一种烟草氯离子吸收基因NtSLAC2及其克隆方法与应用与流程

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草氯离子吸收基因ntslac2的克隆方法与应用。

背景技术：

氯离子含量是烟草中重要的质量参数，烟叶中的氯离子含量以0.3~0.8作为合适，如果烟叶中氯离子含量过高，会影响卷烟制品的燃烧性，会造成卷烟制品的阴燃，从而会使卷烟制品的烟气中具有更多的一氧化碳及焦油，这样会危害消费者的健康。并且当氯离子含量更高的时候，会直接造成熄火的现象。

目前我国在种植蔬菜和粮食作物的时候，会使用大量的化肥农药，现在的化肥中含量大量的氯离子，而这些含有氯离子的化肥在使用的过程中会造成耕作土壤中氯离子含量的超标。而土壤氯离子含量的超标会造成栽培作物过量的吸收氯离子从而造成作物体内的氯离子含量超标，这样会影响农作物的品质。

为解决烟叶氯离子含量偏高的问题，采用低氯含量化肥是最直接的手段，但是考虑到低氯含量化肥的生产成本要显著的高于高氯含量化肥，因此化肥生产厂家与农民考虑到成本的因素，往往不会使用低氯化肥而使用高氯离子含量的化肥。另外现在中国的耕作土壤中氯离子含量超标已经较为严重，即便现在开始使用低氯离子含量的化肥也不能很快的解决作物尤其是烟草中氯离子超标的问题。因此传统的农艺措施很难改变目前烟叶中氯离子超标的问题。

随着分子生物学技术的发展，采用分子手段去除烟草中特定的吸收氯离子的通道是解决这一问题的一种手段。目前的研究表明慢阴离子通道（slac）蛋白家族主要在植物阴离子（氯离子和硝酸根离子等）摄取和气孔开闭过程中起到重要作用。目前已有在本氏烟中通过瞬时转化的方法（vigs）来验证其基因家族中一个基因的功能。但因为slac基因是一个基因家族，会存在基因分化的可能，同时本氏烟中基因与栽培烟存在较大的差异，因此通过rnai干扰的手段在栽培烟草中直接验证栽培基因中内源slac基因功能是确定负责栽培烟草中氯离子吸收基因的关键。通过确定栽培烟草中氯离子吸收的关键基因是培育低氯离子含量烟草的基础，因此本发明具有较大的经济价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种烟草氯离子吸收基因ntslac2；第二目的在于提供所述的烟草氯离子吸收基因ntslac2的克隆方法；第三目的在于提供所述的烟草氯离子吸收基因ntslac2的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草氯离子吸收基因ntslac2的核苷酸序列如序列表seqidno：1所示。

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

a、烟草叶片cdna合成：提取烟草rna，反转录得到第一链cdna；

b、ntslac2基因的pcr扩增：以反转录得到的第一链cdna作为模板，根据ntslac2基因序列设计合成特异性引物，进行pcr扩增，回收和纯化pcr扩增产物，并测序。

本发明的第三目的是这样实现的，所述的烟草氯离子吸收基因ntslac2在获得低氯转基因植株中的应用。

本发明所述烟草氯离子吸收基因ntslac2包含的核苷酸序列如seqid：no.1所示。或者在高严谨条件下可与序列表中seqidno：1限定的dna序列杂交的核苷酸序列；或者与序列表中seqidno：1限定的dna序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna序列。

本发明所述烟草氯离子吸收基因ntslac2的应用为在烟草植株体内抑制所述ntslac2基因的表达，可降低烟草中氯离子的含量。可通过由rna介导的多种方法抑制ntslac2基因的表达，如：植物病毒载体介导基因沉默的方法、农杆菌介导转化rnai干扰载体、优化修改基因编码区、优化基因启动子等方法。本发明所述的抑制基因表达的方法并不限于上述几种方法，只要能抑制ntslac2表达即可。

携带有本发明ntslac2基因的rnai载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。

本发明的烟草氯离子吸收蛋白及其编码基因为农作物尤其是烟草低氯离子含量品种育种提供基因与技术的支持。

本发明中，在烟草植株内抑制烟草内源基因ntslac2的表达，会使烟草烟叶的氯离子含量明显降低，在植物低氯离子含量育种领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。

附图说明

图1为ntslac2基因的pcr产物电泳图；

其中，m-分子量标记；1-pcr产物；

图2为中间载体pdonr-zeo图；

图3为ntslac2基因植物rnai干扰载体phellsgate12图；

图4为转ntslac2基因rnai干扰载体的烟草株系基因表达水平柱状图；

图5为ntslac2基因rnai干扰烟草植株的氯离子含量示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的烟草氯离子吸收基因ntslac2的核苷酸序列如seqidno：1所示。

所述的烟草氯离子吸收基因ntslac2编码的氨基酸序列如seqidno：2所示。

本发明所述的烟草氯离子吸收基因ntslac2的克隆方法，包括以下步骤：

a、烟草叶片cdna合成：提取烟草rna，反转录得到第一链cdna；

b、ntslac2基因的pcr扩增：以反转录得到的第一链cdna作为模板，根据ntslac2基因序列设计合成特异性引物，进行pcr扩增，回收和纯化pcr扩增产物，并测序。

c步骤中所述的特异性引物为：

正向引物：5’-atgagaatcactcctgcattagatg-3’；

反向引物：5’-tcaaataattcgagaagactgtttg-3’；

所述的pcr扩增的反应体系和反应条件如下：

。

本发明所述的烟草氯离子吸收基因ntslac2的应用为所述的烟草氯离子吸收基因ntslac2在获得低氯转基因植株中的应用。

下面以具体实施案例对本发明进行进一步说明：

实施例1

克隆ntslac2基因

以烟草叶片cdna为模板，根据烟草基因组数据库信息设计引物，进行ntslac2基因的pcr扩增，得到pcr扩增产物，设计引物如下所示：

正向引物：5’-atgagaatcactcctgcattagatg-3’；

反向引物：5’-tcaaataattcgagaagactgtttg-3’；

pcr反应体系和扩增条件如下所示：

将扩增获得的pcr产物在0.8%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳结果如图1所示，电泳结束后，采用qiagen公司pcr产物纯化试剂盒，按照产品说明回收纯化所述的pcr产物，并送invitrogen测序，验证序列结果。

实施例2

植物rnai载体的构建

以实施例1中ntslac2全长片段为模板，用含有gateway接头序列的引物进行pcr扩增，扩增产物经pcr产物纯化后，经过bp反应插入到invitrogen公司pdonr-zeo载体（见图2）中，将构建好的bp反应载体通过lr反应将ntslac2片段置换到phellsgate12rnai干扰载体（见图3）中。

（1）gateway反应引物序列如下：

ntslac2_f

5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgctttactaaggggaagagacttttaaca-3’；

ntslac2_r

5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtccctgataatctctgatataacgtcacaa-3’。

（2）pcr反应均采用phusion高保真聚合酶进行pcr克隆。

pcr反应体系与条件与实施例1相同。

（3）bp反应：

（a）在200μl离心管中准备8μl的反应体系，包括：1-7μl的attb-pcr产物（约15~150ng，质量浓度≥10ng/μl）、1μl150ng/μl的pdonr-zeo载体和适量的te缓冲液（ph8.0），在室温下混匀；

（b）将bpclonase™ii酶混合物在冰上静置2min融化，轻轻震荡2次，混匀待用；

（c）向（1）准备的样品中加入2μl的bpclonase™ii酶混合物，轻轻地将体系混匀；

（d）将bpclonase™ii酶混合物放回到-20°c或者-80°c保存；

（e）将反应体系放在25°c温浴1h；

（f）向反应体系中加入1μl的蛋白酶k溶液，轻轻震荡，然后将样品放在37°c温浴10min，以便终止bp反应；

（g）将混合液转化大肠杆菌后，取转化菌液涂在含zeacin抗性的lb平板上，挑取菌落至含相应抗生素培养基溶液中摇菌培养，确认后提取阳性克隆的pdonr-zeocin质粒（图2）备用。

（4）lr反应：

（a）在200μl离心管中准备8μl的反应物，包括：1-7μl的获得的pdonr-zeocin质粒（50-150ng）、1μl150ng/μl的目的载体和适量的te缓冲液（ph8.0），在室温下混匀；

（b）将lrclonase™ii酶混合物静置在冰上2min融化，轻轻震荡2次以上混匀；

（c）加入2μl的lrclonase™ii酶混合物，轻轻震荡将体系混匀；

（d）将lrclonase™ii酶混合物放回到-20℃或者-80℃冰箱保存；

（e）将反应体系于25℃温浴反应1h；

（f）向反应体系中加入1μl的蛋白酶k溶液以终止lr反应，轻轻震荡后，将样品于37℃静置10min；

（g）将混合液转化大肠杆菌后，取转化菌液涂在含zeacin抗性的lb平板上，挑取菌落至含相应抗生素培养基溶液中摇菌培养，确认后提取阳性克隆phellsgate12rnai质粒备用。

实施例3

农杆菌介导的烟草转化及转基因植株的鉴定

（1）冻融法转化农杆菌

将1μg（200ng/μl）phellsgate12rnai重组载体加入到100μl感受态农杆菌lba4404中，混匀后在冰水上静置5min，放入液氮中冷冻5min，然后从液氮中取出，放入37℃水浴锅中水浴5min，再在冰上静置5min后，加入500μllb溶液，在28℃、充分震荡条件下恢复培养4h，最后将菌液均匀涂抹于选择性平板培养基上，28℃下培养48h。

(2)叶盘法转化烟草品种云烟87。

具体方法如下:

(a)无菌条件下，将烟草云烟87种子放入ep管中用无菌水冲洗2-3次；

(b)于75%的酒精中浸泡30-60s；

(c)再用0.1%的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次；

(d)播种于ms培养基上，培养在云南烟草农业科学研究院组织培养室中，暗培养4d,25℃光照培养20-30d。

(e)待烟草苗长至3-5cm时（20-30d），取顶芽放于ms+ba0.2mg/l（壮芽，使其快速成长）培养基上，继代培养。

(f)继代培养14天后（有小叶片即可），取叶片，大小1cm×1cm，切去叶柄，叶片表面及叶边缘划伤，放入ms+ba1.0mg/lph6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3d。

(g)然后取出预培养的叶片或茎段，放入农杆菌侵染液中进行侵染。侵染前一天晚上，摇菌农杆菌2瓶。将2ml离心管装满菌液，4000r/min离心5min，用悬菌液清洗两次。以1:10比例（10ml悬菌液放1管1.5ml菌体）放入悬菌液，加入as25mg/l（40ml中加40μlas）不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液。

其中，农杆菌侵染液的制备方法如下：

1)取-80℃冰箱保存的已被转化的农杆菌，划平板培养，lb固体平板中加入50mg/lspec和50mg/lrif；

2)挑取单菌斑到含50mg/lspec和50mg/lrif的5mllb液体培养基中，放入摇床中28℃、200r/min培养过夜（12-16h）；

3)保存菌种，750μl菌液加入灭过菌的甘油250μl，-80℃冰箱保存备用；

4)摇菌，lb液体培养基10ml加spec（所需浓度50mg/l）10μl、rif（所需浓度50mg/l）10μl及菌液10μl，28℃、200r/min过夜培养（12-16h）；

5)当菌液浓度达到od600=1.5左右时，取2ml菌液加入到离心管中，4000r/min离心5min；

6)倒掉上清液，吸1ml新的ms液体培养基，重悬农杆菌，4000r/min离心5min。

7)重复步骤（6）1次；

8)用1ml的ms液体培养基重悬菌后，再加入到40ml的ms的液体培养基中（含40ul25mg/l的as），即为侵染液。放置2h以上，再侵染。

200ml悬菌液的配制如下：

20×大量元素10ml

200×有机元素1ml

200×铁盐1ml

200×微量元素1ml

蔗糖5.6g

(h)将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切口周围有微菌斑形成；

(i)洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500mg/lcef的无菌水冲洗5次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆菌；

(j)取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为ms+ba1.0mg/l+nptii25mg/l+cef500mg/lph5.8；过2周观察，如果发现不长菌，则降低cef浓度。如果长菌，则继续保持cef浓度。

(k)每2周更换1次培养基，直至长出不定芽（一般情况为2周）。切下再生的小苗（1cm左右），转入继代培养基ms+ba0.2-0.1mg/l+nptii25mg/l+cef500mg/lph5.8；

(l)至小苗长至2cm长时（有小芽即可），转接入生根培养基ms+naa0.2-0.1mg/l上，24士1℃、12h光照、1500lx培养3周左右,长出粗壮根系。

(m)待根生长至2-3cm。苗高7-10cm左右时，移出三角瓶洗去根部培养基，移栽于花盆中，温室培养。

（3）得到稳定的转基因株系

采用qiagen公司dna提取试剂盒，提取转基因烟草幼苗的基因组dna，设计nptii抗性基因引物进行pcr扩增，筛选阳性植株,检测到25株阳性植株。

nptii抗性基因引物为

kanf：tctggacgaagagcatcagg

kanr：atgaatccagaaaagcggcc

按照实例2中所述方法提取野生型植株和25株转ntslac2的rna基因t0代植株的总rna，进行realtime-pcr分析，内参基因为26s，分析不同株系的表达情况。选取表达量最低的6株植株（图4），单株收取种子分别播种。

ntslac2qrt-pcr引物

ntslac2_qrt_f：5’-aggtccagtctgttgtgagg-3’；

ntslac2_qrt_r：5’-tttgccttaacccgttgagc-3’。

26s内参基因引物

26s_f：5’-gaagaaggtcccaagggttc-3’；

26s_r：5’-tctccctttaacaccaacgg-3’。

实施例4

测定烟叶中氯离子含量

用5%乙酸水溶液萃取烟草样品中的氯，氯与硫氰酸汞反应，释放出硫氰酸根进而与三价铁反应形成络合物，反应产物在460nm或480nm比色测定。

主要仪器设备

a)连续流动分析仪.(美国api)(德国sealaa3)(法国alliance)；

实验器皿：

——水平振荡摇床；

——天平，感量0.0001g；

——150ml三角瓶或塑料瓶；

——橡胶塞子；

——滤纸。

试剂(备注：以下所有水均为实验室制备的蒸馏水或超纯水)

美国api、德国sealaa3

a)brij35溶液（聚乙氧基月桂醚）

1l水中加5滴22%brij35，搅拌均匀；

显色剂

——硫氰酸汞储备液

称取硫氰酸汞[hg（scn）2]2.1g于烧杯中，加入甲醇溶解，转入500ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度；

——硝酸铁储备液

称取硝酸铁[fe（no3）3•9h2o]101.0g于烧杯中，加入15.8ml硝酸（hno3），用水溶解，转入500ml容量瓶中，用水定容至刻度；

——显色剂

各取硫氰酸汞储备液和硝酸铁储备液240ml于1000ml容量瓶中，用水定容至刻度，加入1mlbrij35；

——稀释水

取1000ml水，加入1mlbrij35。

法国alliance

活化水（brij35）；

显色试剂

在一只一升的烧瓶中，将520mghg(scn)2溶于200ml甲醇，加入600ml蒸馏水，摇匀。加入63mlhno3，摇匀。加40gfe(no3)3.9h20并使之溶解，以纯水稀释到1000ml。

分析步骤

a)称取0.3g烟样于150ml三角瓶或塑料瓶中（精确至0.0001g）；

加入50ml乙酸（5%）溶液盖上塞子；

在振荡器上振荡萃取30min；用滤纸过滤上机。（如样品液浓度超出工作标准液的浓度范围，则应稀释）。

结果的计算与表述

a)氯含量的计算

以干基计的氯含量，由式（1）得出：

式中：

c——样品液总植物碱的仪器观测值，单位为毫克（mg/ml）；

v——萃取液的体积，单位为毫升（ml）；

m——试料的质量，单位为毫克（mg）；

w——试样的水分含量。

结果的表述

以两次测定的平均值作为测定结果，结果精确至0.01%。

烟草中氯离子测定结果表明，slah2基因被干扰掉的转基因株系的氯离子含量也非转基因材料相比表现出氯离子降低的表型。氯离子降低从15%-60%左右。因此该基因在烟草中具备吸收氯离子的功能。

sequencelisting

<110>云南省烟草农业科学研究院

<120>一种烟草氯离子吸收基因ntslac2及其克隆方法与应用

<130>2018

<160>12

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1263

<212>dna

<213>基因ntslac2核苷酸序列

<400>1

atgagaatcactcctgcattagatgattttcacacacctaatacagagacgaaaaatcaa60

aacactataataccagataccaatattatgatcgagttgcctcgatcttcctcttctgga120

aagcgagaagacatgatcgagttgcctcgatcttcctcttcaggaaagcaagaagaccat180

gactatggtcttctcgctttcattggactaagattcatgttatccttaatgctaaaaagg240

atacatgcaggctatttcagaataagcctatctttatgttgggaaactttattatggaaa300

acactacttgacccaacaaataatgaaacaaaattcttacatcacgtgcctcaaatgatc360

tatcgtcccgttctaattttcctatggtcatttgcactattggttctagtttttctttct420

ttactctacctcttgaagtgcttctttcgatttaatttggttaagggagagttcttgcac480

cacgttggagtcaattacctttttgccccttggatttcttggcttatattacttgaatcc540

cacccttttatagcaccaaaacacgttggttttaaagctctttggtgggtttttgcagtt600

ccggtcatagttttggatgtgaaaatttatggacaatggtttactaaggggaagagactt660

ttaacagccgcggctaatccgaccagcaatttatcggtcattgggaacttagtcggggct720

cgagccgcggctaaaatgggctggcaagaggtttctgtttgcttattttcattggggatg780

gttcattatttggtgctttttgtgacgttatatcagagattatcaggaagtgatcggctt840

ccggctatgttgcgaccagttttcttcttgttttttgcagctccaagtatggctagcttg900

gcttgggcatcaattactggaagctttgacactgcttcaaagatgcttttctttctctcg960

ctcttcctctttacgacactgatatgcaggccaactctcttcaagaaatcaatgagaaaa1020

ttcaacgtagcatggtgggcatactcatatccagtaacactattagctttggcttccaca1080

agatatgcaaaagaggtcaaaggaaaagtgtcacataccataatgctcattctttcatct1140

ctatctgttcttgtcattattgccctcttgttatctactgctctctactctaaaatgctc1200

ttaccagatgaagatccttctctcacttccaagctacccaaacagtcttctcgaattatt1260

tga1263

<210>2

<211>420

<212>prt

<213>基因ntslac2氨基酸序列

<400>2

metargilethrproalaleuaspaspphehisthrproasnthrglu

151015

thrlysasnglnasnthrileileproaspthrasnilemetileglu

202530

leuproargserserserserglylysarggluaspmetilegluleu

354045

proargserserserserglylysglngluasphisasptyrglyleu

505560

leualapheileglyleuargphemetleuserleumetleulysarg

65707580

ilehisalaglytyrpheargileserleuserleucystrpgluthr

859095

leuleutrplysthrleuleuaspprothrasnasngluthrlysphe

100105110

leuhishisvalproglnmetiletyrargprovalleuilepheleu

115120125

trpserphealaleuleuvalleuvalpheleuserleuleutyrleu

130135140

leulyscysphepheargpheasnleuvallysglyglupheleuhis

145150155160

hisvalglyvalasntyrleuphealaprotrpilesertrpleuile

165170175

leuleugluserhispropheilealaprolyshisvalglyphelys

180185190

alaleutrptrpvalphealavalprovalilevalleuaspvallys

195200205

iletyrglyglntrpphethrlysglylysargleuleuthralaala

210215220

alaasnprothrserasnleuservalileglyasnleuvalglyala

225230235240

argalaalaalalysmetglytrpglngluvalservalcysleuphe

245250255

serleuglymetvalhistyrleuvalleuphevalthrleutyrgln

260265270

argleuserglyseraspargleuproalametleuargprovalphe

275280285

pheleuphephealaalaprosermetalaserleualatrpalaser

290295300

ilethrglyserpheaspthralaserlysmetleuphepheleuser

305310315320

leupheleuphethrthrleuilecysargprothrleuphelyslys

325330335

sermetarglyspheasnvalalatrptrpalatyrsertyrproval

340345350

thrleuleualaleualaserthrargtyralalysgluvallysgly

355360365

lysvalserhisthrilemetleuileleuserserleuservalleu

370375380

valileilealaleuleuleuserthralaleutyrserlysmetleu

385390395400

leuproaspgluaspproserleuthrserlysleuprolysglnser

405410415

serargileile

420

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>正向引物

<400>3

atgagaatcactcctgcattagatg25

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>反向引物

<400>4

tcaaataattcgagaagactgtttg25

<210>5

<211>58

<212>dna

<213>ntslac2_f

<400>5

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgctttactaaggggaagagacttttaaca58

<210>6

<211>58

<212>dna

<213>ntslac2_r

<400>6

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtccctgataatctctgatataacgtcacaa58

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>kanf

<400>7

tctggacgaagagcatcagg20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>kanr

<400>8

atgaatccagaaaagcggcc20

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>ntslac2_qrt_f

<400>9

aggtccagtctgttgtgagg20

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>ntslac2_qrt_r

<400>10

tttgccttaacccgttgagc20

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>26s_f

<400>11

gaagaaggtcccaagggttc20

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>26s_r

<400>12

tctccctttaacaccaacgg20