银杏黄酮化合物生物合成基因中多个亚型的研究的制作方法

本发明属植物基因资源和医药技术领域，涉及在银杏(ginkgobiloba)中位于黄酮化合物有生物合成上游途径的多个基因亚型，揭示黄酮生物合成相关的多个亚型，为有效调控黄酮类化合物含量提供科学依据。

背景技术：

银杏叶提取物具有抗氧化、抗衰老、清除自由基并提高免疫力的作用；它对冠心病、心绞痛、脑动脉硬化具有明显的改善作用，且广泛用于阿尔茨海默病和高血压的治疗。标准化的银杏叶提取物的主要成分为24％的黄酮类化合物和6％的萜内酯成分。黄酮类化合物是银杏提取物中含量最高，药效活性最强的成分。本发明基于发明人已经建立的银杏细胞悬浮体系，对银杏黄酮类化合物生物合成途径进行探究，挖掘参与黄酮类化合物生物合成基因。本发明通过对不同亚型的基因及其编码的蛋白进行功能表征、同源分析以及亚细胞定位等分析，从而确定在不同亚型中真正参与黄酮类生物合成途径相关的基因，并阐明此类基因是否真正与黄酮类化合物的生物合成途径相关。

技术实现要素：

一、技术内容

本发明利用银杏幼苗，对银杏转录组进行高通量测序，以及黄酮类化合物生物合成的数据库，多序列比对，进行基因挖掘。成功找到黄酮类生物合成相关的候选基因，其中包括基因gbpal、gbc4h、gb4cl和gbchs。使用blast软件将转录组测序序列与swiss-prot、geneontology、clusteroforthologousgroups、eukaryoticorthologousgroups和kyotoencyclopediaofgenesandgenomes数据库比对，获得转录组序列的功能注释。通过以上方式，寻找到候选基因gbpal2、gbpal3、gbpal4、gbpal5、gbc4h2、gb4cl1、gb4cl2及gbchs。然后，结合medicinalplantgenomicsresearch数据库和ncbi中已报道的基因，利用blast比对，获得候选基因gbpal1、gbc4h1和gb4cl3。基因序列见附录1。每个基因分别带有saci和ecori酶切位点的两对引物进行扩增gbpal、gbc4h和gb4cl基因，分别带有nhei和bamhi酶切位点的两对引物进行扩增gbchs，扩增产物通过电泳纯化并连接平末端克隆载体peasy-blunt(全式金)进行dna测序。

本发明通过投入底物l-苯丙氨酸，对gbpal进行功能验证，并检测到产物反式-肉桂酸。比对产物与标准品的紫外吸收光谱图及lc-ms的进一步验证，确认gbpal2和gbpal3具有苯丙氨酸解氨酶的生化功能(见图1，2)。反式肉桂酸的分子量为148，esi阳离子扫描的质谱中可以检测到m/z187为[m+k]，m/z149为[m+h]，m/z131为[m-cooh]的特征峰。通过投入底物反式肉桂酸，利用hplc-dad检测到产物，与标准品进行比对确证为对香豆酸。利用lc-ms检测gb4cl1与gbchs共表达产物，在esi阳离子模式和阴离子模式扫描的离子流图中均检测到柚皮素查耳酮和柚皮素(图3、4)。其分子量均为272，在阳离子扫描模式对应的质谱中，找到其特征峰：m/z273为[m+h]峰；m/z295为[m+na]峰；m/z567为[2m+na]峰以及特征碎片峰m/z153。

本发明的亚细胞实验结果(图5、6)揭示了gbpal，gbc4h，gb4cl及gbchs四个酶在细胞中的位置，其合成场所在内质网。黄酮类化合物生物合成的酶被定位在内质网的胞质一侧，它们以紧密结合在内质网上的细胞p450酶如c4h、f3’h和f3’5’h为中心，形成了多酶复合体。亚细胞实验结果进一步证明了前人的推测，即细胞色素p450酶(如c4h)起到了定位于内质网的作用，而其它酶通过相互作用与细胞色素p450酶形成多酶复合体，以此发挥合成黄酮类化合物的功能。

本发明以gbchs为起点，通过gbchs与gb4cl的组合，获得与gbchs蛋白间相互作用(图7)，且最有可能参与黄酮类生物合成途径的gb4cl1、gb4cl3。然后，将gbc4h分别与gb4cl的组合，gbc4h1、gbc4h2均与gb4cl1、gb4cl3蛋白间有相互作用。gbpal2与gbc4h2蛋白间存在相互作用。gbpal3与gbc4h1、gbc4h2蛋白结合后均有yfp荧光的生成。据此推断gbpal2、gbpal3、gbc4h1、gbc4h2、gb4cl1和gb4cl3是最有可能参与黄酮类化合物生物合成的候选基因。

本发明利用进化树分析尚发现，五个不同亚型均分散在裸子植物和蕨类植物之间，但位于不同的分支中，差异较大(图8、9)，推测五个不同亚型的pal参与不同的次生代谢产物生物合成途径。其中gbpal2、gbpal3与被子植物中的pal亲缘关系最近，gbpal1与gbpal5之间的相似性更高。五个亚型的pal都与相应的裸子植物相近，且与蕨类植物有较近的亲缘性。从进化树分析还可看出，只有gbpal2和gbpal3真正参与黄酮生物合成的途径。4cl分为两类大的进化分支：classi和classii。拟南芥、白杨和大豆中的classii普遍与黄酮的生物合成相关，而classi中的4cl更可能与木质素和其他苯丙素化合物的生物合成相关。li等在研究拟南芥中不同亚型4cl的作用时，发现只有拟南芥4cl3(a.thaliana4cl3)的突变体中，黄酮的含量减少了。这说明4cl3是真正参与黄酮的生物合成途径。4cl1和4cl2的突变体中，黄酮的含量没有减少的直接变化。从而，4cl1与4cl2更多的是参与木质素等其他化合物的生物合成。chen等过表达火炬松pinustaeda中的4cl3，黄酮的衍生化合物-单宁含量上升，而木质素没有影响，从而推测火炬松中的4cl3也是直接参与黄酮类生物合成途径的酶。根据我们构建的进化树分析候选的gb4cl1、gb4cl2和gb4cl3的功能，gb4cl2为单独的分支，相关性较低。gb4cl1与gb4cl3均与火炬松4cl3，拟南芥4cl3有很高的相似性。这说明gb4cl1与gb4cl3非常有可能直接参与黄酮的生物合成，属于classii。

二、附图说明

图1.表达gbpal2的酵母与l-苯丙氨酸(l-phenylalanine)共发酵产物hplc和ms图谱

图2.表达gbpal3的酵母与l-苯丙氨酸共发酵产物hplc和ms图谱

图3.表达gbc4h1和gbc4h2的酵母与反式肉桂酸(trans-cinnamicacid)共发酵产物hplc图谱

图4.gb4cl1与gbchs在酵母中的共表达产物柚皮素查耳酮(1，naringeninchalcone)及柚皮素，2，naringenin)

a.选择性离子流图(阳离子模式,m/z273)；b.对应a图中化合物1的质谱；

c.对应a图中产化合物2的质谱；

图5.亚细胞定位结果图a.亚细胞定位的载体构建示意图

b.绿色通道为gfp荧光，红色通道为叶绿体的自发荧光，merged是gfp荧光与叶绿体自发荧光的组合；含空载体的拟南芥原生质体作为对照组，为35s::gfp；35s::gbpal-gfp为已转入pbi221-gbpal-gfp质粒的原生质体；bars＝5μm；

图6.苯丙素途径及其黄酮分支途径中的gbpal，gbc4h,gb4cl及gbchs酶在内质网形成大分子复合体模型

图7.gbpal,gbc4h,gb4cl,gbchs蛋白间相互作用

图8.gbpal的系统进化树分析图

图9.gb4cl的系统进化树分析图

三、具体实施方式

下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计。

实施例1

rna提取与基因克隆

将总rna提取所需要的实验器具进行灭菌和去rna酶处理。取银杏叶片，用锡箔纸包住，浸泡在液氮中速冻，取出后放入研钵中，加入液氮，用研棒快速研成细粉，在研磨过程中始终补充液氮以保持低温。待其全部研磨成粉末后，按照北京全式金多糖多酚植物rna的提取试剂盒的步骤进行总rna的提取。利用南京诺维赞反转录试剂盒合成cdna用于基因克隆。

通过利用本实验室的银杏幼苗，对银杏转录组进行高通量测序，以及黄酮类化合物生物合成的数据库多序列比对，进行基因挖掘。找到黄酮类生物合成相关的候选基因，其中包括基因gbpal、gbc4h、gb4cl和gbchs。使用blast软件将转录组测序序列与swiss-prot、geneontology、clusteroforthologousgroups、eukaryoticorthologousgroups和kyotoencyclopediaofgenesandgenomes数据库比对，获得转录组序列的功能注释。通过以上方式，寻找到候选基因gbpal2、gbpal3、gbpal4、gbpal5、gbc4h2、gb4cl1、gb4cl2及gbchs。然后，结合medicinalplantgenomicsresearch数据库和ncbi中已报道的基因，利用blast比对，获得候选基因gbpal1、gbc4h1和gb4cl3。基因序列见附录1。每个基因分别带有saci和ecori酶切位点的两对引物进行扩增gbpal、gbc4h和gb4cl基因，分别带有nhei和bamhi酶切位点的两对引物进行扩增gbchs，扩增产物通过电泳纯化并连接平末端克隆载体peasy-blunt(全式金)进行dna测序。引物序列见附录2。

实施例2

酿酒酵母表达载体的构建

为了验证基因的功能，我们选择了pesc系列酵母表达载体。测序成功后，同时用saci和ecori酶对质粒和pesc-ura载体进行酶切，从而连接、构建成真核表达载体pesc-ura-gbpal1、pesc-ura-gbpal2、pesc-ura-gbpal3、pesc-ura-gbpal4、pesc-ura-gbpal5、pesc-ura-gbc4h1和pesc-ura-gbc4h2。由于4cl的表达产物有coa结构，如用以上独立基因表达验证功能，则在提取产物时，coa结构会丢失。故，我们按照以下示意图，将4cl和chs进行共表达，构建了pesc-ura-gb4cl1-gbchs、pesc-ura-gb4cl2-gbchs和pesc-ura-gb4cl3-gbchs。

基因的功能验证：

本实验所有酿酒酵母菌株的质粒转化均基于电击转化法：在ep管中加入40μl酿酒酵母电击感受态和300ng的质粒dna，轻轻混匀并转移到预冷的2mm规格电击杯中，快速放入bio-radmicropulser电击槽中，选择sc2模式进行电击转化；电击结束后立即用1m山梨醇将电击杯中的感受态细胞重悬并转移到ep管中，30℃孵育1h后涂布在相应营养缺陷的sd(syntheticdextroseminimaldropoutmedium)培养中，30℃倒置培养48-72h。为验证pal和c4h的功能，同时转化pesc-ura-gbpal和pesc-ura-gbc4h，以及对照组空白质粒pesc-ura。验证4cl和chs的功能则需同时转化pesc-ura-gb4cl-gbchs和对照组质粒pesc-ura-gb4cl。转化后的菌株挑取单克隆接种到5mlsd培养基中，30℃220rpm条件下震荡培养过夜，次日以1:50的比例接种到50ml的sg(syntheticgalactoseminimaldropoutmedium)培养基中，在30℃220rpm条件下的恒温振荡培养箱中培养24h后，投入1mg/ml的底物，发酵培养4天。

实施例3

发酵产物的检测方法

发酵培养4天后，以1:1的体积比加入乙酸乙酯终止反应。超声破碎细胞30min，使细胞内代谢物释放且化合物与乙酸乙酯充分混匀，静置。次日，用乙酸乙酯萃取三次，旋转蒸发仪蒸干，获得发酵产物。然后用1ml色谱甲醇将产物溶解。利用全波长hplc检测，柱温30℃，流动相a为醋酸-水：1:1000，流动相b为醋酸-甲醇：1:1000；流速为1ml/min。检测波长分别为247nm和309nm。通过与标准品的比对，确证目标产物；然后，利用lc-ms进行确证。

实施例4

亚细胞定位

将基因构建在pbi221-gfp载体上，获得重组质粒。质粒的构建与pbi221-gbpal1-gfp相同。通过大肠杆菌进行富集，提取质粒，使其浓度达到1μg/μl；再制备拟南芥叶片的原生质体，利用peg方法进行转染。将重组质粒与内质网的标识物cnx(calnexin)一同转入拟南芥的原生质体，培养16h后，用剪过尖头的200μl枪头取一滴原生质体液至载玻片，盖上盖玻片，用滤纸吸干周边多余的水分；利用激光共聚焦显微镜观察候选基因的定位情况。

实施例5

蛋白间相互作用-双分子荧光互补技术

将候选基因分别构建在puc-spyce和puc-spyne载体上，通过大肠杆菌富集，获得重组质粒，使其浓度达到至少1μg/μl。利用peg转染的方法，转入拟南芥的原生质体中，制备、转染及观察参照亚细胞定位的方法。

序列表

<110>于荣敏

<120>银杏黄酮化合物生物合成基因中多个亚型的研究

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