttgtcatctaaagagactgaagaagaagaagaagat1080

tgctcattaaaagctaatgaagtggagtctctttccacagaaccagaaagcgatgaagag1140

gggagccaagatgagaaacaaatcaagaagcatagatcgacatggaaagcttcatcttca1200

caatcccaaaaccgatttgtgacacttacttttagacctttcaatcttgaaaagtattta1260

ctgtttcttcctttacgcttcaccaggtggcacggcatcaatgaagaaactaaaatgaga1320

ctgttggacaaaaacggtgtcaagtggtctacggatctgcggtctgggaaaactaatatt1380

gataaaataagattggtaggaggttggcaagaattcttcaaagctaactgtgtgaagcca1440

ggtgaatctatcattgtgaagctgatatgggatggagacaaaagttgtatcctcaagttc1500

tgctctaaggtaaagcatgagaccgaatga1530

<210>4

<211>509

<212>prt

<213>bnac04g36220d基因编码蛋白

<400>4

metvalasnlysargphephelysproleuleuproglyphehisser

151015

hisleuthrileprovalalaphephevallystyrilegluglylys

202530

asngluhishisthrthrlysleuargseraspalaserlysilethr

354045

trpgluvallysilegluaspglyglnlysleuthraspglytrplys

505560

gluphealaleualahisaspleuargileglyaspileleuilephe

65707580

lysglnglulysaspmetalaphehisvalthrleuleuglyproser

859095

glycysgluileglntyrglusercyssergluglugluasnasnphe

100105110

glyasnileprolyslyslysasnserlysargglualagluserser

115120125

serleuaspprosercyspheleualaasniletrpproserserleu

130135140

argtyraspserleuasnleuproargserphevalargalaasngly

145150155160

leugluthrargcysglyarggluilevalleuileasnglulysgly

165170175

lyssertrpthrleualaleulysglnlysleuserglyprothrtyr

180185190

ileargargglytrpargserphecysilealaasnglyleulysthr

195200205

glyglyvaltyrthrphelysleuilelysargglyargalaproval

210215220

leuargleuserserthrglusergluleuglugluargasnileglu

225230235240

lysileglnargasnlysalagluserserserleuasnprosercys

245250255

phevalalaasnileserargalathrleuargtyraspthrleugly

260265270

leuprometlyspheserarggluasnglyleuglualaargcysgly

275280285

gluilevalleumetasnglulysglyargsertrplysleuasnleu

290295300

lysarglysargsercysglythrmettyrilethrglnglytrparg

305310315320

serphecysseralaasnglyleuargalaglyserserserthrphe

325330335

lysleuilelysargglyglythrleualaleuargleuserserlys

340345350

gluthrgluglugluglugluaspcysserleulysalaasngluval

355360365

gluserleuserthrgluprogluseraspglugluglyserglnasp

370375380

glulysglnilelyslyshisargserthrtrplysalaserserser

385390395400

glnserglnasnargphevalthrleuthrpheargpropheasnleu

405410415

glulystyrleuleupheleuproleuargphethrargtrphisgly

420425430

ileasnglugluthrlysmetargleuleuasplysasnglyvallys

435440445

trpserthraspleuargserglylysthrasnileasplysilearg

450455460

leuvalglyglytrpglngluphephelysalaasncysvallyspro

465470475480

glygluserileilevallysleuiletrpaspglyasplyssercys

485490495

ileleulysphecysserlysvallyshisgluthrglu

500505

<210>5

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

taggatccatggcgcatcaacatttcttct30

<210>6

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

taggtacctcatttgatttctagcttcacctt32

<210>7

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

taggatccatggtgaacaaacgtttcttcaagc33

<210>8

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

tagagctctcattcggtctcatgctttacctt32

<210>9

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

taggatccatggcgcatcaacatttcttct30

<210>10

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

taggatccatggtgaacaaacgtttcttcaagc33

<210>11

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

caagagtccactattaaagaacgtgg26