一种基于磁珠的检测分型试剂盒的制作方法

本实用新型属于生物技术检测领域，尤其涉及一种基于磁珠的检测分型试剂盒。
背景技术：
：甲型流感病毒为常见流感病毒，非常容易发生变异，因此有很多甲型流感病毒亚型。这些亚型则被人们称为“禽流感”。甲型流感对人类致病性高，曾多次引起世界性大流行。甲型流感病毒中至今发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有：甲型H1N1、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2和H10N8。其中H1、H5、H7亚型为高致病性，H1N1、H5N1、H7N9尤为值得关注。因此非常有必要对甲型流感病毒亚型H1N1、H5N1、H7N9进行检测。目前对于这几种亚型上没有很好的检测方法。除甲型流感病毒外，人乳头瘤病毒(HPV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)等也都存在多种亚型。如何对这些亚型进行有效的快速的分型，十分必要。技术实现要素：本实用新型的目的就是提供一种能快速、高效分析病毒分型的试剂盒。其原理是利用磁珠上的正向引物和5’端带荧光标记的反向引物特异性地扩增特定的基因片段。通过磁性吸附保留磁珠及结合在磁珠上面的特定基因片段。该扩增出的基因片段是仅特异性地存在于一种病毒亚型中的。通过检测扩增产物所携带的荧光信号，来确定病毒亚型。具体方案是：一种基于磁珠的检测分型试剂盒，包括微孔板、与微孔板匹配的微孔板盖、可拆卸地设置在微孔板底部的主电磁吸盘、磁珠试剂瓶和荧光标记试剂瓶；微孔板包括多个微孔；微孔板盖上设置有与微孔的内径匹配的环形凸起；微孔板与微孔板盖被设置为可放置入PCR仪中，起到代替PCR管和PCR架的作用；磁珠试剂瓶中设置有m种连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠，m>1；荧光标记试剂瓶中设置有m种5’端带荧光标记的反向引物，且不同的反向引物带有不同的荧光标记；m种连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠和m种5’端带荧光标记的反向引物一一对应地组成引物对用于聚合酶链式反应(PCR)或反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增。磁珠连接正向引物由5’端的连接分子和3’端的核心引物组成，其中连接分子为-NH2-(CH2)n-，n＝4-8；核心引物为5’端带有多聚T的特异性正向引物。进一步地，还包括辅助引物试剂瓶。所述辅助引物试剂瓶中设置有辅助引物；所述辅助引物为特异性正向引物，即其序列为核心引物去掉5’端的多聚T之后的序列。进一步地，还包括PCR/RT-PCR试剂。PCR/RT-PCR试剂为市售的PCR/RT-PCR试剂。进一步地，微孔的孔壁突出于微孔与相邻微孔之间的第一连接区域以及微孔与微孔板侧壁之间的第二连接区域。进一步地，微孔板盖的顶面可拆卸地设置有辅电磁吸盘。进一步地，还包括盒体。进一步地，还包括与盒体的内壁贴合的支架；支架上设置有微孔板槽、微孔板盖槽、主电磁吸盘槽、辅电磁吸盘槽、磁珠试剂瓶槽和荧光标记试剂瓶槽。进一步地，支架上还设置有PCR/RT-PCR试剂槽、辅助引物试剂瓶槽。进一步地，微孔包括彼此连通的上混合区和下分选区；下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积。可选地，每个微孔中包括多个下分选区。进一步地，微孔板上微孔的排列阵列方式是8×12。进一步地，微孔板的一对互相平行的侧立面上均设置有槽口，用于机器手握持。可选地，下分选区的纵剖面呈梯形或扇形。可选地，下分选区呈顶面小底面大的圆台状。可选地，微孔的孔壁内侧设置有侧壁凸起，使得下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积。可选地，微孔的底部内侧设置有底部凸起，使得下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积。可选地，底部凸起呈T字形、倒L字型或倒梯形。本实用新型的基于磁珠的检测分型试剂盒，将磁珠、荧光标记和PCR/RT-PCR相结合，实现了高通量、快速、灵敏地对病毒亚型进行分型检测。因此，该试剂盒具有很重要的应用价值。引物连接在磁珠上比固定在容器底部更有利于提高PCR/RT-PCR效率，因为相对于固定引物，磁珠仅在主电磁吸盘通电时产生的磁场作用下处于容器底部，一旦断开主电磁吸盘的电源，磁场消失，磁珠又可以很容易的离开容器底部，因此，磁珠上的引物可以更好的与其他试剂混合。由于不同亚型的病毒对应不同的荧光标记，且生成的PCR/RT-PCR产物是结合在磁珠上的，因此可以通过磁性吸附作用将结合在磁珠上的PCT/RT-PCR产物与没有发生PCR/RT-PCR反应的荧光标记引物分离开，避免其他荧光信号的影响，从而可以采用酶标仪或流式细胞仪读出检测结果。无需实验室配备实时定量RT-PCR相关设备，以及设计相关探针。主电磁吸盘和下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积，这两个技术特征的设定使得磁珠在重力和磁场作用下进入下分选区，且不易从下分选区出来，从而有利于磁珠的固定吸附，将结合在磁珠上的物质与未结合上磁珠的物质进行分离，达到将PCR产物与其他物质有效分离的目的。此外，主电磁吸盘还有利于微孔板中的物质混合。即可以采用能被主电磁吸盘吸住的机器手臂来混匀微孔内的反应物。辅电磁吸盘和主电磁吸盘可互相吸引，使得微孔板盖盖的更紧。使用时还可通过交替开启和关闭辅电磁吸盘和主电磁吸盘，使得磁珠在微孔底部和微孔顶部之间来回运动，从而达到混匀或洗涤以完全洗去未发送扩增反应的荧光标记反向引物的目的。下分选区较小的上表面面积有利于延长磁珠在微孔底部和顶部来回运动的时间，使得磁珠在微孔底部、微孔顶部和顶部底部之间的时间更加均衡，从而有利于混匀和洗涤，提高了分选得率和检测灵敏度。本实用新型的微孔构造有利于分离比重不同的物质，尤其是溶液中沉淀的分离，为改良生物医学检验领域的技术方法提供了新的基础。以下将结合附图对本实用新型的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本实用新型的目的、特征和效果。附图说明图1是本实用新型所涉及的支架的一个具体实施例的结构示意图；图2是微孔板阵列模式图；图3是实施例2的荧光检测结果示意图；图4是本实用新型所涉及的微孔板、微孔板盖、主电磁吸盘、辅电磁吸盘的结构示意图；图5是图4中的A-A剖视图用于展示一个具体实施例的微孔结构；图6是图4中的A-A剖视图用于展示另一个具体实施例的微孔结构；图7是本实用新型所涉及的微孔板盖的侧面结构示意图。具体实施方式下面具体实施例结合附图对本实用新型做进一步阐述，但应理解为这些实施例仅限于说明本实用新型而不限制本实用新型的范围。下面采用检测甲型流感病毒H1N1、H5N1和H7N9亚型为例来说明本实用新型。羧基磁珠为市售的羧基磁珠，比如在下述实施例中羧基磁珠购自中科雷鸣(北京)科技有限公司。RT-PCR试剂为市售的RT-PCR试剂，在下述实施例中RT-PCR试剂来自天根一步RT-PCR试剂盒(QIAGENOnestepRT-PCRKit)。下述实施例中所用到的试剂除特别说明外，均可以从市场上购买到。主要仪器：Bio-Rad_MycyclerPCR仪、Bio-RadiMark酶标仪。实施例1本实施例的基于磁珠的检测分型试剂盒由微孔板、与微孔板匹配的微孔板盖、可拆卸地设置在微孔板底部的主电磁吸盘、可拆卸地设置在微孔板盖顶面的辅电磁吸盘、磁珠试剂瓶、荧光标记试剂瓶、辅助引物试剂瓶、RT-PCR试剂、盒体和与盒体的内壁贴合的支架组成。磁珠试剂瓶内装盛有连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠。磁珠连接正向引物由5’端的连接分子和3’端的核心引物组成，其中连接分子为-NH2-(CH2)6-；核心引物的序列如SEQIDNO.1到SEQIDNO.3所示。SEQIDNO.1所示的序列来自甲型流感病毒H1N1亚型；SEQIDNO.2所示的序列来自甲型流感病毒H5N1亚型；SEQIDNO.3所示的序列来自甲型流感病毒H7N9亚型。以上3种连接有不同磁珠连接正向引物的羧基磁珠都等比例(m/m)地装在磁珠试剂瓶内。荧光标记试剂瓶内装盛有5’端带荧光标记的反向引物。带荧光标记的反向引物的序列如SEQIDNO.4到SEQIDNO.6所示。SEQIDNO.4所示的序列来自甲型流感病毒H1N1亚型，SEQIDNO.4所示的序列的5’端的荧光标记是CY5；SEQIDNO.5所示的序列来自甲型流感病毒H5N1亚型，SEQIDNO.5所示的序列的5’端的荧光标记是VIC；SEQIDNO.6所示的序列来自甲型流感病毒H7N9亚型，SEQIDNO.6所示的序列的5’端的荧光标记是FAM。以上3种5’端带荧光标记的反向引物均等比例(等物质的量)地装在荧光标记试剂瓶内。辅助引物试剂瓶内装盛有辅助引物。辅助引物的序列如SEQIDNO.7到SEQIDNO.9所示，其中SEQIDNO.7所示的序列来自甲型流感病毒H1N1亚型；SEQIDNO.8所示的序列来自甲型流感病毒H5N1亚型；SEQIDNO.9所示的序列来自甲型流感病毒H7N9亚型。以上3种辅助引物也均等比例(等物质的量)地装在辅助引物试剂瓶内。如图1所示，支架上设置有微孔板槽32、微孔板盖槽33、主电磁吸盘槽34、辅电磁吸盘槽35、RT-PCR试剂槽36、磁珠试剂瓶槽37、荧光标记试剂瓶槽38和辅助引物试剂瓶槽39。如图2所示，微孔板包括多个微孔。如图5和3所示，微孔11的孔壁14突出于与相邻微孔11之间的第一连接区域13，也突出于与微孔板侧壁16之间的第二连接区域15。微孔板侧壁16突出于第二连接区域15。微孔板盖2上设置有与微孔11的内径匹配的环形凸起21(如图7所示)。微孔板1与微孔板盖2被设置为可放置入PCR仪中，起到代替PCR管和PCR架的作用。5’端带荧光标记的反向引物与辅助引物的物质的量的比例为10～20:1。由于5’端带荧光标记的反向引物的量是辅助引物的10到20倍，因此没有与辅助引物搭配进行RT-PCR扩增的5’端带荧光标记的反向引物可以与羧基磁珠上连接的正向引物匹配进行RT-PCR扩增，从而将目的基因连接到羧基磁珠上，避免RT-PCR扩增只发生在反向引物与辅助引物之间。实施例21、引物序列与质粒中的插入基因序列根据Genebank数据库中甲型流感病毒H1N1、H5N1和H7N9的HA基因序列，设计相应地核心引物、5’端带荧光标记的反向引物(表1中简称反向引物)和辅助引物，序列如表1所示。表1引物序列在H1N1反向引物5’端连上荧光标记CY5，形成荧光标记为CY5的H1N1反向引物；在H5N1反向引物5’端连上荧光标记VIC，形成荧光标记为VIC的H5N1反向引物；在H7N9反向引物5’端连上荧光标记FAM，形成荧光标记为FAM的H7N9反向引物。在本实施例中5’端的连接分子为-NH2-(CH2)6-。因此H1N1、H5N1和H7N9各自对应的磁珠连接正向引物分别为5’-NH2-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTTTTCCACAACGGAAAACTATGT-3’，5’-NH2-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTTTTCATGTCCATACCATGGGAG-3’和5’-NH2-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTTTTGAGGCAATGCAAAATAGAATACAGAT-3’。以上引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将表1中3种亚型的HA基因的辅助引物和反向引物所扩增的基因序列加上特定的接头序列后，碱基数为80-160bp(如表2所示)，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成并连接到pGEM_T载体质粒上，且将各亚型的质粒定量为1μg/ml。表2各亚型的质粒插入的基因序列2、制备连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠配置连接液：0.1M2-吗啉乙磺酸，0.25％(v/v)吐温-20，10mM碳二亚胺盐酸盐，用盐酸和/或氢氧化钠调pH值至5。配置纯化缓冲液：10mMpH7.4的PBS，0.25％(v/v)吐温-20。配置磁珠保存液：20nmol/μl的Tris碱，20mmol/μl氯化镁，50mmol/μl氯化钾，0.25％(v/v)吐温-20，0.5％(m/m)的BSA。以制备连接有H1N1的磁珠连接正向引物的羧基磁珠为例：取1mg粒径200nm的表面修饰有羧基的磁珠，用200μl、0.01M的氢氧化钠溶液以及去离子水分别清洗磁珠；然后向磁珠中加入1nmolH1N1的磁珠连接正向引物(连接分子为-NH2-(CH2)6-，核心引物的序列如SEQIDNO.1所示)和100μl的连接液，室温孵育5h，用混匀器轻微摇动；然后用磁分离器将连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠分离出来，用纯化缓冲液清洗2次；最后将清洗后的连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠4℃保存在100μl的磁珠保存液中备用。同理制备连接有H5N1的磁珠连接正向引物的羧基磁珠，只是将H1N1的磁珠连接正向引物替换为H5N1的磁珠连接正向引物(连接分子为-NH2-(CH2)6-，核心引物的序列如SEQIDNO.2所示)。同理制备连接有H7N9的磁珠连接正向引物的羧基磁珠，只是将H1N1的磁珠连接正向引物替换为H7N9的磁珠连接正向引物(连接分子为-NH2-(CH2)6-，核心引物的序列如SEQIDNO.3所示)。3、病毒RNA的提取取甲型流感病毒采样液200μl，加入500μl裂解液，按RNeasyMiniKit(QIAGEN公司，货号#74104)说明书提取病毒RNA50μl。4、RT-PCR反应(1)体系配置：使用QIAGENOnestepRT-PCRKit(货号#210212)反应液。体系配置具体如表3所示。表3RT-PCR反应体系配置组分体积(μl)5×QIAGENOnestepRT-PCR缓冲液1010mMdNTP2QIAGENOnestepRT-PCR酶混合液2RNase抑制剂0.2连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠#10(μg)5’端带荧光标记的反向引物*1辅助引物**1模板##10无RNase的水至50#连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠为连接有H1N1的磁珠连接正向引物的羧基磁珠、连接有H5N1的磁珠连接正向引物的羧基磁珠和连接有H7N9的磁珠连接正向引物的羧基磁珠等比例(m/m)混合物。*5’端带荧光标记的反向引物为荧光标记为CY5的H1N1反向引物、荧光标记为VIC的H5N1反向引物和荧光标记为FAM的H7N9反向引物等比例(物质的量之比)混合液。**辅助引物为H1N1辅助引物、H5N1辅助引物和H7N9辅助引物等比例(物质的量之)混合液。##模板根据上样到不同的微孔中而分别为：病毒RNA提取物、p-H1N1、p-H5N1、p-H7N9、阴性对照(无RNase的水)、p-H1N1的10倍稀释液、p-H1N1的100倍稀释液、p-H5N1的10倍稀释液、p-H5N1的100倍稀释液、p-H7N9的10倍稀释液和p-H7N9的100倍稀释液。在本实施例中各模板在微孔板(本实施例中该微孔板为8×12的96孔板)上的上样位置如图2所示为：p-H1N1：A1、B12、G11、H2和E7；p-H5N1：A2、B11、G12、H1和D7；p-H7N9：B2、A11、H12、G1和D6；阴性对照：B1、A12、H11、G2和E6；p-H1N1的10倍稀释液：B3、B4和B5；p-H1N1的100倍稀释液：C3、C4和C5；p-H5N1的10倍稀释液：D3、D4和D5；p-H5N1的100倍稀释液：E3、E4和E5；p-H7N9的10倍稀释液：F3、F4和F5；p-H7N9的100倍稀释液：G3、G4和G5；病毒RNA提取物：其余的微孔。(2)反应程序回到第5步，40个循环；72℃10分钟；4℃保存。按照表3所列的体系加入本实用新型所涉及的微孔板中。然后盖紧微孔板盖，放入PCR仪，按照上述反应程序开始RT-PCR反应。5、后处理反应结束后，将微孔板从PCR仪中取出，打开微孔板盖；然后将主电磁吸盘装设在微孔板底部并接通主电磁吸盘的电源，将磁珠吸附在微孔底部；然后用移液器小心吸走微孔中的液体，勿吸走磁珠。加入无RNase的水到微孔中清洗去除残留的未与磁珠结合的5’端带荧光标记的反向引物。具体方式是：盖上并盖紧微孔板盖，注意确保微孔板盖以与RT-PCR反应时相同的对应方式盖在微孔板上，即原先是微孔板盖的A1与微孔板的A1对应的，那么再次盖上时也要保证微孔板盖的A1与微孔板的A1对应，从而避免不同微孔之间反应产物的交叉污染。将辅电磁吸盘安装到微孔板盖的上表面，接通辅电磁吸盘的电源的同时关闭主电磁吸盘的电源，使得位于微孔底部的磁珠向微孔盖方向移动。然后关闭辅电磁吸盘的电源的同时开启主电磁吸盘的电源，使得磁珠又从微孔的顶部向底部移动。如此往复数次后，停留在关闭辅电磁吸盘的电源的同时开启主电磁吸盘的电源的状态，使得磁珠吸附在微孔底部。然后用移液器将吸走微孔中的液体，保留磁珠。6、荧光检测将微孔板放入酶标仪或流式细胞仪中，采用CY5、VIC和FAM对应的激发波长及检测波长进行检测。CY5的激发波长620-650nm，检测波长675-730nm；VIC的激发波长500-535nm，检测波长560-580nm；FAM的激发波长450-490nm，检测波长515-530nm。图3给出了检测结果示意图。对于3组阳性对照(p-H1N1、p-H5N1和p-H7N9)的5个重复，均能检测出相应的荧光标记，这说明检测的重复性好和特异性强；对于阴性对照的5个重复均没有检测出荧光标记，证明试验结果可采用；对于稀释100倍的3组阳性对照依然能检测出相应的荧光标记，说明灵敏度高和特异性强。B7、C9检测到CY5荧光标记，证明B7和C9位置的甲型流感病毒亚型为H1N1；F8、F9和H10检测到VIC荧光标记，证明F8、F9和H10位置的甲型流感病毒亚型为H5N1；D9和E10检测到FAM荧光标记，证明D9和E10位置的甲型流感病毒亚型为H7N9。其余的加入了病毒RNA提取物的微孔没有检测到荧光标记，则说明它们的亚型不在H1N1、H5N1和H7N9之中。因此，本实用新型的基于磁珠的检测分型试剂盒能够快速、简便的区分出甲型流感病毒的3种亚型，而且重复性好，灵敏度高，特异性强。对于特异性来说，还可以进一步的采用更多的病毒类型来进行验证，本实用新型仅验证了H1N1、H5N1和H7N9之间的特异性。故本实用新型中的特异性高仅指在H1N1、H5N1和H7N9之中的特异性高。本实用新型另外做的些小改进可以是：在一些实施例中，微孔板1的一对互相平行的侧立面上均设置有槽口12，用于机器手握持。在一些实施例中，微孔板1包括多个微孔11。微孔11包括彼此连通的上混合区和下分选区。如图5和图6所示，微孔11中，虚线以上为上混合区，虚线以下为下分选区。下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积。在一些实施例中，下分选区的纵剖面呈梯形(如图5所示)或扇形。在一些实施例中，如图5所示，微孔11的孔壁14内侧(即内侧壁141)设置有侧壁凸起17使得下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积。在一些实施例中，如图6所示，微孔11的底部内侧设置有底部凸起18使得下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积，且底部凸起18呈T字形。在图6所示的实施例中，每个微孔11中包括2个下分选区，1个上混合区。下分选区的数目不限于2个，可以是1个或3个及以上。以上详细描述了本实用新型的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本实用新型的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本
技术领域：
中技术人员依本实用新型的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。当前第1页1 2 3