专利名称：：与猪肌内脂肪沉积相关的氯离子通道基因片段及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种与猪肌内脂肪沉积相关的氯离子通道基因片段及其应用。
背景技术：
：肌内脂肪是指肌纤维之间或肌纤维内部沉积的脂肪，它与肉质密切相关，是影响肉质的关键因素之一。肌内脂肪沉积量的增加可以显著改善肉的多汁性、色泽、风味、嫩度和持水力等指标，一般认为猪肉肌内脂肪沉积量为3.0%的肉质较好。由于对肌内脂肪沉积的分子机理了解很少，这一性状还没有有效的遗传标记(或分子标记)。鉴于肌内脂肪沉积这一性状的遗传复杂性，目前在选育中还无法对这一性状进行有效地选择，只能利用肌内脂肪沉积量高的地方猪种与瘦肉型猪杂交，来提高商品猪的肌内脂肪沉积量。由于目前肌内脂肪沉积的遗传基础和调控机制还不清楚，猪选育中肌内脂肪沉积量缺乏可行的选择指标，通常只能通过个体的B超和后裔的屠宰试验测定来评估肌内脂肪沉积量。虽然B超法相对超声波法有较大改进，但由于不了解肌内脂肪沉积的遗传学规律，所以在选育中效果一直不理想，达不到预期目标。另一方面，我国地方猪种的选育程度较低，同一猪种内部也包涵丰富的遗传多样性，因此利用地方猪种与瘦肉型猪杂交来提高商品猪肌内脂肪沉积量、改善肉品质的效果参差不齐，无法稳定有效地发挥我国地方猪种肉质优良的遗传潜力。由于缺乏有效的选育手段，目前利用杂交选育方法在肌内脂肪沉积上难以获得突破，地方猪种与瘦肉型猪的杂交优势也难以在随后的继代选育中得到保持和固定。总之，就目前的选育和饲养手段而言，增加肌内脂肪沉积量即意味着增加皮下脂肪的沉积、瘦肉率降低，因此如何在保持较少皮下脂肪的同时增加肌内脂肪沉积量，是目前肉质调控所面临的难题。
发明内容本发明的目的是提供一种与猪肌内脂肪沉积量相关的DNA片段及其应用。本发明提供与猪肌内脂肪沉积量相关DNA片段是序列表的序列1所示的DNA片段。含有所述DNA片段的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。扩增所述DNA片段的全长及其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述引物对具体可为序列表中的序列3和序列表中的序列4。含有所述引物对的试剂盒也属于本发明的保护范围。所述DNA片段可应用于辅助检测猪肌内脂肪沉积量和猪的育种。本发明还提供了一种辅助检测猪肌内脂肪沉积量的方法，是检测待测猪的基因型为AA基因型、AB基因型还是BB基因型；所述AA基因型是待测猪的总RNA的反转录产物含有序列1所示DNA片段而不含有序列2所示DNA片段的样本；所述朋基因型是待测猪的总RNA的反转录产物含有序列2所示DNA片段而不含有序列1所示DNA片段的样本；所述AB基因型是待测猪的总脂A的反转录产物含有序列1所示DNA片段和序列2所示DNA片段的样本。待测猪中肌内脂肪沉积量自高至低依次为AA基因型的猪、AB基因型的猪、BB基因型的猪。所述检测待测猪的基因型的方法具体可为将待测猪的总RNA的反转录产物作为模板，用所述的引物对进行PCR扩增，检测PCR扩增产物。通过以下标准判读待测猪的基因型如果扩增产物只有一种，为序列1所示DNA片段，待测猪为AA基因型；如果扩增产物只有一种，为序列2所示DNA片段，待测猪为BB基因型；如果扩增产物为序列1所示DNA片段和序列2所示画A片段的混合物，待测猪为AB基因型。所述待测猪具体可为荣昌猪。所述方法可应用于猪的育种。本发明提供了与猪肌内脂肪沉积相关的氯离子通道基因片段以及应用该DNA片段辅助检测猪肌内脂肪沉积量的方法。本发明提供的DNA片段与猪肌内脂肪沉积量具有非常显著的相关性。与传统方法相比，应用本发明的方法对出生仔猪进行检测，可及早预测待测猪的肌内脂肪沉积量，并可实现早选，縮短选育时间，极大地减少选育费用。同时，本发明的方法是直接针对具有效应的功能DNA片段进行选择，提高了选育准确性，减少了人力物力的浪费。本发明具有巨大的经济价值和社会意义。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例1、与猪肌内脂肪沉积量相关的DNA片段的发现一般而言，荣昌猪肌内脂肪沉积量约为4.0%-5.0%，是瘦肉型猪的2倍左右。在重庆荣昌进行日粮赖氨酸/消化能比值对荣昌猪肌内脂肪沉积影响的饲养试验和屠宰试验中发现有个别荣昌猪肌内脂肪超级沉积，肌内脂肪沉积量可以达到8.8%-9.1%，几乎是普通荣昌猪的l倍。利用猪的Affymetrix(Affymetrix,Inc.,USA)寡核苷酸芯片，对肌内脂肪超级沉积的荣昌猪的背最长肌组织的基因转录表达谱进行扫描，得到若干DNA片段作为备选片段。一、DNA片段的扩增根据备选片段中的一个设计引物对如下上游引物(序列表的序列3):5，-CAGAAAGAACATCCAGGACC-3，；下游引物(序列表的序列4):5'-CTTAGCACAGGCATGACGAT-3'。以1000头60kg的荣昌猪的肌肉组织的cDNA为模板，利用所述引物对进行PC財广增。PCR扩增条件(D94。C，4min;(2)94°C，30s;(3)54.2°C，30s;(4)72°C，40s;(5)Goto(2)35cycles;72°C，8min。二、DNA片段的序列测定与分析①PCR产物切胶、纯化回收将100叱PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶呈像仪(VilberLourmat，Tex-20LM，France)下切胶，利用胶回收试剂盒(北京盈信阳光生物技术有限公司，北京)回收纯化。②与T载体连接，反应体系如下T一vector1PLc薩4PLLigationmix_5PL合计10叱16'C水浴过夜，16h，得到连接产物。③转化用100叱DH5a感受态细胞(宝生物工程(大连)有限公司)，加10PL连接产物；冰浴30min，42。C水浴热激90s，冰浴2-5min;每管加800叱LB液体培养基，37。C培养lh;100-150叱培养液涂板，37。C培养12h。挑20个单个菌落划线，37'C培养12h。④序列分析每个样本取4-5个菌斑，用灭菌牙签挑起，投入含有筛选培养基(在5mlLB液体培养基中加入IO叱浓度为100mg/ml的氨苄青霉素)的灭菌试管中，封好塞子，放入摇床，37°C、255r/min过夜，分装菌液，送三博远志科技有限公司(北京)1000个样本中83个样本的PCR产物只有一种，PCR产物为序列表的序列1所示的DNA片段，将其命名为AA基因型；500个样本的PCR产物只有一种，PCR产物为序列表的序歹"2所示的DNA片段，将其命名为BB基因型；333个样本的PCR产物为序列1所示的DNA片段和序列表的序列2所示的DNA片段的混合物，将其命名为AB基因型。三、DNA片段与猪肌内脂肪沉积量的相关性分析检测步骤一的83头AA基因型的猪、500头BB基因型的猪和333头AB基因型的猪的背最长肌组织中的肌内脂肪沉积量。检测结果表明AA基因型猪的肌内脂肪沉积量最高，达8.15%;AB基因型猪的肌内脂肪沉积量约为4.5y。；BB基因型猪的肌内脂肪沉积量最低，约为2.9%。结果分析鉴于不同基因型的猪肌内脂肪沉积量差异显著的情况，该基因型确实是导致我国地方猪肌内脂肪沉积呈多样性的主要原因。实施例2、与猪肌内脂肪沉积量相关的DNA片段的应用以36头90kg的荣昌猪的肌肉组织的cDNA为模板，利用如下引物对进行PC財广增上游引物(序列表的序列3):5，-CAGAAAGAACATCCAGGACC-3，；下游引物(序列表的序列4):5，-CTTAGCACAGGCATGACGAT-3，。然后检测该36头荣昌猪的背最长肌组织中的肌内脂肪沉积量，结果见表1。表l90kg不同基因型荣昌猪肌内脂肪的沉积量(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>相同字母表示基因型间差异不显著，不同字母表示基因型间差异显著。在90kg荣昌猪中，同样是AA基因型的猪肌内脂肪沉积量最高，AB基因型的次之，BB基因型的猪肌内脂肪沉积量最低。序列表<110>中国农业大学<120〉与猪肌内脂肪沉积相关的氯离子通道基因片段及其应用〈130〉CGG膽Y92028〈160〉4<210〉1<211〉355<212〉飄<213〉猪属猪(Sus)<400〉1atcc3gg3cca^taMattgatttggtttggcttgtttgcttttaMggc60gacttgcc犯ttgctgaattaalcagcdtgttagtgtcca120aaetELCtcctctggggagctattccacccgggggagctactctacctgggggacctaactc180C3CCtgggggagctaactccacctgggggagctaactccacctgggggsgctattccacc240tgggcatcctcttttctctgtcgctggctgtgtt"tctcaggtatacttca300ctctgtgggtctcagga^aigtaaactgcctcttagatcgtcatgcctgtg355〈210〉2〈211〉334〈212〉DNA<213〉猪属猪(Sus)<400〉2caga犯ga^catccaggacc^t^tattgatttggtttggcttgtttgcttttaaaggc60tgtgtttaaagacttgccaattgctgaattaatc8gceitgttagtgtcca1207aaaactcctctggggagctattccacccgggggagctactctacctagaagagctactct180acctgggggacctactccacctgggggagctattccacctgggcatcctcttttctctgt240cgctggctgtgtttctcaggtatacttcaagaacagcacctctgtgggtctcaggaaagt300aaactgcctcttagatcgtcatgcctgtgctaag334〈210〉3<211〉20<212>DNA<213〉人工序列<220>〈223〉〈400〉3cagaaagaacatccaggacc20〈210〉4〈211〉20<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>〈400〉4cttagcacaggcatgacgat20权利要求1、核苷酸序列为序列表的序列1所示的DNA片段。2、含有权利要求1所述DNA片段的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。3、扩增权利要求1或2中所述DNA片段的全长及其任一片段的引物对。4、如权利要求3所述的引物对，其特征在于所述引物对为序列表中的序列3和序列表中的序列4。5、权利要求1所述DNA片段在辅助检测猪肌内脂肪沉积量和猪的育种中的应用。6、含有权利要求3或4所述引物对的试剂盒。7、辅助检测猪肌内脂肪沉积量的方法，是检测待测猪的基因型为AA基因型、AB基因型还是BB基因型；所述AA基因型是待测猪的总RNA的反转录产物含有序列1所示DNA片段而不含有序列2所示DNA片段的样本；所述BB基因型是待测猪的总RNA的反转录产物含有序列2所示DNA片段而不含有序列1所示DNA片段的样本；所述AB基因型是待测猪的总RNA的反转录产物含有序列1所示DNA片段和序列2所示DNA片段的样本。8、如权利要求7所示的方法，其特征在于所述检测待测猪的基因型为AA基因型、AB基因型还是BB基因型的方法为将待测猪的总RNA的反转录产物作为模板，用权利要求3或4所述的引物对进行PCR扩增，检测PCR扩增产物。9、如权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述待测猪为荣昌猪。10、权利要求7至9中任一所述的方法在猪的育种中的应用。全文摘要本发明公开了一种与猪肌内脂肪沉积相关的氯离子通道基因片段及其应用。本发明提供的与猪肌内脂肪沉积量相关的DNA片段是序列表的序列1所示的DNA片段。本发明还提供了应用所述DNA片段辅助检测猪肌内脂肪沉积量的方法。本发明提供的DNA片段与猪肌内脂肪沉积量具有非常显著的相关性。与传统方法相比，应用本发明的方法对出生仔猪进行检测，可以及早获知待测猪的肌内脂肪沉积量，并可以实现早选，缩短选育时间，极大地减少选育费用。同时，本发明的方法是直接针对具有效应的功能DNA片段进行选择，提高了选育的准确性，减少了人力物力的浪费。本发明具有巨大的经济价值和社会意义。文档编号C12N15/12GK101463353SQ200910076200公开日2009年6月24日申请日期2009年1月13日优先权日2009年1月13日发明者飞任,尹靖东,尼健君,李凤娜,李德发,马润林申请人:中国农业大学