用于检测乳铁蛋白的ELONA适配体及其应用的制作方法

本发明设计使用核酸适配体来检测乳铁蛋白的elnoa方法和试剂盒。进一步地，本发明涉及检测牛奶、奶粉等乳制品中的乳铁蛋白的elona方法和试剂盒。

背景技术：

乳铁蛋白(lactoferrin，简写为lf)是动物初乳中的天然蛋白质，是一种多功能蛋白质，具有光谱抗菌，抗病毒感染作用，能调节体内铁的平衡。能够促进细胞的生长，调节机体的免疫功能，增强机体抗病能力。乳铁蛋白广泛分布于哺乳动物乳汁中，人乳中乳铁蛋白浓度约为1.0-3.2mg/ml，约是牛乳中的10倍。它被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和具有潜力的食品和饲料添加剂，国家食品安全标准gb14880也将其列为营养强化剂。目前市场上常见的乳铁蛋白主要是从牛乳中提取的乳铁蛋白，然后将其添加至配方乳粉、营养食品及保健品等，乳铁蛋白的含量已经成为这些相关产品质量的主要指标。

酶联免疫吸附技术(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)目前广泛应用于蛋白分子的检测。但是传统的基于抗体的elisa检测技术有一些不足，例如抗体需要使用严格的低温保存条件，抗体的制备周期长、费用高、批间质量差异大，而且使用elisa检测时还需要使用带有标记的二抗反应，导致操作繁琐。核酸适配体具有与单克隆抗体相当的高特异性和高亲和性，能够便于保存和运输，温度变化引起的变性是可逆的，且筛选时间短、费用低，且重复性高。而且得到的核酸适配体在后期易于合成和修饰。在先前的工作中，我们基于指数富集配体进化技术，以乳铁蛋白为靶标进行筛选，获得了一对可以高特异性、高亲和识别乳铁蛋白不同免疫位点的核酸适配体。

技术实现要素：

为了克服现有基于抗体检测乳铁蛋白的酶联免疫吸附技术的不足，本发明的目的是提供一种高特异性、高灵敏度、操作便捷的核酸适配体的酶联寡核苷酸分析(enzyme-linkedoligonucleotideassay,elona)检测乳铁蛋白的方法。

用于检测乳铁蛋白的elona适配体，包括seqidno.1～2所示的核苷酸序列。

其中，seqidno.1～2所示的核苷酸序列的3’端利用生物素标记。

一种用于检测乳铁蛋白的elona方法，该方法包括以下步骤：

(1)获得待测样品；

(2)将包被缓冲液加入固体支持物中过夜孵育；

(3)使用牛血清白蛋白(bsa)进行封闭；

(4)将核酸适配体a加入到封闭处理后的固体支持物中，所述的固体支持物为酶标板，所述酶标板可以选择96孔酶标板，反应，然后清洗3次并将孔拍干；

(5)将待测样品、标准品分别加入固体支持物；并加入核酸适配体b与酶标试剂反应，然后清洗并将孔拍干；

(6)加入100μl显色液避光反应10min，最后加入50μl终止液终止反应，并检测待测样品在450nm处的吸光值，所述显色液为tmb显色液，所述终止液为2m的h2so4；

所述核酸适配体a的序列如seqidno.1所示；

所述核酸适配体b的序列如seqidno.2所示；。

步骤(2)中，所述包被缓冲液的配方如下：na2co31.59g/l，nahco32.94g/l。

其中，所述包被缓冲液的ph值为7.0～10.0，优选9.3。

其中，所述核酸适配体a的浓度为100～1200nm。

步骤(4)中，所述的核酸适配体a与固相支持物反应的结合时间为1～30min，结合温度为4～37℃。

其中，所述标准品为：乳铁蛋白。

其中，所述的酶标试剂为辣根过氧化物酶-链霉亲和素，添加量为20-200μl，使用时优选将辣根过氧化物酶-链霉亲和素稀释10000倍，添加量为100μl，结合时间为30min。

一种用于检测乳铁蛋白的elona试剂盒，包括如下试剂：

(1)标准品：乳铁蛋白；

(2)包被缓冲液：na2co31.59g/l，nahco32.94g/l；

(3)稀释剂：1×pbs缓冲液+1mmmgcl2，ph7.4；

(4)核酸适配体：其核苷酸序列如seqidno.1～2所示，其3’端利用生物素标记；

(5)酶标试剂：辣根过氧化物酶-链霉亲和素；

(6)显色液：tmb显色液；

(7)终止液：2m的h2so4；

(8)洗涤液1×pbs+0.05％tween-20。

本发明是基于核酸适配体的酶联寡核苷酸分析技术检测乳铁蛋白的方法，具体包括以下步骤：

1)配制一系列奶粉样品溶液；

2)将链霉亲和素(streptavidin)稀释成不同浓度的溶液；

3)稀释一系列浓度的核酸适配体a；

4)将步骤2)中稀释的sa加入96孔的酶标板中过夜孵育；

5)将步骤4)中处理的酶标板使用牛血清白蛋白(bsa)进行封闭；

6)将步骤3)中稀释的核酸适配体a加入到步骤5)处理后的96孔板的孔内并反应，然后清洗3次并将孔拍干；

7)配制一系列浓度的乳铁蛋白标准溶液，以及加入了乳铁蛋白标准品的奶粉溶液；

8)将步骤7)配置的乳铁蛋白的标准溶液或奶粉样品溶液加入步骤6)处理的96孔板的孔内孵育，然后清洗3次并将孔拍干，接着往孔内加入核酸适配体b孵育，再清洗3次并将孔拍干，最后加入sa-hrp溶液孵育；

9)加入显色液避光反应，最后加入终止液终止反应，并检测待测样品在450nm处的吸光值。

有益效果：

本发明采用基于两条生物素标记的核酸适配体作为特异性检测探针的elona技术快速检测乳铁蛋白。将生物素标记的核酸适配体与包被有链霉亲和素的孔板反应，然后加入乳铁蛋白或含有乳铁蛋白的奶粉溶液与其进行孵育然后清洗，加入第二条生物素修饰的核酸适配体链于孔板内反应，再加入辣根过氧化物酶标记的联袂亲和素(sa-hrp)，孵育结合后清洗待测样品，加入显色试剂盒中tmb显色液进行显色反应，根据450nm处的吸光值的变化来对乳铁蛋白进行测定。

附图说明

图1是本发明实施例中elona技术检测乳铁蛋白的捕获探针密度的优化分析，同时也使用与乳铁蛋白来源相同的β-乳球蛋白作为阴性对照分析。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1：

合成两条用于elona检测乳铁蛋白的核酸适配体(由上海生物生工有限公司合成)，序列如下：

所述核酸适配体a的序列为：

5’-ctaaggcaggacaccgtaaccggtgcatctatggctactagcttttcctgcctaaaaaaaaaa-biotin-3’；

所述核酸适配体b的序列为：

5’-ctagcaggacaccgtaaccctaacacgtacggggcatttatggcatagctcttcctccctgcaaaaaaaaaa-biotin-3’。

上述核酸适配体在3’端修饰了生物素标记。

基于核酸适配体的酶联免疫吸附技术检测乳铁蛋白的方法，包括以下步骤：

1.核酸适配体的复性：生物素标记的核酸适配体，在95℃高温变性5min，然后迅速插入到冰中复性10min；

2.将上述所示的序列的任意一条生物素标记的乳铁蛋白核酸适配体1μm体积100μl加入至已包被了sa的96孔板内反应30min，然后使用1×pbst清洗3次；

3.再加入100μl待测样品与孔板内并孵育30min，然后使用1×pbst清洗3次；

4.往孔板内加入另一条生物素标记的乳铁蛋白核酸适配体1μm体积100μl反应30min，然后使用1×pbst清洗3次；

5.往孔内加入100μl浓度为1:10000的sa-hrp溶液，并孵育30min；

6.将结合了sa-hrp的孔板使用1×pbst清洗3次后，往每个孔内加入100μltmb显色液避光反应10min，最终加入50μl2m的h2so4终止反应；

7.使用酶标仪读取待测样品在450nm处的吸光值并记录结果来测定乳铁蛋白的含量。

结果表明，乳铁蛋白在8ng/ml-5μg/ml的范围内呈良好的线性关系，线性相关系数为0.9815。同时，检测方法特异性好，乳球蛋白，乳白蛋白，酪蛋白等对测定结果均无干扰。将该方法应用于牛奶样本的检测，牛奶样本的加标回收率为80％-120％。

序列表

<110>南京祥中生物科技有限公司

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<213>人工序列(artificialsequence)

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