包含抗4-1BB克隆20H4.9的双特异性抗原结合分子的制作方法

发明领域本发明涉及新的双特异性抗原结合分子,其包含至少一个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块,和由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。本发明进一步涉及生成这些分子的方法和使用它们的方法。发明背景tnf受体超家族的一个成员,4-1bb(cd137)最初被鉴定为其表达通过t细胞活化而诱导的分子(kwony.h.andweissmans.m.(1989),proc.natl.acad.sci.usa86,1963-1967)。后续研究证明4-1bb在t和b淋巴细胞(snelll.m.etal.(2011)immunol.rev.244,197-217或zhangx.etal.(2010),j.immunol.184,787-795),nk细胞(linw.etal.(2008),blood112,699-707),nkt细胞(kimd.h.etal.(2008),j.immunol.180,2062-2068),单核细胞(kienzleg.andvonkempisj.(2000),int.immunol.12,73-82或schwarzh.etal.(1995),blood85,1043-1052),嗜中性细胞(heinischi.v.etal.(2000),eur.j.immunol.30,3441-3446),肥大细胞(nishimotoh.etal.(2005),blood106,4241-4248)和树突细胞以及非造血起源的细胞诸如内皮和平滑肌细胞(brollk.etal.(2001),am.j.clin.pathol.115,543-549或olofssonp.s.etal.(2008),circulation117,1292-1301)中的表达。4-1bb在不同细胞类型中的表达大多通过各种刺激性信号,诸如t细胞受体(tcr)或b细胞受体触发,以及经由共刺激性分子或促炎性细胞因子的受体诱导的信号传导(diehll.etal.(2002),j.immunol.168,3755-3762；vonkempisj.etal.(1997),osteoarthritiscartilage5,394-406；zhangx.etal.(2010),j.immunol.184,787-795)而可诱导和驱动。已知cd137信号传导刺激nk细胞的ifnγ分泌和增殖(buechelec.etal.(2012),eur.j.immunol.42,737-748；linw.etal.(2008),blood112,699-707；meleroi.etal.(1998),cellimmunol.190,167-172)以及促进dc活化(如通过其升高的存活和分泌细胞因子的能力指示的)并上调共刺激性分子(choib.k.etal.(2009),j.immunol.182,4107-4115；futagawat.etal.(2002),int.immunol.14,275-286；wilcoxr.a.etal.(2002),j.immunol.168,4262-4267)。然而,cd137最好表征为调控t细胞的cd4+和cd8+子集二者中的tcr诱导的活化的共刺激性分子。与tcr触发组合,激动性4-1bb特异性抗体增强t细胞的增殖,刺激淋巴因子分泌并降低t淋巴细胞对活化诱导的细胞死亡的敏感性(snelll.m.etal.(2011)immunol.rev.244,197-217)。与在体外4-1bb抗体对t细胞的这些共刺激效应一致,在许多实验性肿瘤模型中将其施用于荷瘤小鼠导致有力的抗肿瘤效果(meleroi.etal.(1997),nat.med.3,682-685；narazakih.etal.(2010),blood115,1941-1948)。体内消减实验证明cd8+t细胞在4-1bb特异性抗体的抗肿瘤作用中发挥最关键的作用。然而,取决于肿瘤模型或组合疗法(其包括抗4-1bb),已经报告了其它类型的细胞诸如dc,nk细胞或cd4+t细胞的贡献(murilloo.etal.(2009),eur.j.immunol.39,2424-2436；staggj.etal.(2011),proc.natl.acad.sci.usa108,7142-7147)。看来4-1bb激动性抗体在体内的免疫调控特性需要抗体分子上野生型fc部分的存在,由此暗示fc受体结合是此类试剂的药理学活性需要的重要事件,正如关于对tnfr超家族的其它凋亡诱导性或免疫调控性成员特异性的激动性抗体已经描述的(lif.andravetchj.v.(2011),science333,1030-1034；tengm.w.etal.(2009),j.immunol.183,1911-1920)。然而,在小鼠中,具有功能性活性fc域的4-1bb特异性激动性抗体的系统施用也诱导与肝毒性相关的cd8+t细胞扩充(dubrotj.etal.(2010),cancerimmunol.immunother.59,1223-1233),这在功能性fc受体缺失下减弱或显著减轻。urelumab(bms-666513,克隆10c7)是一种完全人的,激动性非配体阻断性单克隆igg4抗体,其结合4-1bb胞外域。它作为20h4.9-igg4披露于美国专利no.7,288,638。在人临床试验(clinicaltrials.gov,nct00309023和nct00612664)中,12周里每三周一次施用urelumab在具有黑素瘤,卵巢或肾细胞癌的患者中诱导疾病的稳定化。然而,由于该抗体引起4级肝炎,导致两例肝毒性相关死亡的发生,试验终止(simeonee.andasciertop.a.(2012),j.immunotoxicology9,241-247)。后续对临床安全性数据的详细分析证明重度转氨酶升高(transaminitis)的发生主要是由给予的urelumab的剂量触发的。还观察到级别2+嗜中性细胞减少,白细胞减少和血小板减少。后续对临床安全性数据的详细分析证明重度转氨酶升高的发生主要是由给予的urelumab的剂量触发的。在2012年,urelumab重新进入临床开发,然而在使用每三周给予<1mg/kg的剂量条件下。当前的推荐剂量是每三周给予0.1mg/kg(n.segaletal.(2016),resultsfromanintegratedsafetyanalysisofurelumab,anagonistanti-cd137monoclonalantibody,clin.cancerres.,publishedonlinedecember1,2016)。鉴于该剂量限制性毒性,如此,需要改良的对4-1bb特异性的抗原结合分子,它应当仅仅在肿瘤特异性部位起作用以避免不可控制的副作用。本发明的双特异性抗原结合分子将能够优选地与肿瘤特异性或肿瘤相关抗原结合的抗原结合域与至少一个能够激动性结合4-1bb的抗原结合域组合。本发明的双特异性抗原结合分子可能能够不仅有效触发4-1bb,而且非常选择性地在期望部位触发4-1bb,由此减轻不想要的已经对常规单特异性抗体诸如urelumab观察到的副作用。发明概述本发明涉及组合至少一个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域与至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域的双特异性抗原结合分子,特别是其中该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含重链可变区(vh4-1bb),该重链可变区(vh4-1bb)包含(i)包含seqidno:1的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:2的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:3的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vl4-1bb),该轻链可变区(vl4-1bb)包含(iv)包含seqidno:4的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:5的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:6的氨基酸序列的cdr-l3。这些双特异性抗原结合分子是有利的,因为它们会优选在靶细胞抗原表达的部位激活4-1bb,这是由于它们针对靶细胞抗原的结合能力和身体其它部位降低的激活所致,由此避免单独对4-1bb特异性的抗原结合分子的副作用。另外,本发明的双特异性抗原结合分子包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域,特别是iggfc域,其增强双特异性抗原结合分子的药理学和药动学特性。在一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含至少一个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域和由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域,其中该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含重链可变区(vh4-1bb),该重链可变区(vh4-1bb)包含(i)包含seqidno:1的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:2的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:3的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vl4-1bb),该轻链可变区(vl4-1bb)包含(iv)包含seqidno:4的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:5的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:6的氨基酸序列的cdr-l3。在一个特定方面,该双特异性抗原结合分子包含至少一个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,其包含重链可变区(vh4-1bb),该重链可变区(vh4-1bb)包含与seqidno:7的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vl4-1bb),该轻链可变区(vl4-1bb)包含与seqidno:8的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。更加特别地,该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区(vh4-1bb)和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区(vl4-1bb)。在一个方面,该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域是fab片段。在又一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其包含至少一个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域和由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域,其中该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含重链可变区(vh4-1bb),该重链可变区(vh4-1bb)包含(i)包含seqidno:1的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:2的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:3的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vl4-1bb),该轻链可变区(vl4-1bb)包含(iv)包含seqidno:4的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:5的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:6的氨基酸序列的cdr-l3,和其中该靶细胞抗原选自由成纤维细胞激活蛋白(fap),黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(mcsp),表皮生长因子受体(egfr),癌胚抗原(cea),cd19,cd20和cd33组成的组。在一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域是能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(fap)的抗原结合域。特别地,提供了一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(fap)的抗原结合域包含(a)重链可变区(vhfap),该重链可变区(vhfap)包含(i)包含seqidno:9的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:10的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:11的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlfap),该轻链可变区(vlfap)包含(iv)包含seqidno:12的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:13的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:14的氨基酸序列的cdr-l3,或(b)重链可变区(vhfap),该重链可变区(vhfap)包含(i)包含seqidno:15的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:16的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:17的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlfap),该轻链可变区(vlfap)包含(iv)包含seqidno:18的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:19的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:20的氨基酸序列的cdr-l3。在又一个方面,该能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(fap)的抗原结合域包含(a)重链可变区(vhfap),该重链可变区(vhfap)包含与seqidno:21的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlfap),该轻链可变区(vlfap)包含与seqidno:22的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,或(b)重链可变区(vhfap),该重链可变区(vhfap)包含与seqidno:23的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlfap),该轻链可变区(vlfap)包含与seqidno:24的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。而且,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合fap的抗原结合域包含包含seqidno:23的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:24的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合fap的抗原结合域包含包含seqidno:21的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:22的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域是能够特异性结合癌胚抗原(cea)的抗原结合域。特别地,提供了一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合癌胚抗原(cea)的抗原结合域包含(a)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含(i)包含seqidno:25的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:26的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:27的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含(iv)包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:29的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:30的氨基酸序列的cdr-l3,或(b)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含(i)包含seqidno:33的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:34的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:35的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含(iv)包含seqidno:36的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:37的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:38的氨基酸序列的cdr-l3,或(c)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含(i)包含seqidno:179的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:180的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:181的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含(iv)包含seqidno:182的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:183的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:184的氨基酸序列的cdr-l3,或(d)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含(i)包含seqidno:187的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:188的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:189的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含(iv)包含seqidno:190的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:191的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:192的氨基酸序列的cdr-l3。在另一个方面,该能够特异性结合癌胚抗原(cea)的抗原结合域包含(a)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含与seqidno:31的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含与seqidno:32的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,或(b)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含与seqidno:39的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含与seqidno:40的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,或(c)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含与seqidno:185的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含与seqidno:186的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,或(d)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含与seqidno:193的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含与seqidno:194的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。在一个特定方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合cea的抗原结合域包含包含seqidno:31的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:32的氨基酸序列的轻链可变区。在又一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合cea的抗原结合域包含包含seqidno:39的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:40的氨基酸序列的轻链可变区。在又一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合cea的抗原结合域包含包含seqidno:185的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:186的氨基酸序列的轻链可变区。在还有又一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合cea的抗原结合域包含包含seqidno:193的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:194的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域是能够特异性结合cd19的抗原结合域。特别地,提供了一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合cd19的抗原结合域包含(a)重链可变区(vhcd19),该重链可变区(vhcd19)包含(i)包含seqidno:155的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:156的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:157的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcd19),该轻链可变区(vlcd19)包含(iv)包含seqidno:158的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:159的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:160的氨基酸序列的cdr-l3,或(b)重链可变区(vhcd19),该重链可变区(vhcd19)包含(i)包含seqidno:163的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:164的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:165的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcd19),该轻链可变区(vlcd19)包含(iv)包含seqidno:166的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:167的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:168的氨基酸序列的cdr-l3。在另一个方面,该能够特异性结合cd19的抗原结合域包含(a)重链可变区(vhcd19),该重链可变区(vhcd19)包含与seqidno:161的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlcd19),该轻链可变区(vlcd19)包含与seqidno:162的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,或(b)重链可变区(vhcd19),该重链可变区(vhcd19)包含与seqidno:169的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlcd19),该轻链可变区(vlcd19)包含与seqidno:170的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。在一个特定方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合cd19的抗原结合域包含包含seqidno:161的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:162的氨基酸序列的轻链可变区。在又一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合cd19的抗原结合域包含包含seqidno:169的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:170的氨基酸序列的轻链可变区。在一个方面,该双特异性抗原结合分子是人,人源化或嵌合抗体。特别地,该双特异性抗原结合分子包含iggfc域,特别是igg1fc域或igg4fc域。在又一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中fc域包含一处或多处降低抗体对fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸替代。特别地,该fc域是人igg1亚类的,具有氨基酸突变l234a,l235a和p329g(编号方式依照kabateu索引)。在又一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中fc域包含促进fc域的第一和第二亚基联合的修饰。在一个特定的方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其中依照节入穴方法,fc域的第一亚基包含节且fc域的第二亚基包含穴。更加特别地,该fc域的第一亚基包含氨基酸替代s354c和t366w(编号方式依照kabateu索引)且该fc域的第二亚基包含氨基酸替代y349c,t366s,l368a和y407v(编号方式依照kabateu索引)。在另一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含超过一个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,其中每个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含重链可变区(vh4-1bb),该重链可变区(vh4-1bb)包含(i)包含seqidno:1的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:2的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:3的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vl4-1bb),该轻链可变区(vl4-1bb)包含(iv)包含seqidno:4的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:5的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:6的氨基酸序列的cdr-l3。在一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)两个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,(b)一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在一个特定方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)两个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,(b)一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域,和(c)包含一处或多处降低抗原结合分子对fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸替代的iggfc域。更加特别地,该iggfc域包含一处或多处降低抗原结合分子对fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸替代。如此,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中该双特异性抗原结合分子对于4-1bb是二价的且对于靶细胞抗原是单价的。在一个方面,该双特异性抗原结合分子包含(a)包含两个能够特异性结合4-1bb的fab片段和fc域的抗体的两条轻链和两条重链,和(b)能够特异性结合靶细胞抗原的vh和vl域,其中该vh域经由肽接头连接至该两条重链之一的c端且其中该vl域经由肽接头连接至第二重链的c端。在又一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:44的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:45的氨基酸序列的第二重链,或(b)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:49的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:50的氨基酸序列的第二重链。在另一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,包含(a)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:65的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:66的氨基酸序列的第二重链,或(b)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:69的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:70的氨基酸序列的第二重链,或(c)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:73的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:74的氨基酸序列的第二重链,或(d)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:77的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:78的氨基酸序列的第二重链。在又一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)包含两个能够特异性结合4-1bb的fab片段和fc域的抗体的两条轻链和两条重链,和(b)经由肽接头连接至该两条重链之一的c端的能够特异性结合该靶细胞抗原的交叉fab片段。在一个特定方面,该交叉fab片段能够特异性结合fap,cea或cd19。更加特别地,该交叉fab片段能够特异性结合cea。在另一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:211的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:212的氨基酸序列的第二重链,和包含seqidno:213的氨基酸序列的别的轻链,或(b)每条包含seqidno:216的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:214的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:215的氨基酸序列的第二重链,和包含seqidno:217的氨基酸序列的别的轻链。在另一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)四个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,(b)一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。如此,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中该双特异性抗原结合分子对于4-1bb是四价的且对于靶细胞抗原是单价的。在一个特定方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中该四个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域是fab片段且其每两个彼此融合,任选经由肽接头。在一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域包含vh和vl域且其中该vh域经由肽接头连接至该fc域的第一亚基的c端且该vl域经由肽接头连接至该fc域的第二亚基的c端。在又一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四个轻链,包含seqidno:57的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:58的氨基酸序列的第二重链,或(b)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四个轻链,包含seqidno:61的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:62的氨基酸序列的第二重链。在另一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四个轻链,包含seqidno:81的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:82的氨基酸序列的第二重链,或(b)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四个轻链,包含seqidno:85的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:86的氨基酸序列的第二重链,或(c)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四个轻链,包含seqidno:89的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:90的氨基酸序列的第二重链,或(d)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四个轻链,包含seqidno:93的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:94的氨基酸序列的第二重链。依照本发明的另一个方面,提供了一种分离的多核苷酸,其编码如之前本文中描述的双特异性抗原结合分子。本发明进一步提供一种载体,特别是表达载体,其包含本发明的分离的多核苷酸和一种宿主细胞,其包含本发明的分离的多核苷酸或载体。在一些方面,该宿主细胞是真核细胞,特别是哺乳动物细胞。在另一个方面,提供的是一种用于生成如之前本文中描述的双特异性抗原结合分子的方法,其包括下述步骤:(i)在适合于该抗原结合分子表达的条件下培养本发明的宿主细胞,并(ii)回收该抗原结合分子。本发明还涵盖通过本发明的方法生成的双特异性抗原结合分子。本发明进一步提供一种药物组合物,其包含如之前本文中描述的双特异性抗原结合分子和至少一种药学可接受赋形剂。在一个方面,该药物组合物用于治疗癌症或传染病。特别地,该药物组合物用于治疗癌症。本发明还涵盖的是如之前本文中描述的双特异性抗原结合分子,或包含该双特异性抗原结合分子的药物组合物,其用作药物。在一个方面,提供的是如之前本文中描述的双特异性抗原结合分子或本发明的药物组合物,其用于(i)刺激t细胞应答,(ii)支持激活的t细胞的存活,(iii)治疗感染,(iv)治疗癌症,(v)延迟癌症进展,或(vi)延长罹患癌症的患者的存活。在另一个方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含至少一个能够特异性结合小鼠4-1bb的抗原结合域,至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域和由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域,其中该能够特异性结合小鼠4-1bb的抗原结合域包含重链可变区(vh4-1bb),该重链可变区(vh4-1bb)包含(i)包含seqidno:171的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:172的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:173的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vl4-1bb),该轻链可变区(vl4-1bb)包含(iv)包含seqidno:174的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:175的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:176的氨基酸序列的cdr-l3。在一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合小鼠4-1bb的抗原结合域包含重链可变区(vh4-1bb),该重链可变区(vh4-1bb)包含与seqidno:177的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vl4-1bb),该轻链可变区(vl4-1bb)包含与seqidno:178的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。特别地,该能够特异性结合小鼠4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:177的氨基酸序列的重链可变区(vh4-1bb)和包含seqidno:178的氨基酸序列的轻链可变区(vl4-1bb)。在另一个具体方面,该双特异性抗原结合分子是如下的,其中该能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域结合成纤维细胞激活蛋白(fap)且包含(a)重链可变区(vhfap),该重链可变区(vhfap)包含(i)包含seqidno:9的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:10的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:11的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlfap),该轻链可变区(vlfap)包含(iv)包含seqidno:12的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:13的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:14的氨基酸序列的cdr-l3。特别地,提供的是如本文中之前描述的双特异性抗原结合分子,其中该fc域的第一亚基包含氨基酸替代k392d和k409d(编号方式依照kabateu索引)且该fc区的第二亚基包含氨基酸替代e356k和d399k(编号方式依照kabateu索引)。在一个具体的方面,提供的是如之前本文中描述的双特异性抗原结合分子,或本发明的药物组合物,其用于治疗癌症。在另一个具体的方面,本发明提供如之前本文中描述的双特异性抗原结合分子,其用于治疗癌症,其中与化疗剂,放射疗法和/或其它用于癌症免疫疗法的药剂组合施用该双特异性抗原结合分子。在又一个方面,本发明提供一种在个体中抑制肿瘤细胞生长的方法,其包括对该个体施用有效量的如之前本文中描述的双特异性抗原结合分子,或本发明的药物组合物以抑制肿瘤细胞生长。还提供的是如之前本文中描述的双特异性抗原结合分子用于制造用于在有所需要的个体中治疗疾病的药物,特别是用于制造用于治疗癌症或传染病的药物的用途,以及一种在个体中治疗疾病的方法,其包括对所述个体施用治疗有效量的组合物,其包含药学可接受形式的本发明的双特异性抗原结合分子。在一个具体的方面,该疾病是癌症。在任何上述方面,该个体是哺乳动物,特别是人。附图简述图1a和1b显示huigg1p329glala格式的双特异性抗原结合分子的实施例，其包含两个抗4-1bbfab片段(对4-1bb的二价结合)和分别在重链的c端融合的能够特异性结合靶细胞抗原的vh和vl域，例如抗fap，抗cea或抗cd19。这种格式在本文中也称作2+1格式。黑色点代表节-入-穴突变。图1a显示双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域的vl域融合至fc穴链的c端，称作穴-vl，在图1b中显示双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域的vh域融合至fc穴链的c端，称作穴-vh。图1c显示双特异性单价抗4-1bb和单价抗fap抗原结合分子(huigg1p329glala)，也称作1+1格式。抗fap是交换fab，意味着重链包含vl-ch1，而轻链包含vh-cl，且抗4-1bb是具有带电荷变体的fab。图1d和1e显示huigg1p329glala格式的双特异性抗原结合分子，其包含两个抗4-1bbfab片段(对4-1bb的二价结合)和在重链之一的c端融合的能够特异性结合靶细胞抗原的交叉fab，例如抗fap，抗cea或抗cd19。这种格式称作2+1交叉fab格式。图1d显示具有chcl交叉fab的变体，在图1e中显示具有vhvl交叉fab的变体。图1e中的三角形代表带电荷变体(cl域中位置123(eu编号方式)处的氨基酸变成精氨酸(r)和位置124(eu编号方式)处的氨基酸变成赖氨酸(k)和ch1域中位置147(eu编号方式)处和位置213(eu编号方式)处的氨基酸变成谷氨酸(e)的突变)的可能性。图2a和2b涉及双特异性2+1抗4-1bb和抗fap抗原结合分子的同时结合。图2a是测定法的设置的象形图。图2b显示双特异性抗4-1bb/抗fap抗原结合分子(分析物1)对固定化的人4-1bb和人fap(分析物2)的同时结合。图3显示基于fret的竞争测定法，用于评估二价(igg)抗41bb(20h4.9)抗体和二价(2+1)抗4-1bb(20h4.9)/抗fap(4b9)抗原结合分子对膜结合的4-1bb的结合。双特异性，二价(2+1)抗4-1bb(20h4.9)/抗fap(4b9)抗原结合分子像igg对应物一样竞争。图4a和4b显示huigg1p329glala格式的双特异性抗原结合分子的实施例，其包含四个抗4-1bbfab片段(对4-1bb的四价结合)和分别在重链的c端融合的能够特异性结合靶细胞抗原的vh和vl域，例如抗fap，抗cea或抗cd19。这种格式在本文中也称作4+1格式。黑色点代表节-入-穴突变。抗4-1bbfab域的每两个vhch1域彼此且与fc域融合。图4a显示双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域的vl域融合至fc穴链的c端，称作穴-vl，在图4b中显示双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域的vh域融合至fc穴链的c端，称作穴-vh。图5a和5b涉及双特异性4+1抗4-1bb/抗fap抗原结合分子的同时结合。图5a是测定法的设置的象形图。图5b显示双特异性抗4-1bb/抗fap抗原结合分子(分析物1)对固定化的人4-1bb和人fap(分析物2)的同时结合。图6显示基于fret的竞争测定法，用于评估二价(igg)抗4-1bb(20h4.9)抗体和四价(4+1)抗4-1bb(20h4.9)/抗fap(4b9)抗原结合分子对膜结合的4-1bb的结合。双特异性，四价(4+1)抗4-1bb(20h4.9)/抗fap(4b9)抗原结合分子比igg对应物更好地竞争。图7a至7d显示对静息的和激活的人t细胞的结合。将抗4-1bb抗原结合分子的浓度针对pe缀合的检测二抗的荧光强度的几何均值(mfi)绘图。通过减去空白对照(例如无一抗，仅检测二抗)的基线值对所有值进行基线校准。在上部小图中显示对静息的cd4t细胞(图7a)或激活的cd4t细胞(图7b)的结合。在下部小图中显示对静息的cd8t细胞(图7c)和激活的cd8t细胞(图7d)的结合。只有含有4-1bb结合域的抗原结合分子，像4-1bb(20h4.9)huigg1p329glala(黑色实心菱形)，双特异性抗4-1bb(20h4.9)/抗fap(4b9)2+1抗原结合分子(黑色实心三角形，点线)和抗4-1bb(20h4.9)/抗fap(4b9)4+1抗原结合分子(灰色实心方形)有效结合4-1bb表达性细胞。用对照分子dp47(种系对照)huigg1p329glala(空心黑色圆形，点线)检测不到结合。在图8a和8b中显示对激活的人t细胞的结合。在此图中展示图7c和7d的曲线下面积。在图8a中显示对激活的cd8+t细胞的结合而图8b图示对激活的cd4+t细胞的结合。分别显示抗体4-1bb(20h4.9)huigg1p329glala(黑色)，双特异性抗原结合分子4-1bb(20h4.9)xfap(4b9)2+1(格子)，双特异性抗原结合分子4-1bb(20h4.9)xfap(4b9)4+1(斜条纹)和对照分子dp47huigg1p329glala。在图9a和9b中显示对人fap表达性细胞的结合。将4-1bb结合分子的浓度针对pe缀合的检测二抗的荧光强度的几何均值(mfi)绘图。通过减去空白对照(例如无一抗，仅检测二抗)的基线值对所有值进行基线校准。在图9a中显示对中等fap表达性人黑素瘤细胞系wm-266-4的结合而在图9b中显示对高fap表达性nih/3t3-hufap克隆19细胞的结合。只有包含fap抗原结合域的抗原结合分子，像4-1bb(20h4.9)xfap(4b9)2+1(黑色实心三角形和点线)和4-1bb(20h4.9)xfap(4b9)4+1(实心灰色方形)有效结合至fap表达性细胞。对非fap靶向性分子抗4-1bb(20h4.9)huigg1p329glala(黑色实心三角形)和对照分子dp47huigg1p329glala(空心黑色圆形，点线)检测不到结合。图10a至10c显示4-1bb表达性报告细胞系hela-hu4-1bb-nfκb-luc中nfκb介导的萤光素酶表达。将4-1bb结合分子的浓度针对温育6小时后测量的释放光单位(url)绘图。通过减去空白对照(例如不添加抗体)的基线值对所有值进行基线校准。在图10a中显示不依赖fap靶的4-1bb激活，其中在没有任何fap介导的交联的报告细胞系中4-1bb结合诱导nfκb控制的萤光素酶表达。在图10b中添加fap中等表达性人黑素瘤细胞系wm-266-4而在图10c中添加高fap表达性nih/3t3-hufap克隆19，对报告细胞系的比为5:1。fap表达性细胞引起fap靶向性4-1bb结合分子的交联且提高它们在4-1bb表达性报告细胞系中诱导nfκb介导的萤光素酶激活的潜力。图10d和10e显示4-1bb表达性报告细胞系hela-hu4-1bb-nfκb-luc中nfκb介导的萤光素酶表达活性。将fap靶向性激动性4-1bb结合构建物4-1bb(20h4.9)xfap(4b9)1+1(黑色菱形)或它的对照的浓度针对温育6小时后测量的释放光单位(url)绘图。通过减去空白对照(例如不添加抗体)的基线值对所有值进行基线校准。在图10d中显示不依赖于fap靶的4-1bb激活，其中在没有任何fap介导的交联的报告细胞系中4-1bb结合诱导nfκb控制的萤光素酶表达。在图10e中添加fap表面表达性人黑素瘤细胞系wm-266-4，对报告细胞系的比为5:1。fap表达性wm-266-4细胞引起双特异性结合4-1bb(20h4.9)xfap(4b9)1+1分子的交联且提高它在4-1bb表达性报告细胞系中诱导nfκb介导的萤光素酶激活的潜力。图11a至11c也显示4-1bb表达性报告细胞系hela-hu4-1bb-nfκb-luc中nfκb介导的萤光素酶表达。在此图中展示图10a至10c的曲线下面积。分别显示4-1bb(20h4.9)huigg1p329glala(黑色)，4-1bb(20h4.9)xfap(4b9)2+1(格子)，4-1bb(20h4.9)xfap(4b9)4+1(斜条纹)和对照分子dp47huigg1p329glala(白色)。在图12a至12d中显示在人fap表达性成纤维细胞细胞系(nih/3t3-hufap)存在下的人pbmc激活。在fap表达性细胞和cd3刺激存在下温育新鲜的分离的人pbmc引起cd4+t细胞(图12a)和cd8+t细胞(图12b)上cd25的上调以及cd4+t细胞(图12c)和cd8+t细胞(图12d)的增殖升高，如果存在fap靶向性4-1bb(20h4.9)抗原结合分子(黑色实心三角形和点线和实心灰色方形)或双特异性抗原结合分子4-1bb(12b3)xfap(4b9)4+1(黑色星形，具有另一种抗4-1bb克隆的阳性对照分子)的话。不依赖于靶向比(4+1对2+1)，两种具有4-1bb结合物克隆20h4.9的双特异性抗原结合分子均能够诱导相似的cd4和cd8t细胞激活，而包含4-1bb结合物12b3的双特异性抗原结合分子引起更少的激活效力。非fap靶向性4-1bb(20h4.9)huigg1p329glala分子(实心黑色菱形)仅仅能够提高cd4t细胞的激活和增殖至某种程度。在图13中作为曲线下面积汇总图12a至12d中显示的所有四项参数。作为阴性对照，显示非靶向性dp47huigg1p329glala分子来指示基线激活和增殖。双特异性小鼠4-1bb/fap抗原结合分子对小鼠t细胞激活的诱导在图14a至14j中显示。将激动性小鼠4-1bb抗体的添加浓度(x轴)针对y轴上的阳性细胞百分比(图14a至14h)或荧光强度均值(图14i和14j)绘图。在左边显示cd8+t细胞(图14a,14c，14e，14g和14i)的激活参数而在右边显示cd4+t细胞的激活参数(图14b，14d，14f，14h和14j)。显示的是cd8+t细胞(图14a)和cd4+t细胞(图14b)上升高的4-1bb表达，cd8+t细胞(图14c)和cd4+t细胞(图14d)上升高的cd25表达，cd8+t细胞(图14e)和cd4+t细胞(图14f)中升高的粒酶b表达，cd8+t细胞(图14g)和cd4+t细胞(图14h)升高的增殖和cd8+t细胞(图14i)和cd4+t细胞(图14j)中根据侧向散射值升高的细胞溶质结构升高。用0.5μg/ml激动性抗小鼠cd3亚美尼亚仓鼠igg(信号1)与交联的共刺激性激动性抗小鼠4-1bb抗体(信号2)组合激活小鼠t细胞引起t细胞激活升高–通过升高的4-1bb，cd25和粒酶b表达显示以及升高的增殖和细胞溶质结构(根据侧向散射的均值荧光强度)。协同效应依赖于结合4-1bb和同时交联的能力。激动性抗小鼠4-1bb抗体的交联可以通过fcγr结合(小鼠4-1bb(mu137-1)moigg1wt，黑色菱形)或通过同时结合fap(小鼠4-1bb(mu137-1)xfap(28h1)moigg1dapg2+1，灰色星形和点线)来投递。如例如通过cd4+t细胞的增殖显示的(图14h)，经由fap的交联有力得多。不结合4-1bb(非靶向性moigg1，空心灰色圆形和点线)或不结合fcγr(小鼠4-1bb(mu137-1)moigg1dapg)的抗体不能提高cd8和cd4t细胞激活超出背景。图15a和15b显示4-1bb表达性报告细胞系中nfκb介导的萤光素酶表达活性。将cea靶向性激动性4-1bb结合构建物4-1bb(20h4.9)xcea(a5b7)2+1的浓度针对温育6小时后测量的释放光单位(url)绘图。通过减去空白对照(例如不添加抗体)的基线值对所有值进行基线校准。在图15a中显示不依赖于cea靶的4-1bb激活，其中在没有任何cea介导的交联的报告细胞系中4-1bb结合诱导nfκb控制的萤光素酶表达。在图15b中添加cea表面表达性人胃腺癌细胞系mkn45，对报告细胞系的比为5:1。cea表达性mkn45细胞引起双特异性结合4-1bb(20h4.9)xcea(a4b7)2+1分子的交联且提高它在4-1bb表达性报告细胞系中诱导nfκb诱导的萤光素酶激活的潜力。auc和ec50值在图中作为均值(sd)指示。图16a显示实施例8中描述的双特异性，二价抗4-1bb/单价抗cd19抗体(称作4-1bbxcd19)的结构性2+1格式。该分子是huigg1p329glala格式的双特异性抗原结合分子，其包含两个抗4-1bbfab片段(对4-1bb的二价结合)和分别在重链的c端融合的能够特异性结合cd19的vh和vl域。黑色点代表节-入-穴突变。实施例是4-1bb(20h4.9)xcd19(2b11)或4-1bb(20h4.9)xcd19(8b8-018)。图16b显示阳性对照，单价cd19含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子(huigg1p329glala)，邻近4-1bbl(71-248)二聚体和4-1bbl(71-248)单体的ch1和cl域中具有修饰。粗黑色点代表节-入-穴修饰。*代表ch1和cl域中的氨基酸修饰(所谓的带电荷残基)。该分子记载于wo2016/075278a1且命名为cd19(2b11)x4-1bbl，因为它包含cd19结合物克隆2b11。图16c显示阴性对照，4-1bbl(71-248)二聚体融合至fc节链的c端且4-1bbl(71-248)单体融合至fc穴链的c端的非靶向性(dp47)抗原结合分子(huigg1p329glala)。在图17a中显示4-1bbxcd19构建物对cd19+人b细胞的结合，如通过针对人fc的二抗检测的。4-1bb(20h4.9)xcd19(2b11)以剂量依赖性方式以与cd19(2b11)x4-1bbl相比更低的亲和力结合人b细胞，而非靶向性dp47x4-1bbl并不结合b细胞。图17b显示不同4-1bbxcd19构建物对cd19+wsu-dlcl2细胞系的结合，如通过针对人fc的二抗检测的。4-1bb(20h4.9)xcd19(2b11)以与原代b细胞相似的方式结合cd19+wsu肿瘤细胞。4-1bb(20h4.9)xcd19(8b8-018)显示与4-1bb(20h4.9)xcd19(2b11)相比相同的结合特性。图18a和18b显示4-1bbxcd19构建物对激活的cd4+t细胞(图18a)或激活的cd8+t细胞(图18b)的结合。在纯的cd4和cd8细胞群体上对特异性结合控门。4-1bb(20h4.9)xcd19(2b11)以剂量依赖性方式但以与cd19(2b11)-4-1bbl相比略微更低的亲和力显示卓越的对4-1bb表达性cd4或cd8t细胞的结合。4-1bb(20h4.9)xcd19(018)显示与4-1bb(20h4.9)xcd19(2b11)相比相同的结合特性。在图19中显示由4-1bbxcd19构建物引起的激活的pbmc的ifn-γ释放。将总人pbmc与抗cd3和抗cd28微珠和与滴定浓度的4-1bbxcd19构建物一起温育。2天后收集上清液用于通过elisa测量ifn-γ。图20a至20c显示具有对cea的单价结合的2+1双特异性激动性4-1bb抗体特别是对抗原n(a2-b2)a的表位区，和hu4-1bb的同时结合。图20a显示测定法的设置。在图20b中显示具有chcl交叉fab的2+14-1bb(20h4.9)/cea(a5b7p)人igg1pglala构建物(分析物1)对固定化的n(a2-b2)a和人4-1bb(分析物2)的同时结合。图20c显示具有vhvl交叉fab的2+14-1bb(20h4.9)/cea(a5b7p)人igg1pglala构建物(分析物1)对固定化的n(a2-b2)a和人4-1bb(分析物2)的同时结合。在图21a至21d中分别显示双特异性分子对人4-1bb或人cea表达性细胞的结合。将双特异性cea和4-1bb结合分子的浓度针对pe缀合的检测二抗的荧光强度的几何均值(mfi)绘图。通过减去空白对照(例如无一抗，仅检测二抗)的基线值对所有值进行基线校准。在图21a中显示对人4-1bb表达性报告细胞系jurkat-hu4-1bb-nfκb-luc的结合而在图21b中显示对人cea表达性人胃癌细胞系mkn45的结合。只有分别包含4-1bb抗原结合域或cea抗原结合域的抗原结合分子有效结合人4-1bb表达性jurkat-hu4-1bb-nfκb-luc细胞或人cea表达性mkn45细胞。作为阴性对照使用非特异性dp47huiggp329glala抗体投递基线。在图21c中显示对jurkat-hu4-1bb-nfκb-luc的结合曲线的曲线下面积(auc)而在图21d中显示对mkn45细胞的结合曲线的auc。图22a至22c显示nfκb介导的萤光素酶表达和因此在4-1bb表达性报告细胞系(jurkat-hu4-1bb-nfkb-luc2)中的活性。将双特异性cea靶向性激动性4-1bb双特异性抗体的浓度针对温育6小时后测量的释放光单位(url)绘图。通过减去空白对照(例如不添加抗体)的基线值对所有值进行基线校准。在图22a中显示cea靶不依赖性4-1bb激活，其中4-1bb结合在没有任何cea介导的交联的报告细胞系中诱导nfκb控制的萤光素酶表达。在图22b中添加cea表面表达性人胃腺癌细胞系mkn45，对报告细胞系的比是5:1。cea表达性mkn45细胞引起双特异性4-1bb和cea抗原结合分子的交联并提高它在4-1bb表达性报告细胞系中诱导nfκb诱导的萤光素酶激活的潜力。依赖于cea靶向性克隆和双特异性格式，分子展示不同激活潜力。以三种不同格式使用克隆a5b7p，其中a5b7p克隆的c端vh/vl融合(灰色三角形)显示比其中a5b7p作为ch/cl交叉fabc端融合的双特异性格式(黑色菱形)更少的活性。如果a5b7p作为vh/vl交叉fabc端融合的话(黑色空心方形)，看到最高激活潜力。因此克隆a5b7p是格式约束的基础(underlies)，导致不同激活潜力。对cea结合物克隆a5b7(黑色向下三角形)看到最强激活。非靶向性4-1bb(20h4.9)分子，像4-1bb(20h4.9)xdp472+1(空心灰色圆形，点线)或4-1bb(20h4.9)huigg1p329glala(灰色实心圆形)显示cea交联不依赖性基线活性。在图22c中汇总计算auc。在x轴上且作为柱上方的图片指示所使用的cea结合克隆和格式。在图23a至23d中显示在cea表达性肿瘤细胞(mkn45)存在下的人pbmc激活。在cea表达性mkn45细胞和cd3刺激存在下温育新鲜的分离的人pbmc导致cd4+t细胞(图23a)和cd8+t细胞(图23b)上的cd25上调以及cd4+t细胞(图23c)和cd8+t细胞(图23d)(程度较低)增殖升高，如果存在cea靶向性4-1bb(20h4.9)抗原结合分子(黑色实心三角形和实线)的话。非cea靶向性4-1bb(20h4.9)xdp472+1(灰色空心圆形，点线)或4-1bb(20h4.9)huigg1p329glala(实心灰色圆形，实线)分子仅仅给出有限的基线激活，而dp47huigg1p329glala作为阴性对照投递真实的基线。在图24a至24d中在cea表达性肿瘤细胞(mkn45)存在下激活来自与图23a至23d中显示的不同供体的人pbmc。在cea表达性细胞和cd3刺激存在下温育新鲜的分离的人pbmc导致cd4+t细胞(图24a)和cd8+t细胞(图24b)上的cd25上调以及cd4+t细胞(图24c)和cd8+t细胞(图24d)(程度较低)增殖升高，如果cea靶向性4-1bb(20h4.9)抗原结合分子存在的话。发明详述定义除非另有定义,本文中使用的技术和科学术语具有与此发明所属领域中一般使用的相同的含义。出于解释此说明书的目的,会应用下述定义,而且在适宜时,以单数使用的术语还会包括复数,反之亦然。如本文中使用的,术语“抗原结合分子”以其最广义指特异性结合抗原性决定簇的分子。抗原结合分子的例子是抗体,抗体片段和支架抗原结合蛋白。如本文中使用的,术语“能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域”或“能够特异性结合靶细胞抗原的模块”指特异性结合抗原性决定簇的多肽分子。在一个方面,抗原结合域能够经由其靶细胞抗原激活信号传导。在一个特定方面,抗原结合域能够将其附着的实体(例如4-1bb激动剂)引导至靶位点,例如携带抗原性决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域包括本文中进一步定义的抗体和其片段。另外,能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域包括本文中进一步定义的支架抗原结合蛋白,例如基于设计的重复蛋白或设计的重复域的结合域(参见例如wo2002/020565)。关于抗体或其片段,术语“能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域”指分子中包含与抗原的部分或全部特异性结合且互补的区域的部分。可以例如由一个或多个抗体可变域(也称作抗体可变区)提供能够进行特异性抗原结合的抗原结合域。特别地,能够进行特异性抗原结合的抗原结合域包含抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)。在另一个方面,“能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域”还可以是fab片段或交叉fab片段。术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体,多克隆抗体,单特异性和多特异性抗体(例如双特异性抗体),和抗体片段,只要它们展现期望的抗原结合活性。如本文中使用的术语“单克隆抗体”指自实质性同质的抗体群体获得的抗体,即构成该群体的抗体个体是同一的和/或结合相同表位,除了可能的抗体变体,例如,含有天然发生的突变的或在单克隆抗体制备物的生成期间产生的,此类变体一般以微小量存在。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物形成对比,单克隆抗体制备物中的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如本文中使用的术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体,每个该位点结合相同抗原的相同表位。术语“双特异性”意味着抗原结合分子能够特异性结合至少两种截然不同的抗原性决定簇。典型地,双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点,其每个是对不同抗原性决定簇特异性的。在某些实施方案中,双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原性决定簇,特别是在两种截然不同的细胞上表达的两种抗原性决定簇。如本申请内使用的术语“价”表示对一种独特抗原性决定簇特异性的抗原结合分子中规定数目的对一种独特抗原性决定簇特异性的结合位点的存在。照此,术语“二价”,“四价”,和“六价”分别表示抗原结合分子中对某种抗原性决定簇特异性的两个结合位点,四个结合位点,和六个结合位点的存在。在本发明的特定方面,依照本发明的双特异性抗原结合分子对于某种抗原性决定簇可以是单价的,意味着它们仅仅具有一个针对所述抗原性决定簇的结合位点,或者它们对于某种抗原性决定簇可以是二价或四价的,意味着它们分别具有针对所述抗原性决定簇的两个结合位点或四个结合位点。术语“全长抗体”,“完整抗体”,和“全抗体”在本文中可互换使用,指具有与天然抗体结构实质性相似的结构的抗体。“天然抗体”指具有不同结构的天然发生的免疫球蛋白分子。例如,天然igg类抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白,由成二硫键的两条轻链和两条重链构成。自n端至c端,每条重链具有一个可变区(vh),也称作可变重域或重链可变域,接着是三个恒定域(ch1,ch2,和ch3),也称作重链恒定区。类似地,自n端至c端,每条轻链具有一个可变区(vl),也称作可变轻域或轻链可变域,接着是一个轻链恒定域(cl),也称作轻链恒定区。抗体的重链可指派至五种型之一,称作α(iga),δ(igd),ε(ige),γ(igg),或μ(igm),其中一些可进一步分成亚型,例如γ1(igg1),γ2(igg2),γ3(igg3),γ4(igg4),α1(iga1)和α2(iga2)。基于其恒定域的氨基酸序列,抗体的轻链可指派至两种型之一,称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。“抗体片段”指与完整抗体不同的分子,其包含完整抗体中与完整抗体所结合的抗原结合的部分。抗体片段的例子包括但不限于fv,fab,fab’,fab’-sh,f(ab’)2；双抗体,三抗体,四抗体,交叉fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv)；和单域抗体。关于某些抗体片段的综述,参见hudsonetal.,natmed9,129-134(2003)。关于scfv片段的综述,参见例如plückthun,inthepharmacologyofmonoclonalantibodies,vol.113,rosenburgandmooreeds.,springer-verlag,newyork,pp.269-315(1994)；还参见wo93/16185；和美国专利no.5,571,894和5,587,458。关于包含挽救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的fab和f(ab’)2片段的讨论,参见美国专利no.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段,其可以是二价或双特异性的,参见例如ep404,097；wo1993/01161；hudsonetal.,natmed9,129-134(2003)；和hollingeretal.,procnatlacadsciusa90,6444-6448(1993)。hudsonetal.,natmed9,129-134(2003)中还描述了三抗体和四抗体。单域抗体是包含抗体的重链可变域的全部或一部分或轻链可变域的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中,单域抗体是人单域抗体(domantis,inc.,waltham,ma；参见例如美国专利no.6,248,516b1)。可以通过各种技术来生成抗体片段,包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成,如本文中描述的。完整抗体的木瓜蛋白酶消化生成两个同一的抗原结合片段,称作“fab”片段,每个含有重和轻链可变域,还有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(ch1)。如此,如本文中使用的,术语“fab片段”指包含包含轻链的vl域和恒定域(cl)的轻链片段,和重链的vh域和第一恒定域(ch1)的抗体片段。fab’片段因在重链ch1域的羧基末端增加少数残基而与fab片段不同,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。fab’-sh是其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的fab’片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点(两个fab片段)和fc区的一部分的f(ab’)2片段。依照本发明,术语“fab片段”还包括如下文定义的“交叉fab片段”或“交换fab片段”。术语“交叉fab片段”或“xfab片段”或“交换fab片段”指其中重和轻链的可变区或恒定区任一交换的fab片段。交叉fab分子的两种不同链组成是可能的且包含在本发明的双特异性抗体中:一方面,fab重和轻链的可变区交换,即交换fab分子包含由轻链可变区(vl)和重链恒定区(ch1)构成的肽链,和由重链可变区(vh)和轻链恒定区(cl)构成的肽链。这种交换fab分子也称作crossfab(vlvh)。另一方面,当fab重和轻链的恒定区交换时,交换fab分子包含由重链可变区(vh)和轻链恒定区(cl)构成的肽链,和由轻链可变区(vl)和重链恒定区(ch1)构成的肽链。这种交换fab分子也称作crossfab(clch1)。“单链fab片段”或“scfab”是由抗体重链可变域(vh),抗体恒定域1(ch1),抗体轻链可变域(vl),抗体轻链恒定域(cl)和接头组成的多肽,其中所述抗体域和所述接头以n端至c端方向具有下述次序之一:a)vh-ch1-接头-vl-cl,b)vl-cl-接头-vh-ch1,c)vh-cl-接头-vl-ch1或d)vl-ch1-接头-vh-cl；且其中所述接头是至少30个氨基酸,优选32至50个氨基酸的多肽。所述单链fab片段经由cl域和ch1域之间的天然二硫键而稳定化。另外,这些单链fab分子可通过经由半胱氨酸残基的插入(例如依照kabat编号方式的可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)生成链间二硫键而进一步稳定化。“交换单链fab片段”或“x-scfab”是由抗体重链可变域(vh),抗体恒定域1(ch1),抗体轻链可变域(vl),抗体轻链恒定域(cl)和接头组成的多肽,其中所述抗体域和所述接头以n端至c端方向具有下述次序之一:a)vh-cl-接头-vl-ch1和b)vl-ch1-接头-vh-cl；其中vh和vl一起形成特异性结合抗原的抗原结合位点,且其中所述接头是至少30个氨基酸的多肽。另外,这些x-scfab分子可通过经由半胱氨酸残基的插入(例如依照kabat编号方式的可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)生成链间二硫键而进一步稳定化。“单链可变片段(scfv)”是以10至约25个氨基酸的短接头肽连接的抗体的重(vh)和轻(vl)链可变区的融合蛋白。接头经常富含出于柔性的甘氨酸,以及出于溶解性的丝氨酸或苏氨酸,而且可将vh的n端与vl的c端连接,或反之亦然。尽管去除恒定区并引入接头,此蛋白质保留原始抗体的特异性。scfv抗体描述于例如houston,j.s.,methodsinenzymol.203(1991)46-96。另外,抗体片段包含具有vh域的特征(即能够与vl域一起装配)或vl域的特征(即能够与vh域一起装配)的单链多肽,vh域与vl域一起装配成功能性抗原结合位点并由此提供全长抗体的抗原结合特性。“支架抗原结合蛋白”在本领域中是已知的,例如,纤连蛋白和设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)已经用作抗原结合域的备选支架,参见例如gebauerandskerra,engineeredproteinscaffoldsasnext-generationantibodytherapeutics.curropinchembiol13:245-255(2009)和stumppetal.,darpins:anewgenerationofproteintherapeutics.drugdiscoverytoday13:695-701(2008)。在本发明的一个方面,支架抗原结合蛋白选自由ctla-4(evibody),脂质运载蛋白(anticalin),蛋白a衍生的分子,诸如蛋白a的z域(affibody),a域(avimer/maxibody),血清转铁蛋白(trans-body)；设计的锚蛋白重复蛋白(darpin),抗体轻链或重链的可变域(单域抗体,sdab),抗体重链的可变域(纳米抗体,avh),vnar片段,纤连蛋白(adnectin),c型凝集素域(tetranectin)；新的抗原受体β-内酰胺酶的可变域(vnar片段),人γ-晶体蛋白或泛素(affilin分子)；人蛋白酶抑制剂的kunitz型域,微体,诸如来自knottin家族的蛋白质,肽适体和纤连蛋白(adnectin)组成的组。ctla-4(细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4)是主要在cd4+t细胞上表达的cd28家族受体。其细胞外域具有类似可变域的ig折叠。可用异源序列取代对应于抗体的cdr的环,以赋予不同的结合特性。经过工程化而具有不同结合特异性的ctla-4分子也被称为evibodies(例如,us7166697b1)。evibodies的大小与抗体(例如,域抗体)的分离可变区大约相同。进一步的详情参见journalofimmunologicalmethods248(1-2),31-45(2001)。脂质运载蛋白为细胞外蛋白质家族,其转运小的疏水性分子,如类固醇,胆红素,类视黄醇和脂质。它们具有刚性β-片层二级结构,在锥形结构的开口端具有可被工程化以结合不同的靶抗原的多个环。anticalin的大小在160-180个氨基酸之间,并且衍生自脂质运载蛋白。进一步的详情参见biochimbiophysacta1482:337-350(2000),us7250297b1和us20070224633。亲和体是衍生自金黄色葡萄球菌蛋白a的支架,其可被工程化以结合抗原。该域由具有约58个氨基酸的三螺旋束组成。通过表面残基的随机化生成了文库。进一步的详情参见proteineng.des.sel.2004,17,455-462和ep1641818a1。avimers是衍生自a域支架家族的多域蛋白。具有约35个氨基酸的天然域采用定义的二硫键结构。多样性是通过改变a域家族所显示的自然变异产生的。进一步的详情参见naturebiotechnology23(12),1556-1561(2005)和expertopiniononinvestigationaldrugs16(6),909-917(june2007)。转铁蛋白是单体的血清转运糖蛋白。可以通过在允许的表面环中插入肽序列将转铁蛋白工程化以结合不同的靶抗原。工程化转铁蛋白支架的实例包括trans-body。进一步的详情参见j.biol.chem274,24066-24073(1999)。设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)衍生自锚蛋白,锚蛋白是介导整合膜蛋白与细胞骨架附着的蛋白质家族。单个锚蛋白重复是由两个α-螺旋和β-转角组成的33个残基的基序。通过随机化每个重复的第一个α-螺旋和β-转角中的残基,它们可以被工程化以结合不同的靶抗原。通过增加模块的数量(亲和力成熟法)可以增加它们的结合界面。进一步的详情参见j.mol.biol.332,489-503(2003),pnas100(4),1700-1705(2003)和j.mol.biol.369,1015-1028(2007)以及us20040132028a1。单域抗体是由单个单体的可变抗体域组成的抗体片段。第一个单域来源于来自骆驼科动物(camelids)抗体重链的可变域(纳米抗体或vhh片段)。此外,术语单域抗体包括自主的人重链可变域(avh)或来源于鲨鱼的vnar片段。纤连蛋白是一种可以被工程化为与抗原结合的支架。adnectin由人纤连蛋白iii型(fn3)的15个重复单元的第10个域的天然氨基酸序列的主链组成。可以将β-夹心一端的三个环工程化,使adnectin能够特异性地识别感兴趣的治疗靶标。进一步的详情参见proteineng.des.sel.18,435-444(2005),us20080139791,wo2005056764和us6818418b1。肽适体是由恒定骨架蛋白组成的组合识别分子,所述骨架蛋白通常是含有在活性位点插入的约束可变肽环的硫氧还蛋白(trxa)。进一步的详情参见expertopin.biol.ther.5,783-797(2005)。微体源自长度为25-50个氨基酸的天然存在的微蛋白,其含有3-4个半胱氨酸桥-微蛋白的实例包括kalatabi以及芋螺毒素和半胱氨酸结肽(knottin)。微蛋白具有可以工程化以包括多达25个氨基酸而不影响微蛋白的整体折叠的环。工程化的半胱氨酸结肽域的更多详情参见wo2008098796。与参照分子“结合相同表位的抗原结合分子”指如下的抗原结合分子,抗原结合分子在竞争测定法中将参照分子对其抗原的结合阻断50％或更多,相反,参照分子在竞争测定法中将抗原结合分子对其抗原的结合阻断50％或更多。术语“抗原结合域”或“抗原结合位点”指抗原结合分子中包含与抗原的部分或全部特异性结合且互补的区域的部分。在抗原较大的情况中,抗原结合分子可仅仅结合抗原的特定部分,该部分称作表位。抗原结合域可以由例如一个或多个可变域(也称作可变区)提供。优选地,抗原结合域包含抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)。如本文中使用的,术语“抗原性决定簇”与“抗原”和“表位”同义,而且指多肽大分子上的如下位点(例如氨基酸的连续区段或由不连续氨基酸的不同区域构成的构象构造),抗原结合模块与该位点结合,形成抗原结合模块-抗原复合物。有用的抗原性决定簇可以例如在肿瘤细胞的表面上,在病毒感染的细胞的表面上,在其它患病细胞的表面上,在免疫细胞的表面上,游离在血清中,和/或在细胞外基质(ecm)中找到。作为本文中的抗原有用的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的蛋白质的任何天然形式,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。在一个特定实施方案中,抗原是人蛋白质。在提及本文中的特定蛋白质的情况中,该术语涵盖“全长”未加工的蛋白质以及源自细胞中的加工的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖蛋白质的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。“特异性结合”意味着结合对于抗原是选择性的且可以与不想要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合分子结合特定抗原的能力可经由酶联免疫吸附测定法(elisa)或本领域技术人员熟悉的其它技术来测量,例如表面等离振子共振(spr)技术(在biacore仪器上分析)(liljebladetal.,glycoj17,323-329(2000)),和传统的结合测定法(heeley,endocrres28,217-229(2002))。在一个实施方案中,抗原结合分子对无关蛋白质的结合的程度小于抗原结合分子对抗原的结合的约10％,如通过例如spr测量的。在某些实施方案中,结合抗原的分子具有≤1μm,≤100nm,≤10nm,≤1nm,≤0.1nm,≤0.01nm,或≤0.001nm(例如10-8m或更小,例如10-8m至10-13m,例如10-9m至10-13m)的解离常数(kd)。“亲和力”或“结合亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点和其结合配偶(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明,如本文中使用的,“结合亲和力”指反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子x对其配偶y的亲和力一般可以用解离常数(kd)来代表,它是解离和结合速率常数(分别是koff和kon)的比。如此,等同的亲和力可包含不同的速率常数,只要速率常数的比保持相同。可以通过本领域已知的常用方法来测量亲和力,包括本文中描述的那些。用于测量亲和力的一种特定方法是表面等离振子共振(spr)。“亲和力成熟的”抗体指与不拥有此类改变的亲本抗体相比,在一个或多个高变区(hvr)中具有一处或多处改变的抗体,此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。如本文中使用的“靶细胞抗原”指在靶细胞(例如肿瘤中的细胞,诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞)的表面上呈现的抗原性决定簇。在某些实施方案中,靶细胞抗原是肿瘤细胞的表面上的抗原。在一个实施方案中,靶细胞抗原选自由成纤维细胞活化蛋白(fap),癌胚抗原(cea),黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(mcsp),表皮生长因子受体(egfr),cd19,cd20和cd33组成的组。特别地,靶细胞抗原是成纤维细胞活化蛋白(fap)。术语“成纤维细胞活化蛋白(fap)”,也称作脯氨酰内肽酶fap或分离酶(seprase)(ec3.4.21),指来自任何脊椎动物来源的任何天然fap,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。该术语包括“全长”未加工的fap以及源自细胞中的加工的任何形式的fap。该术语还涵盖fap的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中,本发明的抗原结合分子能够特异性结合人,小鼠和/或食蟹猴fap。人fap的氨基酸序列在uniprot(www.uniprot.org)登录号q12884(版本149,seqidno:95),或ncbi(www.ncbi.nlm.nih.gov/)refseqnp_004451.2中显示。人fap的细胞外结构域(ecd)自氨基酸位置26延伸至760。带his标签的人fapecd的氨基酸序列在seqidno:96中显示。小鼠fap的氨基酸序列在uniprot登录号p97321(版本126,seqidno:97),或ncbirefseqnp_032012.1中显示。小鼠fap的细胞外结构域(ecd)自氨基酸位置26延伸至761。seqidno:98显示带his标签的小鼠fapecd的氨基酸序列。seqidno:99显示带his标签的食蟹猴fapecd的氨基酸序列。优选地,本发明的抗fap结合分子结合fap的细胞外结构域。术语“癌胚抗原(cea)”,也称作癌胚抗原相关细胞粘附分子5(ceacam5),指来自任何脊椎动物来源的任何天然cea,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。人cea的氨基酸序列在uniprot登录号p06731(版本151,seqidno:100)中显示。cea早已鉴定为肿瘤相关抗原(goldandfreedman,jexpmed.,121:439-462,1965；berinsteinn.l.,jclinoncol.,20:2197-2207,2002)。最初归类为仅仅在胎儿组织中表达的蛋白质,现在已经在若干正常成体组织中鉴定cea。这些组织主要是上皮起源的,包括胃肠,呼吸,和泌尿生殖道的细胞,和结肠,子宫颈,汗腺,和前列腺的细胞(napetal.,tumourbiol.,9(2-3):145-53,1988；napetal.,cancerres.,52(8):2329-23339,1992)。上皮起源的肿瘤以及它们的转移含有cea作为肿瘤相关抗原。虽然cea本身的存在不指示转化成癌性细胞,但是cea的分布是指示性的。在正常组织中,cea一般在细胞的顶端表面上表达(s.,semincancerbiol.9(2):67-81(1999)),使得它对血流中的抗体不可及。与正常组织形成对比,cea趋于在癌性细胞的整个表面上表达(s.,semincancerbiol.9(2):67-81(1999))。这种表达模式的变化使得cea变成对于癌性细胞中的抗体结合是可及的。另外,cea表达在癌性细胞中升高。而且,升高的cea表达促进细胞间粘附增加,这可导致转移(marshallj.,seminoncol.,30(asuppl.8):30-6,2003)。cea表达在各种肿瘤实体中的流行度一般很高。与已发表的数据一致,自己在组织样品中实施的分析确认其高流行度,大约是结肠直肠癌(crc)中95％,胰腺癌中90％,胃癌中80％,非小细胞肺癌(nsclc,这种情况中它与her3共表达)中60％,和乳腺癌中40％；发现小细胞肺癌和成胶质细胞瘤中的低表达。cea容易自细胞表面切割并或是直接或是经由淋巴自肿瘤脱落入血流。由于这种特性,血清cea的水平已用作诊断癌症和筛选癌症,特别是结肠直肠癌复发的临床标志物(goldenbergdm.,theinternationaljournalofbiologicalmarkers,7:183-188,1992；chaui.etal.,jclinoncol.,22:1420-1429,2004；flaminietal.,clincancerres.,12(23):6985-6988,2006)。术语“黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(mcsp)”,也称作硫酸软骨素蛋白聚糖4(cspg4),指来自任何脊椎动物来源的任何天然mcsp,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。人mcsp的氨基酸序列在uniprot登录号q6uvk1(版本103,seqidno:101)中显示。术语“表皮生长因子受体(egfr)”,也称作原癌基因c-erbb-1或受体酪氨酸蛋白质激酶erbb-1,指来自任何脊椎动物来源的任何天然egfr,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。人egfr的氨基酸序列在uniprot登录号p00533(版本211,seqidno:102)中显示。术语“cd19”指b淋巴细胞抗原cd19,也称作b淋巴细胞表面抗原b4或t细胞表面抗原leu-12且包括来自任何脊椎动物来源的任何天然cd19,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。人cd19的氨基酸序列在uniprot登录号p15391(版本160,seqidno:103)中显示。“cd20”指b淋巴细胞抗原cd20,也称作跨膜4域亚家族a成员1(ms4a1),b淋巴细胞表面抗原b1或白细胞表面抗原leu-16,且包括来自任何脊椎动物来源的任何天然cd20,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。人cd20的氨基酸序列在uniprot登录号p11836(版本149,seqidno:104)中显示。术语“cd33”指髓样细胞表面抗原cd33,也称作siglec3或gp67,且包括来自任何脊椎动物来源的任何天然cd33,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。人cd33的氨基酸序列在uniprot登录号p20138(版本157,seqidno:105)中显示。术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗原结合分子结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别是vh和vl)一般具有相似的结构,每个域包含四个保守的框架区(fr)和三个高变区(hvr)。参见例如kindtetal.,kubyimmunology,6thed.,w.h.freemanandco.,p.91(2007)。单个vh或vl域可足以赋予抗原结合特异性。如本文中使用的,术语“高变区”或“hvr”指抗体可变域中在序列上高变和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区域。一般地,天然四链抗体包含六个hvr:三个在vh中(h1,h2,h3),三个在vl中(l1,l2,l3)。hvr一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(cdr)的氨基酸残基,后者具有最高的序列变异性和/或牵涉抗原识别。例示性高变环发生于氨基酸残基26-32(l1),50-52(l2),91-96(l3),26-32(h1),53-55(h2),和96-101(h3)(chothiaandlesk,j.mol.biol.196:901-917(1987))。例示性cdr(cdr-l1,cdr-l2,cdr-l3,cdr-h1,cdr-h2,和cdr-h3)发生于氨基酸残基24-34(l1),50-56(l2),89-97(l3),31-35b(h1),50-65(h2),和95-102(h3)(kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991))。高变区(hvr)也称作互补决定区(cdr),而且在提到可变区中形成抗原结合区的部分时,这些术语在本文中可互换使用。这个特定区域已经由kabatetal.,u.s.dept.ofhealthandhumanservices,"sequencesofproteinsofimmunologicalinterest"(1983)和由chothiaetal.,j.mol.biol.196:901-917(1987)描述,其中定义包括在针对彼此比较时的氨基酸残基的交叠或子集。无论如何,应用任一定义来提及抗体的cdr或其变体意图在如本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上文引用的每一篇参考文献定义的cdr的适宜氨基酸残基在下文表a中作为比较列出。涵盖特定cdr的确切残基编号会取决于cdr的序列和大小而变化。给予抗体的可变区氨基酸序列,本领域技术人员能例行确定哪些残基构成特定cdr。表a:cdr定义1cdrkabatchothiaabm2vhcdr131-3526-3226-35vhcdr250-6552-5850-58vhcdr395-10295-10295-102vlcdr124-3426-3224-34vlcdr250-5650-5250-56vlcdr389-9791-9689-971表a中的所有cdr定义的编号方式依照kabat等人(见下文)列出的编号规则。2如表a中使用的具有小写“b”的“abm”指如由oxfordmolecular的“abm”抗体建模软件定义的cdr。kabat等人还定义了可应用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员能明确地将“kabat编号方式”的这种系统指派给任何可变区序列,不依赖于超出序列本身的任何实验数据。如本文中使用的,“kabat编号方式”是指由kabatetal.,u.s.dept.ofhealthandhumanservices,"sequenceofproteinsofimmunologicalinterest"(1983)中列出的编号系统。除非另有规定,抗体可变区中具体氨基酸残基位置的编号的提及依照kabat编号系统。除了vh中的cdr1之外,cdr一般包含形成高变环的氨基酸残基。cdr还包含“特异性决定残基”或“sdr”,它们是接触抗原的残基。sdr包含在称作缩短cdr或a-cdr的cdr区域中。例示性a-cdr(a-cdr-l1,a-cdr-l2,a-cdr-l3,a-cdr-h1,a-cdr-h2,和a-cdr-h3)发生于氨基酸残基31-34(l1),50-55(l2),89-96(l3),31-35b(h1),50-58(h2),和95-102(h3)(参见almagroandfransson,front.biosci.13:1619-1633(2008))。除非另外指明,hvr残基和可变域中的其它残基(例如fr残基)在本文中依照kabat等人,见上文编号。“框架”或“fr”指除了高变区(hvr)残基之外的可变域残基。可变域的fr一般由四个fr域组成:fr1,fr2,fr3,和fr4。因而,hvr和fr序列一般在vh(或vl)中以下述顺序出现:fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。术语“嵌合”抗体指如下的抗体,其中重和/或轻链的一部分自特定来源或物种衍生,而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生。抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。有五大类抗体:iga,igd,ige,igg,和igm,而且其中若干可进一步分为亚类(同种型),例如igg1,igg2,igg3,igg4,iga1,和iga2。与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α,δ,ε,γ,和μ。“人源化”抗体指包含来自非人hvr的氨基酸残基和来自人fr的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中,人源化抗体会包含至少一个,通常两个实质性整个如下的可变域,其中整个或实质性整个hvr(例如cdr)对应于非人抗体的那些,而且整个或实质性整个fr对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可包含自人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体,例如非人抗体的“人源化形式”指经历人源化的抗体。本发明涵盖的其它形式的“人源化抗体”是其中恒定区已经自原始抗体的恒定区另外修饰或变化以生成依照本发明的特性,尤其是关于c1q结合和/或fc受体(fcr)结合的那些。“人”抗体是拥有与由人或人细胞生成的或自利用人抗体全集或其它人抗体编码序列的非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这种定义专门排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。本文中的术语“fc域”或“fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的抗体重链的c端区。该术语包括天然序列fc区和变体fc区。iggfc区包含iggch2和iggch3域。人iggfc区的“ch2域”通常自约位置231处的氨基酸残基延伸至约位置340处的氨基酸残基。在一个实施方案中,碳水化合物链附着于ch2域。本文中的ch2域可以是天然序列ch2域或变体ch2域。“ch3域”包含fc区中在ch2域c端的那段残基(即自igg的约位置341处的氨基酸残基至约位置447处的氨基酸残基)。本文中的ch3区可以是天然序列ch3域或变体ch3域(例如具有在其一条链中引入的“隆起”(“节”)和在其另一条链中相应引入的“空腔”(“穴”)的ch3域；参见美国专利no.5,821,333,通过援引明确收入本文)。如本文中描述的,此类变体ch3域可用于促进两条不相同抗体重链的异二聚化。在一个实施方案中,人igg重链fc区自cys226或自pro230延伸至重链的羧基末端。然而,fc区的c末端赖氨酸(lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定,fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号依照eu编号系统,也称作eu索引,如kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,1991中描述的。“节-入-穴”技术在例如us5,731,168；us7,695,936；ridgwayetal.,proteng9,617-621(1996)和carter,jimmunolmeth248,7-15(2001)中描述。一般地,该方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”),使得该隆起可放置在该空腔中,从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。通过将大氨基酸侧链用较小侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换而在第二多肽的界面中创建与隆起相同或相似大小的补偿性空腔。可通过改变编码多肽的核酸,例如通过位点特异性诱变,或通过肽合成来生成隆起和空腔。在一个具体实施方案中,节修饰包含fc域的两个亚基之一中的氨基酸替代t366w,而穴修饰包含fc域的两个亚基之另一中的氨基酸替代t366s,l368a和y407v。在又一个具体实施方案中,fc域中包含节修饰的亚基另外包含氨基酸替代s354c,而fc域中包含穴修饰的亚基另外包含氨基酸替代y349c。引入这两个半胱氨酸残基导致在fc区的两个亚基之间形成二硫桥,如此进一步稳定化二聚体(carter,jimmunolmethods248,7-15(2001))。“与免疫球蛋白的fc区等同的区域”意图包括免疫球蛋白的fc区的天然发生等位变体以及具有生成替代,添加,或删除的改变但并不实质性降低免疫球蛋白介导效应器功能(诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性)的能力的变体。例如,可以自免疫球蛋白的fc区的n端或c端删除一个或多个氨基酸,生物学功能没有实质性损失。可以依照本领域已知的一般规则来选择此类变体,从而对活性具有最小限度影响(参见例如bowie,j.u.etal.,science247:1306-10(1990))。术语“效应器功能”指那些可归于抗体的fc区的生物学活性,其随抗体同种型而变化。抗体效应器功能的例子包括:c1q结合和补体依赖性细胞毒性(cdc),fc受体结合,抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc),抗体依赖性细胞吞噬(adcp),细胞因子分泌,免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取,细胞表面受体(例如b细胞受体)的下调,和b细胞活化。fc受体结合依赖性效应器功能可以通过抗体的fc区与fc受体(fcr,它们是造血细胞上的专门化细胞表面受体)的相互作用来介导。fc受体属于免疫球蛋白超家族,而且已经显示介导通过免疫复合物的吞噬去除抗体包被的病原体和被相应抗体包被的红细胞和多种其它细胞靶(例如肿瘤细胞)经抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)裂解二者(参见例如vandewinkel,j.g.andanderson,c.l.,j.leukoc.biol.49(1991)511-524)。fcr通过它们对免疫球蛋白同种型的特异性来定义:针对igg抗体的fc受体称作fcγr。fc受体结合记载于例如ravetch,j.v.andkinet,j.p.,annu.rev.immunol.9(1991)457-492；capel,p.j.,etal.,immunomethods4(1994)25-34；dehaas,m.,etal.,j.lab.clin.med.126(1995)330-341；和gessner,j.e.,etal.,ann.hematol.76(1998)231-248。针对igg抗体fc区的受体(fcγr)的交联触发极其广泛的效应器功能,包括吞噬,抗体依赖性细胞细胞毒性,和释放炎症性介导物,以及免疫复合物清除和调节抗体生成。在人中,三类fcγr已经表征,它们是:-fcγri(cd64)以高亲和力结合单体igg且在巨噬细胞,单核细胞,嗜中性细胞和嗜曙红细胞上表达。iggfc区中至少氨基酸残基e233-g236,p238,d265,n297,a327和p329(编号方式依照kabat的eu索引)之一处的修饰降低对fcγri的结合。将位置233-236处的igg2残基替代入igg1和igg4将对fcγri的结合降低103倍并消除针对抗体敏化的红血球的人单核细胞应答(armour,k.l.,etal.,eur.j.immunol.29(1999)2613-2624)。-fcγrii(cd32)以中等至低亲和力结合复合的igg且广泛表达。这种受体可分成两个亚型,fcγriia和fcγriib。fcγriia在牵涉杀伤的许多细胞上找到(例如巨噬细胞,单核细胞,嗜中性细胞)且看来能够激活杀伤过程。fcγriib看来在抑制性过程中发挥作用且在b细胞,巨噬细胞上并在肥大细胞和嗜曙红细胞上找到。在b细胞上它看来发挥支持进一步免疫球蛋白生成和同种型转换成例如ige类的功能。在巨噬细胞上,fcγriib起抑制经由fcγriia介导的吞噬的作用。在嗜曙红细胞和肥大细胞上,b形式可有助于经由结合其分开的受体的ige遏制这些细胞的激活。例如,对包含至少在氨基酸残基e233-g236,p238,d265,n297,a327,p329,d270,q295,a327,r292,和k414(编号方式依照kabat的eu索引)之一处具有突变的iggfc区的抗体找到降低的对fcγriia的结合。-fcγriii(cd16)以中等至低亲和力结合igg且以两种类型存在。fcγriiia在nk细胞,巨噬细胞,嗜曙红细胞和一些单核细胞和t细胞上找到且介导adcc。fcγriiib在嗜中性细胞上高表达。例如,对包含至少在氨基酸残基e233-g236,p238,d265,n297,a327,p329,d270,q295,a327,s239,e269,e293,y296,v303,a327,k338和d376(编号方式依照kabat的eu索引)之一处具有突变的iggfc区的抗体找到降低的对fcγriiia的结合。人igg1上针对fc受体的结合位点的定位,上文所述突变位点和用于测量对fcγri和fcγriia的结合的方法记载于shields,r.l.,etal.j.biol.chem.276(2001)6591-6604。术语“adcc”或“抗体依赖性细胞细胞毒性”是通过fc受体结合介导的功能且指在效应细胞存在下如本文中报告的抗体对靶细胞的裂解。抗体诱导介导adcc的初始步骤的能力通过测量它们对表达fcγ受体的细胞,诸如重组表达fcγri和/或fcγriia的细胞,或nk细胞(本质上表达fcγriiia)的结合来调查。特别地,测量对nk细胞上的fcγr的结合。“活化性fc受体”是在受到抗体的fc区啮合后引发刺激携带该受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件的fc受体。活化性fc受体包括fcγriiia(cd16a),fcγri(cd64),fcγriia(cd32),和fcαri(cd89)。一种特定活化性fc受体是人fcγriiia(参见uniprot登录号p08637,版本141)。“肿瘤坏死因子受体超家族”或“tnf受体超家族”当前由27种受体组成。它是一组特征在于经细胞外富半胱氨酸域(crd)结合肿瘤坏死因子(tnf)的能力的细胞因子受体。这些假重复通过受体链内由高度保守的半胱氨酸残基生成的链内二硫化物来定义。除神经生长因子(ngf)以外,所有tnf与原型tnf-α同源。以它们的活性形式,绝大多数tnf受体在质膜中形成三聚体复合物。因而,大多数tnf受体含有跨膜域(tmd)。数种这些受体还含有细胞内死亡域(dd),它在配体结合后募集胱天蛋白酶相互作用蛋白以启动胱天蛋白酶激活的外在途径。其它缺乏死亡域的tnf超家族受体结合tnf受体相关因子并激活能导致增殖或分化的细胞内信号传导途径。这些受体还能启动凋亡,但是它们经间接机制这样做。在调节凋亡以外,数种tnf超家族受体牵涉调节免疫细胞功能,诸如b细胞稳态和激活,天然杀伤细胞激活,和t细胞共刺激。数种其它受体调节细胞类型特异性应答,诸如毛囊发育和破骨细胞发育。tnf受体超家族的成员包括下面的:肿瘤坏死因子受体1(1a)(tnfrsf1a,cd120a),肿瘤坏死因子受体2(1b)(tnfrsf1b,cd120b),淋巴毒素β受体(ltbr,cd18),ox40(tnfrsf4,cd134),cd40(bp50),fas受体(apo-1,cd95,fas),诱饵受体3(tr6,m68,tnfrsf6b),cd27(s152,tp55),cd30(ki-1,tnfrsf8),4-1bb(cd137,tnfrsf9),dr4(trailr1,apo-2,cd261,tnfrsf10a),dr5(trailr2,cd262,tnfrsf10b),诱饵受体1(trailr3,cd263,tnfrsf10c),诱饵受体2(trailr4,cd264,tnfrsf10d),rank(cd265,tnfrsf11a),骨保护素(ocif,tr1,tnfrsf11b),tweak受体(fn14,cd266,tnfrsf12a),taci(cd267,tnfrsf13b),baff受体(cd268,tnfrsf13c),疱疹病毒进入介导物(hvem,tr2,cd270,tnfrsf14),神经生长因子受体(p75ntr,cd271,ngfr),b细胞成熟抗原(cd269,tnfrsf17),糖皮质激素诱导的tnfr相关的(gitr,aitr,cd357,tnfrsf18),troy(tnfrsf19),dr6(cd358,tnfrsf21),dr3(apo-3,tramp,ws-1,tnfrsf25)和ectodysplasina2受体(xedar,eda2r)。肿瘤坏死因子受体(tnfr)家族的数个成员在初始t细胞活化后发挥维持t细胞应答的功能。术语“共刺激性tnf受体家族成员”或“共刺激性tnf家族受体”指tnf受体家族成员的一个亚组,它们能够共刺激t细胞的增殖和细胞因子生成。该术语指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然tnf家族受体,除非另有说明。在本发明的具体实施方案中,共刺激性tnf受体家族成员选自由ox40(cd134),4-1bb(cd137),cd27,hvem(cd270),cd30,和gitr组成的组,它们都对t细胞具有共刺激效果。更加特别地,共刺激性tnf受体家族成员是4-1bb。如本文中使用的,术语“4-1bb”指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然4-1bb,除非另有说明。该术语涵盖“全长”,未加工的4-1bb以及因细胞中的加工所致的任何形式的4-1bb。该术语还涵盖4-1bb的天然发生变体,例如剪接变体或等位基因变体。一种例示性的人4-1bb的氨基酸序列显示于seqidno:106(uniprot登录号q07011),一种例示性的鼠4-1bb的氨基酸序列显示于seqidno:107(uniprot登录号p20334)且一种例示性的食蟹猴4-1bb的氨基酸序列(来自macacamulatta)显示于seqidno:108(uniprot登录号f6w5g6)。术语“抗4-1bb抗体”,“抗4-1bb”,“4-1bb抗体”和“特异性结合4-1bb的抗体”指能够以足够的亲和力结合4-1bb,使得抗体可用作靶向4-1bb中的诊断和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中,抗4-1bb抗体对无关的,非4-1bb蛋白的结合程度小于抗体对4-1bb的结合的约10％,如例如通过放射性免疫测定法(ria)或流式细胞术(facs)测量的。在某些实施方案中,结合4-1bb的抗体具有≤1μm,≤100nm,≤10nm,≤1nm,≤0.1nm,≤0.01nm,或≤0.001nm(例如10-6m或更少,例如10-68m至10-13m,例如10-8m至10-10m)的解离常数(kd)。特别地,该抗4-1bb抗体是如美国专利no.7,288,638中公开的克隆20h4.9。术语“肽接头”指包含一个或多个氨基酸,典型地约2-20个氨基酸的肽。肽接头在本领域中是已知的或在本文中描述。合适的非免疫原性接头肽是例如(g4s)n,(sg4)n或g4(sg4)n肽接头,其中“n”一般是介于1和10之间,典型地介于2和4之间的数目,特别是2,即肽选自由ggggs(seqidno:109),ggggsggggs(seqidno:110),sggggsgggg(seqidno:111)和ggggsggggsgggg(seqidno:112)组成的组,但是还包括序列gspgssssgs(seqidno:113),(g4s)3(seqidno:114),(g4s)4(seqidno:115),gsgsgsgs(seqidno:116),gsgsgngs(seqidno:117),ggsgsgsg(seqidno:118),ggsgsg(seqidno:119),ggsg(seqidno:120),ggsgngsg(seqidno:121),ggngsgsg(seqidno:122)和ggngsg(seqidno:123)。特别感兴趣的肽接头是(g4s)(seqidno:109),(g4s)2或ggggsggggs(seqidno:110),(g4s)3(seqidno:114)和(g4s)4(seqidno:115)。如此申请内使用的术语“氨基酸”表示天然发生羧基α-氨基酸的组,包含丙氨酸(三字母代码:ala,单字母代码:a),精氨酸(arg,r),天冬酰胺(asn,n),天冬氨酸(asp,d),半胱氨酸(cys,c),谷氨酰胺(gln,q),谷氨酸(glu,e),甘氨酸(gly,g),组氨酸(his,h),异亮氨酸(ile,i),亮氨酸(leu,l),赖氨酸(lys,k),甲硫氨酸(met,m),苯丙氨酸(phe,f),脯氨酸(pro,p),丝氨酸(ser,s),苏氨酸(thr,t),色氨酸(trp,w),酪氨酸(tyr,y),和缬氨酸(val,v)。“融合”或“连接”意味着各构件(例如抗体和fab片段的重链)通过肽键,或是直接地或是经由一个或多个肽接头连接。关于参照多肽(蛋白质)序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列和在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性之后,而且不考虑任何保守替代作为序列同一性的一部分,候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。出于确定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以以本领域的技能内的多种方式实现,例如使用公众可得的计算机软件,诸如blast,blast-2,align.sawi或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员能确定用于比对序列的适宜参数,包括在所比较的序列的全长上实现最大比对需要的任何算法。然而,出于本文中的目的,使用序列比较计算机程序align-2生成％氨基酸序列同一性值。align-2序列比较计算机程序由genentech公司编写,而且源代码已经与用户文档一起提交美国版权局(washingtond.c.,20559),以美国版权注册号txu510087注册。公众自genentech公司(southsanfrancisco,california)可得到align-2程序,或者可以自源代码编译。align-2程序应当编译成在unix操作系统,包括数码unixv4.0d上使用。所有序列比较参数由align-2程序设置且不变。在采用align-2进行氨基酸序列比较的情况中,给定氨基酸序列a相对于(to),与(with),或针对(against)给定氨基酸序列b的％氨基酸序列同一性(或者可表述为给定氨基酸序列a具有或包含相对于,与,或针对给定氨基酸序列b的某一％氨基酸序列同一性)如下计算:100乘分数x/y其中x是由序列比对程序align-2在该程序的a和b的比对中打分为同一匹配的氨基酸残基的数目,且其中y是b中的氨基酸残基的总数。会领会的是,在氨基酸序列a的长度不等于氨基酸序列b的长度的情况中,a相对于b的％氨基酸序列同一性会不等于b相对于a的％氨基酸序列同一性。除非另有具体说明,本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值是如上一段中所述使用align-2计算机程序获得的。在某些实施方案中,涵盖本文中提供的含有tnf配体三聚体的抗原结合分子的氨基酸序列变体。例如,可能想要改善含有tnf配体三聚体的抗原结合分子的结合亲和力和/或其它生物学特性。含有tnf配体三聚体的抗原结合分子的氨基酸序列变体可通过将适宜修饰引入编码该分子的核苷酸序列,或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的删除,和/或插入和/或替代。可进行删除,插入,和替代的任何组合来得到最终的构建物,前提是最终的构建物拥有想要的特征,例如抗原结合。替代诱变感兴趣的位点包括hvr和框架(fr)。保守替代在表b中在标题“优选替代”下提供且在下文中提及氨基酸侧链类别(1)至(6)进一步描述。可将氨基酸替代引入感兴趣的分子并对产物筛选想要的活性,例如保留/改善的抗原结合,降低的免疫原性,或改善的adcc或cdc。表b氨基酸可以依照共同的侧链特性来分组:(1)疏水性的:正亮氨酸,met,ala,val,leu,ile；(2)中性亲水性的:cys,ser,thr,asn,gln；(3)酸性的:asp,glu；(4)碱性的:his,lys,arg；(5)影响链取向的残基:gly,pro；(6)芳香族的:trp,tyr,phe。非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一类别。术语“氨基酸序列变体”包括其中在亲本抗原结合分子(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基中有氨基酸替代的实质性变体。一般地,为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗原结合分子会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力,降低的免疫原性)和/或会实质性保留亲本抗原结合分子的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体,其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之,将一个或多个hvr残基突变并将变体抗原结合分子在噬菌体上展示并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。在某些实施方案中,可以在一个或多个hvr内发生替代,插入,或删除,只要此类变化不实质性降低抗原结合分子结合抗原的能力。例如,可以在hvr中进行不实质性降低结合亲和力的保守改变(例如如本文中提供的保守替代)。一种对于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域有用的方法称作“丙氨酸扫描诱变”,如由cunninghamandwells(1989)science,244:1081-1085描述的。在此方法中,鉴定残基或靶残基的组(例如带电荷的残基,诸如arg,asp,his,lys,和glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外,利用抗原-抗原结合分子复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。作为替代的候选,可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有想要的特性。氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合,以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有n端甲硫氨酰基残基的本发明的双特异性抗原结合分子。分子的其它插入变体包括与延长双特异性抗原结合分子的血清半衰期的多肽的n或c端的融合。在某些实施方案中,改变本文中提供的双特异性抗原结合分子以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列,使得创建或去除一个或多个糖基化位点来方便地获得分子的糖基化变体。在含有tnf配体三聚体的抗原结合分子包含fc区的情况中,可改变附着于其的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体典型地包含分支的双触角寡糖,其一般通过n连接附着至fc区的ch2域的asn297。参见例如wrightetal.,tibtech15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物,例如甘露糖,n-乙酰葡糖胺(glcnac),半乳糖,和唾液酸,以及附着于双触角寡糖结构的“主干”中的glcnac的岩藻糖。在一些实施方案中,可进行双特异性抗原结合分子中的寡糖的修饰以创建具有某些改良特性的变体。在一个方面,提供具有缺乏(直接或间接)附着于fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的变体。此类岩藻糖基化变体可具有改善的adcc功能,参见例如美国专利公开号us2003/0157108(presta,l.)或us2004/0093621(kyowahakkokogyoco.,ltd)。在另一个方面,提供具有两分寡糖的本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的变体,例如,其中附着于fc区的双触角寡糖通过glcnac两分。此类变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的adcc功能,参见例如wo2003/011878(jean-mairet等人)；美国专利no.6,602,684(umana等人)；和us2005/0123546(umana等人)。还提供附着于fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。此类抗体变体可具有改善的cdc功能且在例如wo1997/30087(patel等人)；wo1998/58964(raju,s.)；和wo1999/22764(raju,s.)中描述。在某些方面,可能想要创建本发明的双特异性抗原结合分子的半胱氨酸工程化改造的变体,例如“thiomab”,其中分子的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在特定方面,替代的残基出现于分子的可及位点。通过用半胱氨酸替代那些残基,由此反应性硫醇基团放置在抗体的可及位点且可用于将抗体与其它模块诸如药物模块或接头-药物模块缀合以创建免疫缀合物。在某些方面,可以用半胱氨酸替代任一个或多个下述残基:轻链的v205(kabat编号方式)；重链的a118(eu编号方式)；和重链fc区的s400(eu编号方式)。可以如例如美国专利no.7,521,541中所述生成半胱氨酸工程化改造的抗原结合分子。术语“多核苷酸”指分离的核酸分子或构建物,例如信使rna(mrna),病毒衍生的rna,或质粒dna(pdna)。多核苷酸可包含常规的磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键,诸如在肽核酸(pna)中找到的)。术语“核酸分子”指多核苷酸中存在的任一个或多个核酸区段,例如dna或rna片段。“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已经自其天然环境移出的核酸分子,dna或rna。例如,出于本发明的目的,认为载体中包含的编码多肽的重组多核苷酸是分离的。分离的多核苷酸的别的例子包括在异源宿主细胞中维持的重组多核苷酸或溶液中(部分或实质性)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括正常情况下含有该多核苷酸分子的细胞中含有的多核苷酸分子,但是该多核苷酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置。分离的rna分子包括本发明的体内或体外rna转录物,以及正和负链形式,和双链形式。依照本发明的分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成生成的此类分子。另外,多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件,诸如启动子,核糖体结合位点,或转录终止子。具有与本发明的参照核苷酸序列至少例如95％“同一”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸意指除了该多核苷酸序列可包括至多该参照核苷酸序列的每100个核苷酸的5个点突变之外,该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列同一。换言之,为了获得具有与参照核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列的多核苷酸,参照序列中至多5％的核苷酸可以删除或用另一种核苷酸替代,或者,在参照序列中,总核苷酸的至多5％的数目的多个核苷酸可插入参照序列。参照序列的这些改变可发生于参照核苷酸序列的5’或3’端位置或那些末端位置之间的任何地方,或是在参照序列中的残基间个别散布或是以一个或多个连续组在参照序列内散布。实际上,使用已知的计算机程序,诸如上文关于多肽讨论的(例如align-2),可常规确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％或99％同一。术语“表达盒”指重组或合成生成的多核苷酸,具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列规定核酸元件。重组表达盒可并入质粒,染色体,线粒体dna,质体dna,病毒,或核酸片段。典型地,在其它序列以外,表达载体的重组表达盒部分包括要转录的核酸序列和启动子。在某些实施方案中,本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。术语“载体”或“表达载体”与“表达构建物”同义且指用于将与其可操作联合的特定基因导入靶细胞并指导表达的dna分子。该术语包括作为自身复制性核酸结构的载体以及并入其已经导入的宿主细胞的基因组的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体容许大量稳定mrna的转录。一旦表达载体在靶细胞内,则由细胞转录和/或翻译机制生成由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中,本发明的表达载体包含包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列的表达盒。术语“宿主细胞”,“宿主细胞系”,和“宿主细胞培养物”可互换使用且指其中已经导入外源核酸的细胞,包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体/转化子”和“转化细胞”,其包括原代转化细胞和自其衍生的后代,不管传代的次数。后代在核酸内容方面与亲本细胞可以不是完全同一,但是可含有突变。具有与在原始转化细胞中筛选或选择相同的功能或生物学活性的突变体后代包括在本文中。宿主细胞是可用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞,例如培养的哺乳动物细胞,诸如cho细胞,bhk细胞,ns0细胞,sp2/0细胞,yo骨髓瘤细胞,p3x63小鼠骨髓瘤细胞,per细胞,per.c6细胞或杂交瘤细胞,酵母细胞,昆虫细胞,和植物细胞,仅列举少数,但是还有转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。药剂的“有效量”指在接受其施用的细胞或组织中导致生理变化必需的量。药剂(例如药用组合物)的“治疗有效量”指在剂量和时间段方面有效实现想要的治疗或预防结果必需的量。例如,治疗有效量的药剂消除,减轻/减少,延迟,最小化或预防疾病的不利影响。“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛,绵羊,猫,犬,和马),灵长类(例如人和非人灵长类,诸如猴),家兔,和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。特定地,个体或受试者是人。术语“药用组合物”指其为此类形式的制剂,所述形式允许其中含有的活性组分的生物学活性是有效的,而且所述制剂不含另外的对会接受该配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的成分。“药学可接受赋形剂”指药用组合物中除了活性组分以外,对受试者无毒的组分。药学可接受赋形剂包括但不限于缓冲剂,稳定剂,或防腐剂。术语“包装插页”用于指通常包括在治疗性产品的商业包装中的说明书,其含有关于关注此类治疗性产品的使用的适应症,用法,剂量,施用,组合疗法,禁忌症和/或警告的信息。如本文中使用的,“治疗/处理”指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预,而且可以或是为了预防或是在临床病理学的过程中实施的。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发,缓解症状,削弱疾病的任何直接或间接病理学后果,预防转移,减缓疾病进展的速率,改善或减轻疾病状态,和消退或改善的预后。在一些实施方案中,使用本发明的分子来延迟疾病的发生或减缓疾病的进展。如本文中使用的术语“癌症”指增殖性疾病,诸如淋巴瘤,淋巴细胞性白血病,肺癌,非小细胞肺(nscl)癌,支气管肺泡细胞肺癌,骨癌,胰腺癌,皮肤癌,头或颈癌,皮肤或眼内黑素瘤,子宫癌,卵巢癌,直肠癌,肛门区癌,胃癌,胃的癌,结肠癌,乳腺癌,子宫癌,输卵管癌,子宫内膜癌,宫颈癌,阴道癌,外阴癌,霍奇金(hodgkin)氏病,食管癌,小肠癌,内分泌系统的癌症,甲状腺癌,甲状旁腺癌,肾上腺癌,软组织肉瘤,尿道癌,阴茎癌,前列腺癌,膀胱癌,肾或输尿管癌,肾细胞癌,肾盂癌,间皮瘤,肝细胞癌,胆道癌,中枢神经系统(cns)赘生物,脊索瘤,脑干胶质瘤,多形性成胶质细胞瘤,星形细胞瘤,施旺细胞瘤,室管膜瘤,成神经管细胞瘤,脑膜瘤,鳞状细胞癌,垂体腺瘤和尤因氏肉瘤,包括任何上述癌症的顽固性形式,或一种或多种上述癌症的组合。本发明的双特异性抗体本发明提供了具有特别有利的性质的新颖的双特异性抗原结合分子,所述性质诸如可生产性,稳定性,结合亲和力,生物学活性,靶向效率和降低的毒性。例示性的双特异性抗原结合分子在一个方面,本发明提供双特异性抗原结合分子,其包含(a)至少一个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,(b)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域,其中该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含重链可变区(vh4-1bb),该重链可变区(vh4-1bb)包含(i)包含seqidno:1的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:2的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:3的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vl4-1bb),该轻链可变区(vl4-1bb)包含(iv)包含seqidno:4的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:5的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:6的氨基酸序列的cdr-l3。在一个特定方面,这些双特异性抗原结合分子特征在于靶向性激动性结合4-1bb。特别地,该双特异性抗原结合分子是靶向肿瘤相关靶细胞抗原的4-1bb激动剂。在一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其包含至少一个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,其中所述抗原结合域包含重链可变区(vh4-1bb),该重链可变区(vh4-1bb)包含与seqidno:7的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vl4-1bb),该轻链可变区(vl4-1bb)包含与seqidno:8的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。在一个特定方面,该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区(vh4-1bb)和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区(vl4-1bb)。在一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其包含至少一个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,其中该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域是fab片段。在另一个方面,本发明的双特异性抗原结合分子包含至少两个如本文中之前定义的能够特异性结合4-1bb的抗原结合域。特别地,本发明的双特异性抗原结合分子包含两个如本文中之前定义的能够特异性结合4-1bb的抗原结合域。在另一个特定方面,本发明的双特异性抗原结合分子包含四个如本文中之前定义的能够特异性结合4-1bb的抗原结合域。本发明的双特异性抗原结合分子进一步特征在于包含至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域。如此,该双特异性抗原结合分子拥有胜过能够特异性结合4-1bb的常规抗体的优势,即它们在靶细胞,典型地是癌细胞处选择性诱导共刺激性t细胞应答。在一个方面,该靶细胞抗原选自由成纤维细胞激活蛋白(fap),黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(mcsp),表皮生长因子受体(egfr),癌胚抗原(cea),cd19,cd20和cd33组成的组。特别地,该靶细胞抗原选自成纤维细胞激活蛋白(fap),癌胚抗原(cea)和cd19。在一个特定方面,该靶细胞抗原选自成纤维细胞激活蛋白(fap)和癌胚抗原(cea)。在另一个特定方面,该靶细胞抗原是cd19。双特异性抗原结合分子,其中该靶细胞抗原是fap在一个特定方面,该靶细胞抗原是成纤维细胞激活蛋白(fap)。fap结合模块已经描述于wo2012/02006,通过援引将其完整包括。下文描述了特别感兴趣的fap结合模块。在一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(fap)的抗原结合域包含(a)重链可变区(vhfap),该重链可变区(vhfap)包含(i)包含seqidno:9的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:10的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:11的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlfap),该轻链可变区(vlfap)包含(iv)包含seqidno:12的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:13的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:14的氨基酸序列的cdr-l3,或(b)重链可变区(vhfap),该重链可变区(vhfap)包含(i)包含seqidno:15的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:16的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:17的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlfap),该轻链可变区(vlfap)包含(iv)包含seqidno:18的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:19的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:20的氨基酸序列的cdr-l3。特别地,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合fap的抗原结合域包含重链可变区(vhfap),该重链可变区(vhfap)包含(i)包含seqidno:15的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:16的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:17的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlfap),该轻链可变区(vlfap)包含(iv)包含seqidno:18的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:19的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:20的氨基酸序列的cdr-l3。在另一个方面,该能够特异性结合fap的抗原结合域包含重链可变区(vhfap),该重链可变区(vhfap)包含(i)包含seqidno:9的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:10的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:11的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlfap),该轻链可变区(vlfap)包含(iv)包含seqidno:12的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:13的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:14的氨基酸序列的cdr-l3。特别地,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(fap)的抗原结合域包含(a)重链可变区(vhfap),该重链可变区(vhfap)包含与seqidno:21的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlfap),该轻链可变区(vlfap)包含与seqidno:22的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,或(b)重链可变区(vhfap),该重链可变区(vhfap)包含与seqidno:23的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlfap),该轻链可变区(vlfap)包含与seqidno:24的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。在一个方面,该能够特异性结合fap的抗原结合域包含包含seqidno:21的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:22的氨基酸序列的轻链可变区或该能够特异性结合fap的抗原结合域包含包含seqidno:23的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:24的氨基酸序列的轻链可变区。结合4-1bb和fap的双特异性抗原结合分子在另一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合fap的抗原结合域包含包含seqidno:23的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:24的氨基酸序列的轻链可变区。在又一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合fap的抗原结合域包含包含seqidno:21的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:22的氨基酸序列的轻链可变区。结合小鼠4-1bb的双特异性抗原结合分子在另一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其包含至少一个能够特异性结合小鼠4-1bb的抗原结合域,至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域和由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域,其中该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含重链可变区(vh4-1bb),该重链可变区(vh4-1bb)包含(i)包含seqidno:171的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:172的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:173的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vl4-1bb),该轻链可变区(vl4-1bb)包含(iv)包含seqidno:174的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:175的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:176的氨基酸序列的cdr-l3。在另一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其包含至少一个能够特异性结合小鼠4-1bb的抗原结合域,至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域和由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域,其中该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含重链可变区(vh4-1bb),该重链可变区(vh4-1bb)包含(i)包含seqidno:171的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:172的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:173的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vl4-1bb),该轻链可变区(vl4-1bb)包含(iv)包含seqidno:174的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:175的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:176的氨基酸序列的cdr-l3,且其中该能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域结合成纤维细胞激活蛋白(fap)且包含(a)重链可变区(vhfap),该重链可变区(vhfap)包含(i)包含seqidno:9的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:10的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:11的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlfap),该轻链可变区(vlfap)包含(iv)包含seqidno:12的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:13的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:14的氨基酸序列的cdr-l3。在一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合小鼠4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:177的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:178的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合fap的抗原结合域包含包含seqidno:21的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:22的氨基酸序列的轻链可变区。在一个特定方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其包含至少一个能够特异性结合小鼠4-1bb的抗原结合域,其中该fc域的第一亚基包含氨基酸替代k392d和k409d(编号方式依照kabateu索引)且该fc区的第二亚基包含氨基酸替代e356k和d399k(编号方式依照kabateu索引)。双特异性抗原结合分子,其中该靶细胞抗原是cea在一个特定方面,该靶细胞抗原是癌胚抗原(cea)。cea结合模块已经描述于例如wo2016/075278a2或wo2007/071426,通过援引将其完整包括。下文描述了特别感兴趣的cea结合模块。在一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合癌胚抗原(cea)的抗原结合域包含(a)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含(i)包含seqidno:25的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:26的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:27的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含(iv)包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:29的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:30的氨基酸序列的cdr-l3,或(b)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含(i)包含seqidno:33的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:34的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:35的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含(iv)包含seqidno:36的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:37的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:38的氨基酸序列的cdr-l3,或(c)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含(i)包含seqidno:179的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:180的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:181的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含(iv)包含seqidno:182的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:183的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:184的氨基酸序列的cdr-l3,或(d)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含(i)包含seqidno:187的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:188的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:189的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含(iv)包含seqidno:190的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:191的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:192的氨基酸序列的cdr-l3。特别地,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合cea的抗原结合域包含重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含(i)包含seqidno:25的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:26的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:27的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含(iv)包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:29的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:30的氨基酸序列的cdr-l3。在另一个方面,该能够特异性结合cea的抗原结合域包含重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含(i)包含seqidno:33的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:34的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:35的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含(iv)包含seqidno:36的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:37的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:38的氨基酸序列的cdr-l3。在又一个方面,该能够特异性结合cea的抗原结合域包含重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含(i)包含seqidno:179的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:180的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:181的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含(iv)包含seqidno:182的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:183的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:184的氨基酸序列的cdr-l3。在又一个方面,该能够特异性结合cea的抗原结合域包含重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含(i)包含seqidno:187的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:188的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:189的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含(iv)包含seqidno:190的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:191的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:192的氨基酸序列的cdr-l3。特别地,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合癌胚抗原(cea)的抗原结合域包含(a)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含与seqidno:31的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含与seqidno:32的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,或(b)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含与seqidno:39的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含与seqidno:40的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,或(c)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含与seqidno:185的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含与seqidno:186的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,或(d)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含与seqidno:193的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含与seqidno:194的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。在一个方面,该能够特异性结合cea的抗原结合域包含包含seqidno:31的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:32的氨基酸序列的轻链可变区或该能够特异性结合fap的抗原结合域包含包含seqidno:39的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:40的氨基酸序列的轻链可变区。在又一个方面,该能够特异性结合cea的抗原结合域包含包含seqidno:185的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:186的氨基酸序列的轻链可变区或该能够特异性结合fap的抗原结合域包含包含seqidno:193的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:194的氨基酸序列的轻链可变区。结合4-1bb和cea的双特异性抗原结合分子在另一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合fap的抗原结合域包含包含seqidno:31的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:32的氨基酸序列的轻链可变区。在又一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合fap的抗原结合域包含包含seqidno:39的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:40的氨基酸序列的轻链可变区。在又一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合fap的抗原结合域包含包含seqidno:185的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:186的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合fap的抗原结合域包含包含seqidno:193的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:194的氨基酸序列的轻链可变区。双特异性抗原结合分子,其中该靶细胞抗原是cd19在一个特定方面,该靶细胞抗原是cd19。cd19结合模块已经描述于例如wo2016/075278a1,通过援引将其完整包括。下文描述了特别感兴趣的cd19结合模块。在一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合cd19的抗原结合域包含(a)重链可变区(vhcd19),该重链可变区(vhcd19)包含(i)包含seqidno:155的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:156的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:157的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcd19),该轻链可变区(vlcd19)包含(iv)包含seqidno:158的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:159的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:160的氨基酸序列的cdr-l3,或(b)重链可变区(vhcd19),该重链可变区(vhcd19)包含(i)包含seqidno:163的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:164的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:165的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcd19),该轻链可变区(vlcd19)包含(iv)包含seqidno:166的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:167的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:168的氨基酸序列的cdr-l3。特别地,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合cd19的抗原结合域包含重链可变区(vhcd19),该重链可变区(vhcd19)包含(i)包含seqidno:155的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:156的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:157的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcd19),该轻链可变区(vlcd19)包含(iv)包含seqidno:158的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:159的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:160的氨基酸序列的cdr-l3。在另一个方面,该能够特异性结合cd19的抗原结合域包含重链可变区(vhcd19),该重链可变区(vhcd19)包含(i)包含seqidno:163的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:164的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:165的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcd19),该轻链可变区(vlcd19)包含(iv)包含seqidno:166的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:167的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:168的氨基酸序列的cdr-l3。特别地,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合cd19的抗原结合域包含(a)重链可变区(vhcd19),该重链可变区(vhcd19)包含与seqidno:161的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlcd19),该轻链可变区(vlcd19)包含与seqidno:162的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,或(b)重链可变区(vhcd19),该重链可变区(vhcd19)包含与seqidno:169的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlcd19),该轻链可变区(vlcd19)包含与seqidno:170的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。在一个方面,该能够特异性结合cd19的抗原结合域包含包含seqidno:161的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:162的氨基酸序列的轻链可变区或该能够特异性结合fap的抗原结合域包含包含seqidno:169的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:170的氨基酸序列的轻链可变区。结合4-1bb和cd19的双特异性抗原结合分子在另一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合fap的抗原结合域包含包含seqidno:161的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:162的氨基酸序列的轻链可变区。在又一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合fap的抗原结合域包含包含seqidno:169的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:170的氨基酸序列的轻链可变区。双特异性,单价抗原结合分子(1+1格式)在一个方面,本发明涉及双特异性抗原结合分子,其包含(a)一个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,(b)一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在一个特定方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中所述分子包含(a)能够特异性结合4-1bb的第一fab片段,(b)能够特异性结合靶细胞抗原的第二fab片段,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域；其中该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含重链可变区(vh4-1bb),该重链可变区(vh4-1bb)包含(i)包含seqidno:1的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:2的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:3的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vl4-1bb),该轻链可变区(vl4-1bb)包含(iv)包含seqidno:4的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:5的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:6的氨基酸序列的cdr-l3。在一个方面,该靶细胞抗原是fap。在一个方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)能够特异性结合4-1bb的第一fab片段,(b)能够特异性结合fap的第二fab片段,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域；其中该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含重链可变区(vh4-1bb),该重链可变区(vh4-1bb)包含(i)包含seqidno:1的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:2的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:3的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vl4-1bb),该轻链可变区(vl4-1bb)包含(iv)包含seqidno:4的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:5的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:6的氨基酸序列的cdr-l3。在一个特定方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含包含seqidno:126的氨基酸序列的第一轻链,包含seqidno:127的氨基酸序列的第二轻链,包含seqidno:124的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:125的氨基酸序列的第二重链。双特异性抗原结合分子对于结合4-1bb是二价的且对于结合该靶细胞抗原是单价的(2+1格式)在另一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)两个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,(b)一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域；其中该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含重链可变区(vh4-1bb),该重链可变区(vh4-1bb)包含(i)包含seqidno:1的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:2的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:3的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vl4-1bb),该轻链可变区(vl4-1bb)包含(iv)包含seqidno:4的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:5的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:6的氨基酸序列的cdr-l3。如此,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中该双特异性抗原结合分子对于4-1bb是二价的且对于靶细胞抗原是单价的。在一个方面,该双特异性抗原结合分子包含(a)包含两个能够特异性结合4-1bb的fab片段和fc域的抗体的两条轻链和两条重链,和(b)能够特异性结合靶细胞抗原的vh和vl域,其中该vh域和该vl域每个经由肽接头连接至两条重链的c端之一。在一个特定方面,该肽接头包含选自seqidno:109,seqidno:110,seqidno:114和seqidno:115的氨基酸序列。更加特别地,该肽接头包含seqidno:115。在一个特定方面,该双特异性抗原结合分子包含(a)包含两个能够特异性结合4-1bb的fab片段和fc域的抗体的两条轻链和两条重链,和(b)能够特异性结合靶细胞抗原的vh和vl域,其中该vh域经由肽接头连接至该重链之一的c端且其中该vl域经由肽接头连接至第二重链的c端。在另一个特定方面,该双特异性抗原结合分子包含(a)包含两个能够特异性结合4-1bb的fab片段和fc域的抗体的两条轻链和两条重链,和(b)能够特异性结合靶细胞抗原的vh和vl域,其中该vh域经由肽接头连接至fc节重链的c端且其中该vl域经由肽接头连接至fc穴重链的c端。在一个方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)两个能够特异性结合4-1bb的fab片段,(b)能够特异性结合fap的vh和vl域,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在一个特定方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:44的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:45的氨基酸序列的第二重链,或(b)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:49的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:50的氨基酸序列的第二重链。在另一个方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)两个能够特异性结合4-1bb的fab片段,(b)能够特异性结合cea的vh和vl域,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在一个特定方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:65的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:66的氨基酸序列的第二重链,或(b)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:69的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:70的氨基酸序列的第二重链,或(c)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:73的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:74的氨基酸序列的第二重链,或(d)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:77的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:78的氨基酸序列的第二重链。在又一个特定方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(e)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:137的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:74的氨基酸序列的第二重链,或(f)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:138的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:78的氨基酸序列的第二重链。在又一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(g)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:195的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:196的氨基酸序列的第二重链,或(h)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:197的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:198的氨基酸序列的第二重链,或(i)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:199的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:200的氨基酸序列的第二重链,或(j)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:201的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:202的氨基酸序列的第二重链。在又一个方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)两个能够特异性结合4-1bb的fab片段,(b)能够特异性结合cd19的vh和vl域,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在一个特定方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:139的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:140的氨基酸序列的第二重链,或(b)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:141的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:142的氨基酸序列的第二重链,或(c)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:143的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:144的氨基酸序列的第二重链,或(d)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:145的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:146的氨基酸序列的第二重链。对于结合4-1bb是二价的且对于结合靶细胞抗原是单价的双特异性抗原结合分子(2+1交叉fab格式)在另一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)两个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,(b)一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域；其中该能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域是交叉fab片段；且其中该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含重链可变区(vh4-1bb),该重链可变区(vh4-1bb)包含(i)包含seqidno:1的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:2的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:3的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vl4-1bb),该轻链可变区(vl4-1bb)包含(iv)包含seqidno:4的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:5的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:6的氨基酸序列的cdr-l3。在一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中该两个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域是fab片段且该能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域是交叉fab片段。在一个方面,该双特异性抗原结合分子包含(a)包含两个能够特异性结合4-1bb的fab片段和fc域的抗体的两条轻链和两条重链,和(b)能够特异性结合靶细胞抗原的交叉fab片段经由肽接头连接至该两条重链之一的c端。在一个特定方面,该肽接头包含选自seqidno:109,seqidno:110,seqidno:114和seqidno:115的氨基酸序列。更加特别地,该肽接头包含seqidno:115。在一个方面,包含两个能够特异性结合4-1bb的fab片段的抗体的两条重链包含节-入-穴突变且经由肽接头连接至重链的c端的能够特异性结合靶细胞抗原的交叉fab片段包含节突变。在另一个方面,经由肽接头连接至重链的c端的能够特异性结合靶细胞抗原的交叉fab片段包含穴突变。在一个特定方面,该双特异性抗原结合分子包含(a)包含两个能够特异性结合4-1bb的fab片段和fc域的抗体的两条轻链和两条重链,和(b)经由肽接头连接至该两条重链之一的c端的能够特异性结合靶细胞抗原的交叉fab(chcl)片段。在另一个特定方面,该双特异性抗原结合分子包含(a)包含两个能够特异性结合4-1bb的fab片段和fc域的抗体的两条轻链和两条重链,和(b)经由肽接头连接至该两条重链之一的c端的能够特异性结合靶细胞抗原的交叉fab(vhvl)片段。在一个特定方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中在两个结合4-1bb的fab片段的cl域中位置123(eu编号方式)处的氨基酸已经用精氨酸(r)替换且位置124(eu编号方式)处的氨基酸已经用赖氨酸(k)替换,且其中在两个结合4-1bb的fab片段的ch1域在位置147(eu编号方式)处和在位置213(eu编号方式)处的氨基酸已经用谷氨酸(e)替代。在一个方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)两个能够特异性结合4-1bb的fab片段,(b)能够特异性结合fap的交叉fab片段,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在另一个方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)两个能够特异性结合4-1bb的fab片段,(b)能够特异性结合cea的交叉fab片段,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在另一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,包含(a)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:211的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:212的氨基酸序列的第二重链,和包含seqidno:213的氨基酸序列的别的轻链,或(b)每条包含seqidno:216的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:214的氨基酸序列的第一重链,包含seqidno:215的氨基酸序列的第二重链,和包含seqidno:217的氨基酸序列的别的轻链。在又一个方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)两个能够特异性结合4-1bb的fab片段,(b)能够特异性结合cd19的交叉fab片段,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。对于结合4-1bb是四价的且对于结合靶细胞抗原是单价的双特异性抗原结合分子(4+1格式)在另一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)四个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,(b)一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域；其中该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含重链可变区(vh4-1bb),该重链可变区(vh4-1bb)包含(i)包含seqidno:1的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:2的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:3的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vl4-1bb),该轻链可变区(vl4-1bb)包含(iv)包含seqidno:4的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:5的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:6的氨基酸序列的cdr-l3。如此,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中该双特异性抗原结合分子对于4-1bb是四价的且对于靶细胞抗原是单价的。在一个方面,提供的是一种双特异性抗原结合分子,其中四个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域是fab片段且其每两个彼此融合,任选经由肽接头。在一个特定方面,该肽接头包含seqidno:110的氨基酸序列。更加特别地,该抗原结合分子包含每个包含vhch1-肽接头-vhch1片段的两条重链。在一个特定方面,该肽接头具有seqidno:110的氨基酸序列。在另一个方面,提供了一种双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域包含vh和vl域且其中该vh域经由肽接头连接至该fc域的第一亚基的c端且该vl域经由肽接头连接至该fc域的第二亚基的c端。在一个特定方面,该双特异性抗原结合分子包含(a)包含两个能够特异性结合4-1bb的fab片段和fc域的抗体的四条轻链和两条重链,和(b)能够特异性结合靶细胞抗原的vh和vl域,其中该vh域经由肽接头连接至该重链之一的c端且其中该vl域经由肽接头连接至第二重链的c端。在一个方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)四个能够特异性结合4-1bb的fab片段,(b)能够特异性结合fap的vh和vl域,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在一个特定方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四条轻链,包含seqidno:57的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:58的氨基酸序列的第二重链,或(b)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四条轻链,包含seqidno:61的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:62的氨基酸序列的第二重链。在另一个方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)四个能够特异性结合4-1bb的fab片段,(b)能够特异性结合cea的vh和vl域,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在一个特定方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四条轻链,包含seqidno:81的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:82的氨基酸序列的第二重链,或(b)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四条轻链,包含seqidno:85的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:86的氨基酸序列的第二重链,或(c)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四条轻链,包含seqidno:89的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:90的氨基酸序列的第二重链,或(d)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四条轻链,包含seqidno:93的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:94的氨基酸序列的第二重链。在另一个方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(e)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四条轻链,包含seqidno:203的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:204的氨基酸序列的第二重链,或(f)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四条轻链,包含seqidno:205的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:206的氨基酸序列的第二重链,或(g)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四条轻链,包含seqidno:207的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:208的氨基酸序列的第二重链,或(h)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四条轻链,包含seqidno:209的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:210的氨基酸序列的第二重链。在又一个方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)四个能够特异性结合4-1bb的fab片段,(b)能够特异性结合cd19的vh和vl域,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在一个特定方面,本发明提供一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四条轻链,包含seqidno:147的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:148的氨基酸序列的第二重链,或(b)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四条轻链,包含seqidno:149的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:150的氨基酸序列的第二重链,或(c)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四条轻链,包含seqidno:151的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:152的氨基酸序列的第二重链,或(d)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四条轻链,包含seqidno:153的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:154的氨基酸序列的第二重链。降低fc受体结合和/或效应器功能的fc域修饰本发明的双特异性抗原结合分子进一步包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。在某些方面,可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的fc区中,由此生成fc区变体。fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人fc区序列(例如人igg1,igg2,igg3或igg4fc区)。fc域赋予本发明的双特异性抗体以有利的药动学特性,包括长血清半衰期,其有助于在靶组织中的较好积累和有利的组织-血液分配比。然而,同时它可能导致不想要的本发明的双特异性抗体对表达fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞的靶向。因而,在具体的实施方案中,本发明的双特异性抗体的fc域展现出与天然iggfc域,特别是igg1fc域或igg4fc域相比降低的对fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。更加特别地,fc域是igg1fc域。在一个此类方面,fc域(或包含所述fc域的本发明的双特异性抗原结合分子)展现出与天然igg1fc域(或包含天然igg1fc域的本发明的双特异性抗原结合分子)相比少于50％,优选少于20％,更优选少于10％且最优选少于5％的对fc受体的结合亲和力,和/或与天然igg1fc域(或包含天然igg1fc域的本发明的双特异性抗原结合分子)相比少于50％,优选少于20％,更优选少于10％且最优选少于5％的效应器功能。在一个方面,fc域(或包含所述fc域的本发明的双特异性抗原结合分子)没有实质性结合fc受体和/或诱导效应器功能。在一个特定的方面,所述fc受体是fcγ受体。在一个方面,所述fc受体是人fc受体。在一个方面,所述fc受体是活化性fc受体。在一个具体的方面,所述fc受体是活化性人fcγ受体,更具体地是人fcγriiia,fcγri或fcγriia,最具体地是人fcγriiia。在一个方面,所述fc受体是抑制性fc受体。在一个具体的方面,所述fc受体是抑制性人fcγ受体,更具体地是人fcγriib。在一个方面,效应器功能是cdc,adcc,adcp,和细胞因子分泌中的一项或多项。在一个特定的方面,所述效应器功能是adcc。在一个方面,所述fc域展现出与天然igg1fc域相比基本相似的对新生儿fc受体(fcrn)的结合亲和力。当fc域(或包含所述fc域的本发明的双特异性抗原结合分子)展现出超过约70％,特别是超过约80％,更特别是超过约90％的天然igg1fc域(或包含天然igg1fc域的本发明的双特异性抗原结合分子)对fcrn的结合亲和力时,实现基本相似的对fcrn的结合。在一个特定的方面,fc域工程化改造为具有与非工程化fc域相比降低的对fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个特定的方面,本发明的双特异性抗原结合分子的fc域包含一处或多处降低fc域对fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。通常,fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸突变。在一个方面,所述氨基酸突变降低fc域对fc受体的结合亲和力。在另一个方面,所述氨基酸突变将fc域对fc受体的结合亲和力降低至少2倍,至少5倍,或至少10倍。在一个方面,包含工程化fc域的本发明的双特异性抗原结合分子展现出与包含非工程化fc域的本发明的双特异性抗体相比少于20％,特别是少于10％,更特别是少于5％的对fc受体的结合亲和力。在一个特定的方面,所述fc受体是fcγ受体。在其它方面,所述fc受体是人fc受体。在一个方面,所述fc受体是抑制性fc受体。在一个具体的方面,所述fc受体是抑制性人fcγ受体,更具体地是人fcγriib。在一些方面,所述fc受体是活化性fc受体。在一个具体的方面,所述fc受体是活化性人fcγ受体,更特别是人fcγriiia,fcγri或fcγriia,最特别是人fcγriiia。优选地,对这些受体的每一种的结合是降低的。在一些方面,对补体成分的结合亲和力,特别是对c1q的结合亲和力也是降低的。在一个方面,对新生儿fc受体(fcrn)的结合亲和力没有降低。当fc域(或包含所述fc域的本发明的双特异性抗原结合分子)展现出非工程化形式的fc域(或包含所述非工程化形式的fc域的本发明的双特异性抗原结合分子)对fcrn的结合亲和力的超过约70％时,实现基本相似的对fcrn的结合,即保留该fc域对所述受体的结合亲和力。fc域或包含所述fc域的本发明的双特异性抗原结合分子可以展现出超过约80％和甚至超过约90％的此类亲和力。在某些实施方案中,本发明的双特异性抗原结合分子的fc域工程化改造为具有与非工程化fc域相比降低的效应器功能。所述降低的效应器功能可包括但不限于下列一项或多项:降低的补体依赖性细胞毒性(cdc),降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc),降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp),降低的细胞因子分泌,降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取,降低的对nk细胞的结合,降低的对巨噬细胞的结合,降低的对单核细胞的结合,降低的对多形核细胞的结合,降低的诱导凋亡的直接信号传导,降低的树突细胞成熟,或降低的t细胞引发。具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有fc区残基238,265,269,270,297,327和329中的一个或多个的替代的(美国专利no.6,737,056)。此类fc突变体包括在氨基酸位置265,269,270,297和327中的两处或更多处具有替代的fc突变体,包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“dana”fc突变体(美国专利no.7,332,581)。描述了具有改善的或降低的对fcr的结合的某些抗体变体(见例如美国专利no.6,737,056；wo2004/056312,及shields,r.l.etal.,j.biol.chem.276(2001)6591-6604)。在本发明的一个方面,fc域包含在e233,l234,l235,n297,p331和p329位置处的氨基酸替代。在一些方面,fc域包含氨基酸替代l234a和l235a(“lala”)。在一个此类实施方案中,fc域是igg1fc域,特别是人igg1fc域。在一个方面,fc域包含在位置p329处的氨基酸替代。在一个更加具体的方面,氨基酸替代是p329a或p329g,特别是p329g。在一个实施方案中,fc域包含在位置p329处的氨基酸替代和又一处选自下组的氨基酸替代:e233p,l234a,l235a,l235e,n297a,n297d或p331s。在更具体的实施方案中,所述fc域包含氨基酸突变l234a,l235a和p329g(“p329glala”)。氨基酸替代组合“p329glala”几乎完全消除了人igg1fc域的fcγ受体结合,如记载于pct专利申请no.wo2012/130831a1。所述文件还描述了制备此类突变体fc域的方法和用于测定其特性(诸如fc受体结合或效应器功能)的方法。此类抗体是具有突变l234a和l235a或具有突变l234a,l235a和p329g(编号方式依照kabatetal,kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,1991的eu索引)的igg1。在一个方面,fc域为igg4fc域。在一个更具体的实施方案中,fc域是包含在位置s228(kabat编号)处的氨基酸替代具体地为氨基酸替代s228p的igg4fc域。在一个更具体的实施方案中,fc域是包含氨基酸替代l235e和s228p和p329g的igg4fc域。这种氨基酸替代降低体内igg4抗体的fab臂交换(参见stubenrauchetal.,drugmetabolismanddisposition38,84-91(2010))。具有延长的半衰期和改善的对新生儿fc受体(fcrn)的结合的抗体记载于us2005/0014934,新生儿fc受体(fcrn)负责将母体igg转移至胎儿(guyer,r.l.etal.,j.immunol.117(1976)587-593及kim,j.k.etal.,j.immunol.24(1994)2429-2434)。那些抗体包含其中具有改善fc区对fcrn结合的一处或多处替代的fc区。此类fc变体包括那些在fc区残基238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,382,413,424或434中的一处或多处具有替代,例如,fc区残基434的替代的(美国专利no.7,371,826)。还可见duncan,a.r.andwinter,g.,nature322(1988)738-740；us5,648,260；us5,624,821；及wo94/29351,其关注fc区变体的其它例子。可以例如通过elisa或通过使用诸如biacore仪(gehealthcare)的标准仪器的表面等离子体共振(spr)容易地确定与fc受体的结合,并且可以例如通过重组表达获得fc受体。适合的此类结合测定描述于本文中。或者,可以使用已知表达特定fc受体的细胞系例如表达fcγiiia受体的人nk细胞来评估fc域或包含fc域的细胞活化性双特异性抗原结合分子针对fc受体的结合亲和力。可以通过本领域已知的方法测量fc域或包含fc域的本发明的双特异性抗原结合分子的效应器功能。适合的用于测量adcc的测定法描述于本文中。评估感兴趣分子的adcc活性的体外测定法的其它实例描述于美国专利no.5,500,362；hellstrom等人,proc.natlacadsciusa83,7059-7063(1986)和hellstrom等人,procnatlacadsciusa82,1499-1502(1985)；美国专利no.5,821,337；bruggemann等人,jexpmed166,1351-1361(1987)。或者,可以采用非放射性测定方法(参见,例如actitmnon-radioactivecytotoxicityassayforflowcytometry(celltechnology,inc.mountainview,ca)；和cytotoxnon-radioactivecytotoxicityassay(promega,madison,wi))。用于这种测定法的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(pbmc)和自然杀伤(nk)细胞。替代地,或另外地,可以在体内,例如,在clynes等人,procnatlacadsciusa95,652-656(1998)中公开的动物模型中评估感兴趣分子的adcc活性。下一节描述本发明的包含降低fc受体结合和/或效应器功能的fc域修饰的双特异性抗原结合分子的优选方面。在一个方面,本发明涉及双特异性抗原结合分子,其包含(a)至少一个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,(b)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域,其中该fc域包含一处或多处降低抗体对fc受体,特别是fcγ受体的结合亲和力的氨基酸替代。在另一个方面,本发明涉及双特异性抗原结合分子,其包含(a)至少一个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,(b)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域,其中该fc域包含一处或多处降低效应器功能的氨基酸替代。在特定的方面,该fc域是人igg1亚类的,其具有氨基酸突变l234a,l235a和p329g(编号方式依照kabateu索引)。促进异源二聚化的fc域修饰本发明的双特异性抗原结合分子包含与fc域的两个亚基中的一个或另一个融合的不同抗原结合位点,因此该fc域的两个亚基可包含在两条不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致两种多肽的数种可能的组合。为了在重组生产中提高本发明的双特异性抗原结合分子的产率和纯度,因此在本发明的双特异性抗原结合分子的fc域中引入促进期望多肽的联合的修饰会是有利的。因此,在特定的方面,本发明涉及双特异性抗原结合分子,其包含(a)至少一个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,(b)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域,其中该fc域包含促进fc域的第一和第二亚基联合的修饰。人iggfc域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在fc域的ch3域中。因此,在一个方面,所述修饰在fc域的ch3域中。在一个具体的方面,所述修饰是所谓的“节入穴”修饰,包括在fc域的两个亚基之一中的“节”修饰和fc域的两个亚基的另一个中的“穴”修饰。因此,本发明涉及双特异性抗原结合分子,其包含(a)至少一个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,(b)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域,其中依照该节入穴方法,该fc域的第一亚基包含节且该fc域的第二亚基包含穴。在一个特定的方面,该fc域的第一亚基包含氨基酸替代s354c和t366w(eu编号方式)且该fc域的第二亚基包含氨基酸替代y349c,t366s和y407v(编号方式依照kabateu索引)。“节入穴”技术例如描述于us5,731,168；us7,695,936；ridgway等人proteng9,617-621(1996)andcarter,jimmunolmeth248,7-15(2001)中。通常,该方法包括在第一多肽的界面处引入突起(“节”)并且在第二多肽的界面中引入相应的腔(“穴”),使得该突起可以定位在该腔中,从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建突起。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链,在第二多肽的界面中产生与突起具有相同或相似大小的补偿腔。因此,在一个方面,在本发明的双特异性抗原结合分子的fc域的第一亚基的ch3结构域中,将氨基酸残基替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基,由此在第一亚基的ch3结构域内产生可定位于第二亚基的ch3结构域内的腔中的突起；并且在fc域的第二亚基的ch3结构域中,将氨基酸残基替换为具有较小侧链体积的氨基酸酸残基,由此在第二亚基的ch3结构域内产生可将第一亚基的ch3结构域内的突起定位在其中的腔。可以通过改变编码多肽的核酸,例如通过位点特异性诱变,或通过肽合成而产生突起和腔。在一个具体方面,在fc域的第一亚基的ch3结构域中,第366位的苏氨酸残基替换为色氨酸残基(t366w),而在fc域的第二亚基的ch3结构域中,第407位酪氨酸残基替换为缬氨酸残基(y407v)。在一个方面,在fc域的第二亚基中,另外将366位的苏氨酸残基替换为丝氨酸残基(t366s),将368位的亮氨酸残基替换为丙氨酸残基(l368a)。在还有又一个方面,在fc域的第一亚基中,另外将第354位的丝氨酸残基替换为半胱氨酸残基(s354c),而在fc域的第二亚基中,另外将第349位酪氨酸残基替换为半胱氨酸残基(y349c)。引入这两个半胱氨酸残基导致在fc域的两个亚基之间形成二硫桥,其进一步使该二聚体稳定(carter(2001),jimmunolmethods248,7-15)。在一个特定的方面,该fc域的第一亚基包含氨基酸替代s354c和t366w(eu编号方式)且该fc域的第二亚基包含氨基酸替代y349c,t366s和y407v(编号方式依照kabateu索引)。在一个替代方面,促进fc域的第一和第二亚基的联合的修饰包括介导静电操纵效应的修饰,例如,如pct公开wo2009/089004中所述。通常,这种方法包括通过将两个fc域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电氨基酸残基,使得在静电方面不利于同二聚体形成,但在静电方面有利于异二聚化。如本文中报告的双特异性抗体的重链的c端可以是以氨基酸残基pgk结束的完整c端。重链的c端可以是缩短的c端,其中去除了一个或两个c端氨基酸残基。在一个优选的方面,重链的c端是以pg结束的缩短的c端。在如本文中报告的所有方面的一个方面,包含包括如本文中规定的c端ch3域的重链的双特异性抗体包含c端甘氨酸-赖氨酸二肽(g446和k447,编号方式依照kabateu索引)。在如本文中报告的所有方面的一个实施方案中,包含包括如本文中规定的c端ch3域的重链的双特异性抗体包含c端甘氨酸残基(g446,编号方式依照kabateu索引)。ch1/cl域中的修饰为了进一步改善正确配对,双特异性抗原结合分子可含有不同的带电荷氨基酸替代(所谓的“带电荷残基”)。将这些修饰引入交叉或非交叉ch1和cl域。在一个特定方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其中在cl域至少之一中位置123(eu编号方式)处的氨基酸已经用精氨酸(r)替换且位置124(eu编号方式)处的氨基酸已经用赖氨酸(k)替换,且其中在ch1域至少之一中位置147(eu编号方式)处和位置213(eu编号方式)处的氨基酸已经用谷氨酸(e)替换。更加特别地,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其中在结合4-1bb的fab域的cl域中位置123(eu编号方式)处的氨基酸已经用精氨酸(r)替换且位置124(eu编号方式)处的氨基酸已经用赖氨酸(k)替换,且其中在结合4-1bb的fab域的ch1域中位置147(eu编号方式)处和位置213(eu编号方式)处的氨基酸已经用谷氨酸(e)替换。fab域中的修饰在一个方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)能够特异性结合4-1bb的第一fab片段,(b)能够特异性结合靶细胞抗原的第二fab片段,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域,其中在该fab片段之一中可变域vh和vl或恒定域ch1和cl任一是交换的。该双特异性抗体依照crossmab技术来制备。具有一个结合臂中的域替换/交换的多特异性抗体(crossmabvh-vl或crossmabch-cl)详细记载于wo2009/080252和schaefer,w.etal,pnas,108(2011)11187-1191。它们清楚地减少由针对第一抗原的轻链与错误的针对第二抗原的重链错配引起的副产物(与没有此类域交换的办法相比)。在一个方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)能够特异性结合4-1bb的第一fab片段,(b)能够特异性结合靶细胞抗原的第二fab片段,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域,其中在该fab片段之一中恒定域cl和ch1彼此替换使得该ch1域是轻链的一部分且该cl域是重链的一部分(ch-clcrossmab)。在另一个方面,在该fab片段之一中可变域vl和vh彼此替换使得该vh域是轻链的一部分且该vl域是重链的一部分(vh-vlcrossmab)。更加特别地,在能够特异性结合靶细胞抗原的第二fab片段中恒定域cl和ch1彼此替换使得该ch1域是轻链的一部分且该cl域是重链的一部分。在一个特定的方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)能够特异性结合4-1bb的第一fab片段,(b)能够特异性结合靶细胞抗原的第二fab片段,其中恒定域cl和ch1彼此替换使得该ch1域是轻链的一部分且该cl域是重链的一部分。此类分子称作单价双特异性抗原结合分子。在另一个方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)包含两个能够特异性结合4-1bb的fab片段和fc域的抗体的两条轻链和两条重链,和(b)两个另外的能够特异性结合靶细胞抗原的fab片段,其中所述另外的fab片段各自经肽接头连接至(a)的重链的c端。在一个特定的方面,该另外的fab片段是fab片段,其中可变域vl和vh彼此替换使得该vh域是轻链的一部分且该vl域是重链的一部分。如此,在一个方面,本发明包含一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)包含两个能够特异性结合4-1bb的fab片段和fc域的抗体的两条轻链和两条重链,和(b)两个另外的能够特异性结合靶细胞抗原的fab片段,其中所述两个另外的能够特异性结合靶细胞抗原的fab片段是交换fab片段,其中可变域vl和vh彼此替换且vl-ch链各自经肽接头连接至(a)的重链的c端。在另一个方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)包含两个能够特异性结合4-1bb的fab片段和fc域的抗体的两条轻链和两条重链,和(b)一个能够特异性结合靶细胞抗原的另外的fab片段,其中所述另外的fab片段经由肽接头连接至(a)的重链之一的c端。在一个特定方面,该另外的fab片段是fab片段,其中可变域vl和vh是彼此替换的,使得该vh域是轻链的一部分且该vl域是重链的一部分。在另一个方面,该另外的fab片段是fab片段,其中恒定域cl和ch1是彼此替换的,使得该ch1域是轻链的部分且该cl域是重链的部分。多核苷酸本发明进一步提供了编码如本文中描述的双特异性抗原结合分子的分离的多核苷酸或其片段。编码本发明的双特异性抗原结合分子的分离的多核苷酸可以表述为编码整个抗原结合分子的单个多核苷酸或共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以通过例如二硫键或其它手段联合以形成功能性抗原结合分子。例如,免疫球蛋白的轻链部分可以由与免疫球蛋白的重链部分分开的多核苷酸编码。重链多肽将在共表达时与轻链多肽联合以形成免疫球蛋白。在一些方面,该分离的多核苷酸编码依照如本文中描述的发明的双特异性分子中包含的多肽。在一个方面,本发明针对一种分离的多核苷酸,其编码双特异性抗原结合分子,其包含(a)至少一个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,(b)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域,其中该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含重链可变区(vh4-1bb),该重链可变区(vh4-1bb)包含(i)包含seqidno:1的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:2的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:3的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vl4-1bb),该轻链可变区(vl4-1bb)包含(iv)包含seqidno:4的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:5的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:6的氨基酸序列的cdr-l3。在某些实施方案中,该多核苷酸或核酸是dna。在其它实施方案中,本发明的多核苷酸是rna,例如处于信使rna(mrna)的形式。本发明的rna可以是单链或双链的。重组方法可以例如通过重组生产获得本发明的双特异性抗原结合分子。对于重组生产,提供编码双特异性抗原结合分子或其多肽片段的一个或多个多核苷酸。将编码该双特异性抗原结合分子的该一个或多个多核苷酸分离并插入到一个或多个载体中用于进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。可以使用常规程序容易地分离这样的多核苷酸并将其测序。在本发明的一个方面,提供了包含一个或多个本发明的多核苷酸的载体,优选表达载体。可使用本领域技术人员熟知的方法构建包括双特异性抗原结合分子(片段)的编码序列以及适当的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术,合成技术和体内重组/遗传重组。参见,例如描述于maniatis等人,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,n.y.(1989)；和ausubel等人,currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingassociatesandwileyinterscience,n.y.(1989)中的技术。表达载体可以是质粒,病毒的一部分,或者可以是核酸片段。表达载体包括将编码双特异性抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸(即,编码区)与启动子和/或其它转录或翻译控制元件以可操作地关联的方式克隆到其中的表达盒。如本文中使用的,“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸部分。虽然“终止密码子”(tag,tga或taa)不翻译成氨基酸,但如果存在的话,它可被认为是编码区的一部分,但任何侧翼序列,例如启动子,核糖体结合位点,转录终止子,内含子,5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。在单个多核苷酸构建体中,例如,在单个载体上,或在单独的多核苷酸构建体中,例如,在单独的(不同的)载体上可以存在两个或更多个编码区。此外,任何载体可以包含单个编码区,或者可以包含两个或更多个编码区,例如本发明的载体可以编码一个或多个多肽,其通过蛋白水解切割在翻译后或以共翻译方式分离成最终的蛋白质。另外,本发明的载体,多核苷酸或核酸可以编码异源编码区,所述异源编码区与编码本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合。异源编码区包括但不限于专门的元件或基序,例如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作地关联是指这样一种方式:基因产物例如多肽的编码区与一个或多个调节序列相关联以使基因产物的表达在调节序列的影响或控制下进行。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mrna的转录,并且如果两个dna片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或不干扰dna模板被转录的能力,则所述两个dna片段(例如多肽编码区和与其关联的启动子)是“可操作地关联的”。因此,如果启动子能够影响编码多肽的核酸的转录,则启动子区与该核酸可操作地关联。启动子可以是仅在预定细胞中指导实质性dna转录的细胞特异性启动子。除了启动子之外,其它转录控制元件例如增强子,操纵子,阻抑物和转录终止信号,可与多核苷酸可操作地关联以指导细胞特异性转录。本文中公开了适合的启动子和其它转录控制区。许多转录控制区是本领域中的技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区,例如但不限于来自巨细胞病毒(例如立即早期启动子,与内含子a结合),猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(如,例如劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其它转录控制区包括衍生自脊椎动物基因如肌动蛋白,热休克蛋白,牛生长激素和兔α珠蛋白的那些转录控制区,以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序列。另外的适合的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地,许多翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点,翻译起始和终止密码子以及衍生自病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点或ires,也称为cite序列)。表达盒还可以包括诸如复制起点的其它特征,和/或诸如逆转录病毒长末端重复序列(ltr)或腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)的染色体整合元件。本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与另外的编码分泌肽或信号肽的编码区相关联,所述分泌肽或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如,如果希望分泌双特异性抗原结合分子或其多肽片段,则编码信号序列的dna可以位于编码本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的核酸的上游。根据信号假说,由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列,所述信号肽或分泌前导序列在起始生长蛋白质链输出穿过粗面内质网后被从成熟蛋白质切割下来。本领域普通技术人员知道,脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与多肽的n末端融合的信号肽,其被从翻译的多肽切割下来以产生多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施方案中,使用了天然信号肽例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽,或该序列的功能衍生物,所述衍生物保留了指导与其可操作地相关联的多肽分泌的能力。或者,可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如,野生型前导序列可以替代为人组织纤溶酶原激活物(tpa)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列。编码可用于促进后续纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记融合蛋白的短蛋白质序列的dna可以包括在编码本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的内部或末端。在本发明的一个另外的方面,提供了包含一个或多个本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些方面,提供了包含一个或多个本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可分别掺入关于多核苷酸和载体的单一或组合地在本文中描述的任何特征。在一个方面,宿主细胞包含(例如已经转化或转染)包含编码本发明的双特异性抗原结合分子的(一部分)的多核苷酸的载体。如本文中使用的,术语“宿主细胞”是指可以被工程化以产生本发明的融合蛋白或其片段的任何种类的细胞系统。适合于复制和支持抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域熟知的。可以使用特定的表达载体适当地转染或转导这样的细胞,并且可以培养大量含有载体的细胞用于接种大规模发酵罐以获得足够量的用于临床应用的抗原结合分子。适合的宿主细胞包括原核微生物,如大肠杆菌,或各种真核细胞,如中国仓鼠卵巢细胞(cho),昆虫细胞等。例如,尤其是在不需要糖基化时,可以在细菌中产生多肽。表达后,可以从菌体糊分离出作为可溶性级分的多肽,并可将其进一步纯化。除了原核生物之外,诸如丝状真菌或酵母的真核微生物是编码多肽的载体的适合克隆或表达宿主,包括其糖基化途径已被“人源化”的导致产生具有部分或完全人糖基化样式的多肽的真菌和酵母菌株。参见gerngross,natbiotech22,1409-1414(2004),和li等人,natbiotech24,210-215(2006)。用于表达(糖基化)多肽的适合宿主细胞也源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞结合使用尤其是用于转染草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)细胞的许多杆状病毒株。植物细胞培养物也可以用作宿主。参见例如美国专利nos.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978,和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的plantibodiestm技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如,适于在悬液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是经sv40(cos-7)转化的猴肾cv1系；人胚胎肾细胞系(例如,在graham等人,jgenvirol36,59(1977)中描述的293或293t细胞)；仓鼠婴肾细胞(bhk)；小鼠sertoli细胞(如在mather,biolreprod23,243-251(1980)中所述的tm4细胞)；猴肾细胞(cv1)；非洲绿猴肾细胞(vero-76)；人宫颈癌细胞(hela)；犬肾细胞(mdck)；buffalo大鼠肝细胞(brl3a)；人肺细胞(w138)；人肝细胞(hepg2)；小鼠乳腺肿瘤细胞(mmt060562)；tri细胞(如在mather等人,annalsn.y.acadsci383,44-68(1982)中描述)；mrc5细胞和fs4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞,包括dhfr-cho细胞(urlaub等人,procnatlacadsciusa77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如yo,ns0,p3x63和sp2/0。对于适用于蛋白质产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述,参见例如yazaki和wu,methodsinmolecularbiology,vol.248(b.k.c.lo,ed.,humanapress,totowa,nj),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞,例如培养的哺乳动物细胞,酵母细胞,昆虫细胞,细菌细胞和植物细胞,在此仅列举少数,还有包括在转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织内的细胞。在一个实施方案中,宿主细胞是真核细胞,优选哺乳动物细胞,例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞,人胚胎肾(hek)细胞或淋巴样细胞(例如y0,ns0,sp20细胞)。在这些系统中表达外源基因的标准技术在本领域中是已知的。可以将表达包含免疫球蛋白重链或轻链的多肽的细胞工程化,以便也表达另一个免疫球蛋白链,使得所表达的产物是具有重链和轻链两者的免疫球蛋白。在一个方面,提供了产生本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的方法,其中所述方法包括在适于表达本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的条件下培养如本文中提供的包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的宿主细胞,并从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段。可以通过本领域已知的技术如高效液相色谱法,离子交换色谱法,凝胶电泳,亲和色谱法,尺寸排阻色谱法等来纯化如本文中描述制备的本发明的双特异性分子。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分地取决于诸如净电荷,疏水性,亲水性等因素,并且对于本领域技术人员将是显而易见的。对于亲和色谱法纯化,可以使用与双特异性抗原结合分子结合的抗体,配体,受体或抗原。例如,为了本发明的融合蛋白的亲和色谱法纯化,可以使用具有蛋白a或蛋白g的基质。可以基本上如实施例中描述依次使用蛋白a或g亲和色谱法和尺寸排阻色谱法分离抗原结合分子。双特异性抗原结合分子或其片段的纯度可以通过各种熟知的分析方法中的任何一种加以测定,包括凝胶电泳,高压液相色谱法等。例如,正如通过还原和非还原性sds-page证实,如实施例中描述表达的双特异性抗原结合分子显示是完整且正确组装的。测定法可以通过本领域已知的各种测定法来鉴定,筛选或通过其物理/化学性质和/或生物学活性来表征在本文中提供的抗原结合分子。1.亲和力测定根据实施例中提出的通过表面等离子体共振(spr)的方法,使用标准仪器如biacore仪器(gehealthcare),以及可以通过诸如重组表达获得的受体或靶蛋白,可以测定在本文中提供的双特异性抗原结合分子,抗体和抗体片段与4-1bb和靶细胞抗原的亲和力。通过表面等离子体共振(spr),使用标准仪器如biacore仪器(gehealthcare),以及可以通过诸如重组表达获得的受体或靶蛋白,也可以测定双特异性抗原结合分子与靶细胞抗原的亲和力。在实施例1.2中描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和示例性实施方案。根据一个方面,使用t100仪(gehealthcare)通过表面等离子体共振在25℃测量kd。2.结合测定和其它测定例如通过流式细胞术(facs),使用表达特定受体或靶抗原的细胞系,可以评价在本文中提供的双特异性抗原结合分子与相应的受体表达细胞的结合。在一个方面,在结合测定中使用表达4-1bb的外周血单核细胞(pbmc)。在分离后(幼稚pmbc)或刺激后(活化的pmbc)直接使用这些细胞。在另一个方面,使用活化的小鼠脾细胞(表达4-1bb)来证明本发明的双特异性抗原结合分子或抗体与4-1bb表达细胞的结合。在又一个方面,使用自健康食蟹猴(macacafascicularis)肝素化血液分离的pbmc来显示双特异性抗原结合分子或抗体与相应的食蟹猴4-1bb表达细胞的结合。在又一个方面,使用表达靶细胞抗原(例如fap或cea)的癌细胞系来证明抗原结合分子与靶细胞抗原的结合。在另一个方面,可以使用竞争测定来鉴定与特异性抗体或抗原结合分子分别竞争结合靶标或4-1bb的抗原结合分子。在某些实施方案中,这种竞争性抗原结合分子结合的表位(例如线性或构象表位)与特异性抗靶标抗体或特异性抗4-1bb抗体结合的相同。用于抗体所结合的表位的作图的详细示例性方法提供于morris(1996)“epitopemappingprotocols,”inmethodsinmolecularbiologyvol.66(humanapress,totowa,nj)中。3.活性测定在一个方面,提供了用于鉴定具有生物学活性的与特定靶细胞抗原和4-1bb结合的双特异性抗原结合分子的测定法。生物学活性可以包括例如通过表达靶细胞抗原的细胞上的4-1bb的激动性信号传导。还提供了通过测定法鉴定为具有这样的体外生物学活性的双特异性抗原结合分子。在某些方面,测试了本发明的双特异性抗原结合分子的这种生物学活性。此外,用于检测细胞裂解的测定法(例如通过测量ldh释放),诱导的凋亡动力学(例如通过测量半胱天冬酶3/7活性)或凋亡(例如使用tunel测定)是本领域熟知的。另外,可以通过评估复合物对各种淋巴细胞亚群如nk细胞,nkt细胞或γδt细胞的存活,增殖和淋巴因子分泌的影响,或评估其调节抗原呈递细胞如树突细胞,单核细胞/巨噬细胞或b细胞的表型和功能的能力来评估此类复合物的生物学活性。药物组合物,配制剂和给药途径在又一个方面,本发明提供了包含本文中提供的任一种双特异性抗原结合分子的药物组合物,以供例如在任何下列治疗方法中使用。在一个实施方案中,药物组合物包含本文中提供的任一种双特异性抗原结合分子和至少一种药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中,药物组合物包含本文中提供的任一种双特异性抗原结合分子和至少一种另外的例如如下文所述的治疗剂。本发明的药物组合物包含治疗有效量的一种或多种溶解或分散在药学上可接受的赋形剂中的双特异性抗原结合分子。短语“药学的或药学上可接受的”是指在采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒的分子实体和组合物,即在适当施用于动物时例如人时不产生不利的,过敏的或其它不良的反应。根据本公开内容,包含至少一种依照本发明的双特异性抗原结合分子和任选地另外的活性成分的药物组合物的制备将是本领域技术人员已知的,如remington'spharmaceuticalsciences第18版,mackprintingcompany,1990所例示,通过提述将其并入本文。具体地说,组合物是冻干配制剂或水溶液。如本文中使用的,正如本领域普通技术人员已知,“药学上可接受的赋形剂”包括溶剂,缓冲剂,分散介质,包衣,表面活性剂,抗氧化剂,防腐剂(例如抗菌剂,抗真菌剂),等渗剂,盐,稳定剂中任一种和全部及其组合。肠胃外组合物包括为通过注射给药而设计的那些,例如皮下,皮内,病灶内,静脉内,动脉内,肌内,鞘内或腹膜内注射。为了注射,可以将本发明的双特异性抗原结合分子配制在水溶液中,优选在生理学相容的缓冲液如汉克斯溶液,林格氏溶液或生理盐水缓冲液中。溶液可以含有配制剂,例如悬浮剂,稳定剂和/或分散剂。或者,双特异性抗原结合分子在使用前可处于粉末形式以与适合的载体(例如无菌无热原水)组构。根据需要,通过将在适当溶剂中的本发明的抗原结合分子以所要求的量并入下文列举的多种其它成分中来制备无菌注射溶液。可以例如通过无菌过滤膜进行过滤而容易地实现无菌性。通常,通过将各种灭菌的活性成分并入无菌载体中来制备分散体,所述无菌载体含有基础分散介质和/或其它成分。在用于制备无菌注射溶液,悬浮液或乳状液的无菌粉末的情况下,优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术,从而产生来自其先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何其它期望的成分的粉末。必要时应该适当缓冲该液体介质并且在注射之前首先用足够盐水或葡萄糖使液体稀释剂变得等张。在制造和储存条件下该组合物必须是稳定的,并且保持对抗微生物诸如细菌和真菌的污染作用。应当理解,内毒素污染应该最低限度地保持在安全水平,例如低于0.5ng/mg蛋白质。适合的药学上可接受的赋形剂包括但不限于:诸如磷酸盐,柠檬酸盐,和其它有机酸的缓冲剂；包括抗坏血酸和甲硫氨酸在内的抗氧化剂；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵,苄索氯铵；苯酚,丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯,如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质,如血清白蛋白,明胶,或免疫球蛋白；亲水性聚合物,如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸,如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,组氨酸,精氨酸,或赖氨酸；单糖类,二糖类,和其它碳水化合物类,包括葡萄糖,甘露糖,或糊精；螯合剂,如edta；糖类,如蔗糖,甘露醇,海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子,如钠；金属复合物(例如,zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂,如聚乙二醇(peg)。水性注射悬液可含有增加该悬液粘度的化合物,例如羧甲基纤维素钠,山梨糖醇,或葡聚糖等。任选地,悬液还可以含有适合的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的药剂。另外,这些活性化合物的悬液可制备为适当的油性注射悬液。适合的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(如芝麻油),合成脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酯),或脂质体。可以例如通过凝聚技术或通过界面聚合将活性成分包埋在制备的微胶囊中,例如分别在胶体药物递送系统(例如,脂质体,白蛋白微球,微乳液,纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊。这样的技术公开于remington'spharmaceuticalsciences(18thed.mackprintingcompany,1990)中。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括含有该多肽的固体疏水聚合物的半透性基质,所述基质呈成形物品的形式,例如薄膜,或微胶囊。在特定实施方案中,通过在组合物中使用延迟吸收的药剂,例如单硬脂酸铝,明胶或其组合,可延长注射组合物的吸收。本文中的示例性药学上可接受的赋形剂还包括诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(shasegp)的间质药物分散剂,例如人可溶性ph-20透明质酸酶糖蛋白,例如rhuph20(baxterinternational,inc.)。在美国专利公开no.2005/0260186和2006/0104968中描述了包括rhuph20的某些示例性的shasegp和使用方法。在一个方面,将shasegp与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。示例性的冻干抗体配制剂描述于美国专利no.6,267,958中。水性抗体配制剂包括美国专利no.6,171,586和wo2006/044908中描述的那些,后一种配制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。除前述组合物之外,抗原结合分子还可配制为贮库制剂。此类长效配制剂可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射给予。因此,例如,融合蛋白可以用适合的聚合材料或疏水材料(例如作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制,或配制为微溶的衍生物,例如微溶盐。包含本发明的双特异性抗原结合分子的药物组合物可以通过常规的混合,溶解,乳化,包封,包埋或冻干过程进行制造。可以使用有利于将蛋白质加工成药学上可使用的制剂的一种或多种生理学上可接受的载体,稀释剂,赋形剂或助剂以常规方式配制药物组合物。适当的配制剂取决于所选择的给药途径。可以将双特异性抗原结合分子配制成游离酸或碱,中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐是基本保留游离酸或碱的生物学活性的盐。这些盐包括酸加成盐,例如由蛋白质组合物的游离氨基形成的或与无机酸例如盐酸或磷酸形成的那些,或与诸如乙酸,草酸,酒石酸或扁桃酸的有机酸形成的那些。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱,例如氢氧化钠,氢氧化钾,氢氧化铵,氢氧化钙或氢氧化铁；或诸如异丙胺,三甲胺,组氨酸或普鲁卡因的有机碱。与相应的游离碱形式相比,药物盐在水性溶剂和其它质子溶剂中的溶解度更高。在被治疗的特殊适应症需要时,本文中的组合物还可含有一种以上的活性成分,优选地,所述活性成分具有彼此无不良影响的互补活性。这样的活性成分以对预期目的有效的量适当地组合存在。用于体内给药的制剂通常是无菌的。可以例如通过无菌过滤膜进行过滤而容易地实现无菌性。治疗方法和组合物本文中提供的任何双特异性抗原结合分子均可在治疗方法中使用。为了在治疗方法中使用,本发明的双特异性抗原结合分子可以以符合良好医学实践的方式配制,给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体紊乱,被治疗的具体哺乳动物,个体患者的临床状况,紊乱的原因,药剂的递送部位,给药方法,给药方案,以及执业医师已知的其它因素。在一个方面,提供了用作药剂的本发明的双特异性抗原结合分子。在另外的方面,提供了本发明的双特异性抗原结合分子,其用于(i)刺激或增强t细胞应答,(ii)支持激活的t细胞的存活,(iii)治疗感染,(iv)治疗癌症,(v)延迟癌症进展,或(vi)延长罹患癌症的患者的存活。在一个特定的方面,提供了在治疗疾病中使用尤其是在癌症治疗中使用的本发明的双特异性抗原结合分子。在某些方面,提供了在治疗方法中使用的本发明的双特异性抗原结合分子。在一个方面,本发明提供了用于治疗有需要的个体中的疾病的如本文中描述的双特异性抗原结合分子。在某些方面,本发明提供了在治疗患有疾病的个体的方法中使用的双特异性抗原结合分子,所述方法包括向个体施用治疗有效量的双特异性抗原结合分子。在某些方面,待治疗的疾病是癌症。需要治疗的受试者,患者或“个体”通常是哺乳动物,更具体地说是人。在一个方面,提供的是一种用于(i)刺激或增强t细胞应答,(ii)支持激活的t细胞的存活,(iii)治疗感染,(iv)治疗癌症,(v)延迟癌症进展或(vi)延长罹患癌症的患者的存活的方法,其中该方法包括将治疗有效量的本发明的双特异性抗原结合分子施用有所需要的个体。在又一个方面,本发明提供本发明的双特异性抗原结合分子在制造或制备用于治疗有需要的个体中的疾病的药剂中的用途。在一个方面,所述药剂用于在治疗疾病的方法中使用,所述方法包括向患有疾病的个体施用治疗有效量的药剂。在某些方面,待治疗的疾病是增殖性紊乱,具体地是癌症。癌症的实例包括但不限于膀胱癌,脑癌,头颈癌,胰腺癌,肺癌,乳腺癌,卵巢癌,子宫癌,子宫颈癌,子宫内膜癌,食道癌,结肠癌,结肠直肠癌,直肠癌,胃癌,前列腺癌,血癌,皮肤癌,鳞状细胞癌,骨癌,和肾癌。癌症的其它实例包括癌瘤,淋巴瘤(例如霍奇金氏和非霍奇金氏淋巴瘤),母细胞瘤,肉瘤和白血病。可以使用本发明的双特异性抗原结合分子或抗体进行治疗的其它细胞增殖紊乱包括但不限于位于腹部,骨骼,乳腺,消化系统,肝脏,胰腺,腹膜,内分泌腺(肾上腺,甲状旁腺,垂体,睾丸,卵巢,胸腺,甲状腺),眼,头颈部,神经系统(中枢和外周),淋巴系统,盆腔,皮肤,软组织,脾脏,胸部,和泌尿生殖系统的肿瘤。还包括癌前状态或病变和癌症转移。在某些实施方案中,癌症选自由肾细胞癌,皮肤癌,肺癌,结肠直肠癌,乳腺癌,脑癌,头颈癌组成的组。技术人员容易认识到,在许多情况下,本发明的双特异性抗原结合分子或抗体可能不能提供治愈,而可能提供益处。在一些方面,具有一些益处的生理变化也被认为是治疗有益的。因此,在一些方面,提供生理变化的本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的量被认为是“有效量”或“治疗有效量”。为了预防或治疗疾病,本发明的双特异性抗原结合分子的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型,给药途径,患者的体重,具体的分子,疾病的严重程度和病程,给予本发明的双特异性抗原结合分子或抗体是用于预防还是治疗目的,先前或同时的治疗干预,患者的临床病史,和对融合蛋白的反应,和主治医师的决定。在任何情况下,负责给药的医师将决定组合物中活性成分的浓度和个体受试者的适当剂量。本文中考虑到各种给药方案,包括但不限于在各个时间点上的单次或多次给药,推注给药和脉冲输注。一次性地或以一系列治疗的方式适当地向患者施用本发明的双特异性抗原结合分子。根据疾病的类型和严重程度,约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的双特异性抗原结合分子可以是向患者施用的初始候选剂量,例如无论是通过一次或多次分开给药,还是通过连续输注。取决于上面提到的因素,一个典型的日剂量可能在约1μg/kg至100mg/kg或更高的范围内。对于数天或更长时间的反复给药,根据病情,治疗通常将持续到出现期望的疾病症状的抑制时为止。本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的一个示例性剂量将在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其它实例中,剂量还可以包含每次给药从约1μg/kg体重,约5μg/kg体重,约10μg/kg体重,约50μg/kg体重,约100μg/kg体重,约200μg/kg体重,约350μg/kg体重,约500μg/kg体重,约1mg/kg体重,约5mg/kg体重,约10mg/kg体重,约50mg/kg体重,约100mg/kg体重,约200mg/kg体重,约350mg/kg体重,约500mg/kg体重,至约1000mg/kg体重或更多,以及其中可推导的任何范围。在本文中所列数字的可推导范围的实例中,可以基于上述数字以约0.1mg/kg体重至约20mg/kg体重,约5μg/kg体重至约1mg/kg体重等范围进行施用。因此,可向患者施用约0.5mg/kg,2.0mg/kg,5.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一个或多个剂量。这样的剂量可以间歇施用,例如,每周或每三周一次(例如使得患者接受约2个至约20个,或例如约6个剂量的融合蛋白)。在一个特定方面,会每三周施用双特异性抗原结合分子。可以施用初始较高的加载剂量,然后施用一个或多个较低的剂量。然而,其它剂量方案可能是有用的。通过常规技术和测定法易于监测这种疗法的进展。通常以有效实现预期目的的量使用本发明的双特异性抗原结合分子。为了用于治疗或预防疾病状况,以治疗有效量施用或应用本发明的双特异性抗原结合分子或抗体或其药物组合物。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内,尤其是在根据本文中提供的详细公开内容的情况下。对于全身给药,可以根据体外测定法(例如细胞培养物测定法)初步估计治疗有效剂量。然后可以在动物模型中配制剂量以达到包括在细胞培养中确定的ic50在内的循环浓度范围。这类信息可以用来更精确地确定用于人的剂量。也可以使用本领域熟知的技术根据体内数据(例如,动物模型)估计初始剂量。根据动物数据,本领域普通技术人员可以容易地优化对人的给药。可以单独调整剂量和间隔以提供足以维持治疗效果的本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的血浆水平。通常注射给药的患者剂量为约0.1至50mg/kg/天,一般为约0.1至1mg/kg/天。可以通过每天施用多个剂量来实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过hplc测量血浆中的水平。在局部给药或选择性吸收的情况下,本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够优化治疗有效的局部剂量而无需过度实验。本文中描述的发明的双特异性抗原结合分子的治疗有效剂量通常将提供治疗益处而不引起实质性毒性。可以通过细胞培养或实验动物中的标准药物程序来确定融合蛋白的毒性和治疗效果。可使用细胞培养物测定法和动物研究来确定ld50(对群体的50％致死的剂量)和ed50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性与疗效之间的剂量比为治疗指数,它可以被表示为比率ld50/ed50。表现出较大治疗指数的双特异性抗原结合分子是优选的。在一个方面,本发明的双特异性抗原结合分子或抗体表现出高治疗指数。从细胞培养物测定法和动物研究中获得的数据可以在配制适合于在人类中使用的剂量范围中加以使用。剂量优选地处在循环浓度范围内,其包括具有很小或没有毒性的ed50。取决于多种因素,例如采用的剂型,所用给药途径,受试者的状况等,剂量可以在这个范围内变化。考虑到患者的状况,个体医师可以选择确切的配方,给药途径和剂量(参见,例如fingl等人,1975,in:thepharmacologicalbasisoftherapeutics,ch.1,p.1,通过提述将其完整并入本文)。用本发明的双特异性抗体治疗患者的主治医师知道如何并且何时由于毒性,器官功能障碍等而终止,中断或调整给药。相反,如果临床反应不足(排除毒性),主治医师也会知道将治疗调整到更高水平。在感兴趣紊乱的管理中,施用剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度,给药途径等而变化。可以例如部分地通过标准预后评价方法来评价病症的严重程度。此外,剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄,体重和反应而变化。其它药剂和治疗本发明的双特异性抗原结合分子可以在治疗中单独或与一种或多种其它药剂联合给药。例如,本发明的双特异性抗原结合分子或抗体可以与至少一种另外的治疗剂共同给药。术语“治疗剂”涵盖可用于治疗需要这种治疗的个体中的症状或疾病的任何药剂。这种另外的治疗剂可包含任何适合于被治疗的特定适应症的任何活性成分,优选地,所述活性成分具有彼此无不良影响的互补活性。在某些实施方案中,另外的治疗剂是另一种抗癌剂或化疗剂,例如微管破坏物,抗代谢物,拓扑异构酶抑制剂,dna嵌入剂,烷化剂,蒽环类抗生素,激素疗法,激酶抑制剂,受体拮抗剂,肿瘤细胞凋亡的激活剂,或抗血管发生剂。在某些方面,另外的治疗剂是免疫调控剂,细胞抑制剂,细胞粘附抑制剂,细胞毒剂或细胞抑制剂,细胞凋亡的激活剂,或提高细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂。在一个方面,本发明的双特异性抗原结合分子与化疗剂,放射疗法和/或其它用于癌症免疫疗法的药剂组合施用。化疗剂是如上文定义的抗癌剂。或者,化疗剂选自由核苷酸类似物(例如阿扎胞苷,卡培他滨,去氧氟尿苷,氟尿嘧啶,吉西他滨,羟基脲或甲氨蝶呤),基于铂的药剂(例如卡铂,顺铂或奥沙利铂),紫杉烷(例如帕利他赛,多西他赛,abraxane或taxotere),烷化剂(例如环磷酰胺,苯丁酸氮芥,达卡巴嗪或替莫唑胺),蒽环类抗生素(例如多柔比星或伊达比星),拓扑异构酶i抑制剂(例如伊立替康或托泊替康),拓扑异构酶ii抑制剂(例如依托泊苷或替尼泊苷),激酶抑制剂(例如厄洛替尼,伊马替尼,维罗非尼或维莫德吉),类视黄醇,组蛋白脱乙酰基酶抑制剂和长春花生物碱组成的组。其它用于癌症免疫疗法的药剂包括例如阻断pd-l1/pd-1相互作用的药剂,诸如pd1抗体(例如派姆单抗或纳武单抗)或pd-l1抗体(例如阿特珠单抗)。本发明的双特异性抗原结合分子还可以与放射疗法组合使用。此类其它药剂以对预期目的有效的量适当地组合存在。此类其它药剂的有效量取决于所使用的融合蛋白的量,紊乱或治疗的类型,以及以上讨论的其它因素。通常以与本文中所述相同的剂量和给药途径,或本文中所述剂量的约1％至99％,或以在经验/临床上确定为适当的任何剂量和任何途径使用本发明的双特异性抗原结合分子或抗体。上述此类联合疗法涵盖联合给药(其中两种或更多种治疗剂包括在同一个或分开的组合物中)和分开给药,在分开给药的情况下,本发明的双特异性抗原结合分子或抗体的给药可以发生在给予另外的治疗剂和/或佐剂之前,同时和/或之后。在一个方面,双特异性抗原结合分子的施用和另外的治疗剂的施用彼此在约1个月内,或在约1,2或3周内,或在约1,2,3,4,5,或6天内发生。制品在本发明的另一个方面,提供了含有用于治疗,预防和/或诊断上述紊乱的物质的制品。制品包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装说明书。适合的容器包括例如瓶,小瓶,注射器,iv溶液袋等。可以由各种材料如玻璃或塑料形成容器。容器容纳组合物本身或连同另一种有效治疗,预防和/或诊断病症的组合物,并且可以具有无菌进入口(例如,该容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶或静脉内溶液袋)。组合物中至少一种活性剂是本发明的双特异性抗原结合分子。标签或包装说明书指示该组合物用于治疗选择的病症。而且,制品可以包括(a)其中含有组合物的第一容器,其中该组合物包含本发明的双特异性抗原结合分子；和(b)其中含有组合物的第二容器,其中该组合物包含另外的细胞毒性治疗剂或其它治疗剂。在本发明的这个实施方案中的制品可以进一步包括指示组合物可用于治疗特定病症的包装说明书。替代地或另外,制品可以进一步包括第二(或第三)容器,其包含药学上可接受的缓冲剂,例如抑菌性注射用水(bwfi),磷酸盐缓冲盐水,林格氏溶液和右旋糖溶液。它还可以包括立足于商业和用户立场所需的其它物品,包括其它缓冲剂,稀释剂,过滤器,针头和注射器。表c(序列):所有核苷酸序列在没有相应终止密码子序列的情况下呈现。本发明的方面下面的编号的段落(段)描述本发明的各方面:1.一种双特异性抗原结合分子,其包含至少一个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域和由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域,其中该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含重链可变区(vh4-1bb),该重链可变区(vh4-1bb)包含(i)包含seqidno:1的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:2的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:3的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vl4-1bb),该轻链可变区(vl4-1bb)包含(iv)包含seqidno:4的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:5的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:6的氨基酸序列的cdr-l3。2.段1的双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含重链可变区(vh4-1bb),该重链可变区(vh4-1bb)包含与seqidno:7的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vl4-1bb),该轻链可变区(vl4-1bb)包含与seqidno:8的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。3.段1或2的双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区(vh4-1bb)和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区(vl4-1bb)。4.段1至3任一项的双特异性抗原结合分子,其中能够特异性结合4-1bb的抗原结合域是fab片段。5.段1至4任一项的双特异性抗原结合分子,其中该靶细胞抗原选自由成纤维细胞激活蛋白(fap),黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(mcsp),表皮生长因子受体(egfr),癌胚抗原(cea),cd19,cd20和cd33组成的组。6.段1至5任一项的双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域是能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(fap)的抗原结合域。7.段1至6任一项的双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(fap)的抗原结合域包含(a)重链可变区(vhfap),该重链可变区(vhfap)包含(i)包含seqidno:9的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:10的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:11的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlfap),该轻链可变区(vlfap)包含(iv)包含seqidno:12的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:13的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:14的氨基酸序列的cdr-l3,或(b)重链可变区(vhfap),该重链可变区(vhfap)包含(i)包含seqidno:15的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:16的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:17的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlfap),该轻链可变区(vlfap)包含(iv)包含seqidno:18的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:19的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:20的氨基酸序列的cdr-l3。8.段1至7任一项的双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(fap)的抗原结合域包含(a)重链可变区(vhfap),该重链可变区(vhfap)包含与seqidno:21的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlfap),该轻链可变区(vlfap)包含与seqidno:22的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,或(b)重链可变区(vhfap),该重链可变区(vhfap)包含与seqidno:23的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlfap),该轻链可变区(vlfap)包含与seqidno:24的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。9.段1至8任一项的双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合fap的抗原结合域包含包含seqidno:23的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:24的氨基酸序列的轻链可变区。10.段1至8任一项的双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合fap的抗原结合域包含包含seqidno:21的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:22的氨基酸序列的轻链可变区。11.段1至5任一项的双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域是能够特异性结合癌胚抗原(cea)的抗原结合域。12.段1至5或11任一项的双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合癌胚抗原(cea)的抗原结合域包含(a)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含(i)包含seqidno:25的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:26的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:27的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含(iv)包含seqidno:28的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:29的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:30的氨基酸序列的cdr-l3,或(b)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含(i)包含seqidno:33的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:34的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:35的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含(iv)包含seqidno:36的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:37的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:38的氨基酸序列的cdr-l3,或(c)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含(i)包含seqidno:179的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:180的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:181的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含(iv)包含seqidno:182的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:183的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:184的氨基酸序列的cdr-l3,或(d)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含(i)包含seqidno:187的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:188的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:189的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含(iv)包含seqidno:190的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:191的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:192的氨基酸序列的cdr-l3。13.段1至5或11或12任一项的双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合癌胚抗原(cea)的抗原结合域包含(a)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含与seqidno:31的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含与seqidno:32的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,或(b)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含与seqidno:39的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含与seqidno:40的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,或(c)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含与seqidno:185的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含与seqidno:186的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,或(d)重链可变区(vhcea),该重链可变区(vhcea)包含与seqidno:193的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlcea),该轻链可变区(vlcea)包含与seqidno:194的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。14.段1至5或11至13任一项的双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合cea的抗原结合域包含包含seqidno:31的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:32的氨基酸序列的轻链可变区。15.段1至5或11至13任一项的双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合cea的抗原结合域包含包含seqidno:39的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:40的氨基酸序列的轻链可变区。16.段1至5任一项的双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域是能够特异性结合cd19的抗原结合域。17.段1至5或16任一项的双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合cd19的抗原结合域包含(a)重链可变区(vhcd19),该重链可变区(vhcd19)包含(i)包含seqidno:155的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:156的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:157的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcd19),该轻链可变区(vlcd19)包含(iv)包含seqidno:158的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:159的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:160的氨基酸序列的cdr-l3,或(b)重链可变区(vhcd19),该重链可变区(vhcd19)包含(i)包含seqidno:163的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:164的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:165的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vlcd19),该轻链可变区(vlcd19)包含(iv)包含seqidno:166的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:167的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:168的氨基酸序列的cdr-l3。18.段1至5或16或17任一项的双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合cd19的抗原结合域包含(a)重链可变区(vhcd19),该重链可变区(vhcd19)包含与seqidno:161的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlcd19),该轻链可变区(vlcd19)包含与seqidno:162的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,或(b)重链可变区(vhcd19),该重链可变区(vhcd19)包含与seqidno:169的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和轻链可变区(vlcd19),该轻链可变区(vlcd19)包含与seqidno:170的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。19.段1至5或16至18任一项的双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合cea的抗原结合域包含包含seqidno:161的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:162的氨基酸序列的轻链可变区。20.段1至5或16至18任一项的双特异性抗原结合分子,其中(i)该能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含包含seqidno:7的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:8的氨基酸序列的轻链可变区,且(ii)该能够特异性结合cea的抗原结合域包含包含seqidno:169的氨基酸序列的重链可变区vh和包含seqidno:170的氨基酸序列的轻链可变区。21.段1至20任一项的双特异性抗原结合分子,其中该双特异性抗原结合分子包含iggfc域,特别是igg1fc域或igg4fc域。22.段1至21任一项的双特异性抗原结合分子,其中该fc域包含一处或多处降低抗原结合分子对fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸替代。23.段1至22任一项的双特异性抗原结合分子,其中该fc域是人igg1亚类的,具有氨基酸突变l234a,l235a和p329g(编号方式依照kabateu索引)。24.段1至23任一项的双特异性抗原结合分子,其中该fc域包含促进fc域的第一和第二亚基联合的修饰。25.段1至24任一项的双特异性抗原结合分子,其中该fc域的第一亚基包含氨基酸替代s354c和t366w(编号方式依照kabateu索引)且该fc域的第二亚基包含氨基酸替代y349c,t366s,l368a和y407v(编号方式依照kabateu索引)。26.段1至25任一项的双特异性抗原结合分子,其包含超过一个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,其中每个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域包含重链可变区(vh4-1bb),该重链可变区(vh4-1bb)包含(i)包含seqidno:1的氨基酸序列的cdr-h1,(ii)包含seqidno:2的氨基酸序列的cdr-h2,和(iii)包含seqidno:3的氨基酸序列的cdr-h3,和轻链可变区(vl4-1bb),该轻链可变区(vl4-1bb)包含(iv)包含seqidno:4的氨基酸序列的cdr-l1,(v)包含seqidno:5的氨基酸序列的cdr-l2,和(vi)包含seqidno:6的氨基酸序列的cdr-l3。27.段1至26任一项的双特异性抗原结合分子,其包含(a)两个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,(b)一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。28.段1至26任一项的双特异性抗原结合分子,其中该双特异性抗原结合分子对于4-1bb是二价的且对于靶细胞抗原是单价的。29.段1至26的双特异性抗原结合分子,其包含(a)包含两个能够特异性结合4-1bb的fab片段和fc域的抗体的两条轻链和两条重链,和(b)能够特异性结合靶细胞抗原的vh和vl域,其中该vh域经由肽接头连接至该重链之一的c端且其中该vl域经由肽接头连接至第二重链的c端。30.段27至29的双特异性抗原结合分子,其包含(a)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:44的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:45的氨基酸序列的第二重链,或(b)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:49的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:50的氨基酸序列的第二重链。31.段27至29的双特异性抗原结合分子,其包含(a)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:65的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:66的氨基酸序列的第二重链,或(b)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:69的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:70的氨基酸序列的第二重链,或(c)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:73的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:74的氨基酸序列的第二重链,或(d)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的两条轻链,包含seqidno:77的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:78的氨基酸序列的第二重链。32.段1至26任一项的双特异性抗原结合分子,其包含(a)四个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域,(b)一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的fc域。33.段1至26或32任一项的双特异性抗原结合分子,其中该双特异性抗原结合分子对于4-1bb是四价的且对于靶细胞抗原是单价的。34.段1至26或32或33任一项的双特异性抗原结合分子,其中该四个能够特异性结合4-1bb的抗原结合域是fab片段且其每两个彼此融合,任选经由肽接头。35.段1至26或32至34任一项的双特异性抗原结合分子,其中该能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合域包含vh和vl域且其中该vh域经由肽接头连接至该fc域的第一亚基的c端且该vl域经由肽接头连接至该fc域的第二亚基的c端。36.段32至35的双特异性抗原结合分子,其包含(a)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四条轻链,包含seqidno:57的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:58的氨基酸序列的第二重链,或(b)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四条轻链,包含seqidno:61的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:62的氨基酸序列的第二重链。37.段27至30的双特异性抗原结合分子,其包含(a)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四条轻链,包含seqidno:81的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:82的氨基酸序列的第二重链,或(b)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四条轻链,包含seqidno:85的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:86的氨基酸序列的第二重链,或(c)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四条轻链,包含seqidno:89的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:90的氨基酸序列的第二重链,或(d)每条包含seqidno:46的氨基酸序列的四条轻链,包含seqidno:93的氨基酸序列的第一重链,和包含seqidno:94的氨基酸序列的第二重链。38.一种多核苷酸,其编码段1至37任一项的双特异性抗原结合分子。39.一种药物组合物,其包含段1至37任一项的双特异性抗原结合分子和至少一种药学可接受赋形剂。40.段1至37任一项的双特异性抗原结合分子或段39的药物组合物,其用作药物。41.段1至37任一项的双特异性抗原结合分子或段39的药物组合物,其用于(i)刺激t细胞应答,(ii)支持激活的t细胞的存活,(iii)治疗感染,(iv)治疗癌症,(v)延迟癌症进展,或(vi)延长罹患癌症的患者的存活。42.段1至37任一项的双特异性抗原结合分子或段39的药物组合物,其用于治疗癌症。43.段1至37任一项的双特异性抗原结合分子或段39的药物组合物,其用于治疗癌症,其中该双特异性抗原结合分子与化疗剂,放射和/或其它用于癌症免疫疗法的药剂组合施用。44.一种在个体中抑制肿瘤细胞生长的方法,其包含对该个体施用有效量的段1至37任一项的双特异性抗原结合分子或段39的药物组合物以抑制肿瘤细胞生长。实施例以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解,根据上面提供的一般描述,可以实践各种其它实施方案。重组dna技术使用标准方法操作dna,如sambrook等人在molecularcloning:alaboratorymanual；coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989中所述。按照制造商的说明使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息见:kabat,e.a.等人,(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthed.,nih公开号91-3242。dna测序通过双链测序确定dna序列。基因合成使用适当的模板通过pcr生成或由geneartag(regensburg,germany)从合成的寡核苷酸和pcr产物通过自动化基因合成来生成期望的基因区段。在没有可用的确切基因序列的情况下,基于来自最近同源物的序列设计寡核苷酸引物,并且通过rt-pcr从源自适当组织的rna分离基因。将侧翼为单个限制性核酸内切酶切割位点的基因区段克隆到标准克隆/测序载体中。从转化的细菌中纯化质粒dna,并通过紫外光谱法测定浓度。通过dna测序证实亚克隆基因片段的dna序列。设计具有适合的限制性位点的基因区段,以允许亚克隆到对应的表达载体中。所有构建体均被设计为具有编码前导肽的5'端dna序列,所述前导肽将蛋白质靶向真核细胞中的分泌。蛋白质纯化参考标准方案,从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之,将抗体施加到蛋白asepharose柱(gehealthcare)上并用pbs洗涤。在ph2.8实现抗体的洗脱,然后立即中和样品。通过尺寸排阻色谱法(superdex200,gehealthcare)在pbs中或在20mm组氨酸,150mm氯化钠(ph6.0)中将单体抗体与聚集的蛋白质分开。合并单体抗体级分,使用例如milliporeamiconultra(30mwco)离心浓缩机进行浓缩(如果需要的话),在-20℃或-80℃冷冻并储存。提供部分样品用于随后例如通过sds-page,尺寸排阻色谱法(sec)或质谱法进行蛋白质分析和分析表征。sds-page根据制造商的说明使用预制凝胶系统(invitrogen)。具体地说,使用10％或4-12％的bis-tris预制凝胶(ph6.4)和mes(还原凝胶,具有抗氧化剂运行缓冲液添加剂)或mops(非还原凝胶)运行缓冲液。分析尺寸排阻色谱法通过hplc色谱法进行尺寸排阻色谱法(sec),用于测定抗体的聚集和寡聚状态。简言之,将蛋白a纯化的抗体施加到在agilenthplc1100系统上的300mmnacl,50mmkh2po4/k2hpo4(ph7.5)中的tosohtskgelg3000sw柱上,或者在dionexhplc系统上的2xpbs中的superdex200柱(gehealthcare)上。通过uv吸光度和峰面积的积分将洗脱的蛋白质定量。以biorad凝胶过滤标准151-1901作为标准。质谱法本节描述了具有vh/vl或ch/cl交换(crossmab)的多特异性抗体的表征,重点在于它们的正确装配。通过去糖基化的完整crossmab和去糖基化的/纤溶酶消化的或替代地去糖基化的/限制性lysc消化的crossmab的电喷雾电离质谱法(esi-ms)分析预期的一级结构。在37℃以1mg/ml的蛋白质浓度将crossmab用磷酸盐或tris缓冲液中的n-糖苷酶f进行去糖基化达17个小时。用tris缓冲液(ph8)中的100μg去糖基化的vh/vlcrossmab,分别在室温进行120小时和在37℃进行40分钟的纤溶酶或限制性lysc(roche)消化。在进行质谱分析之前,将样品通过hplc在sephadexg25柱(gehealthcare)上脱盐。在装备有triversananomate源(advion)的maxis4guhr-qtofms系统(brukerdaltonik)上,通过esi-ms测定总质量。实施例1：具有对4-1bb的二价结合和对fap的单价结合的双特异性抗体的制备，纯化和表征1.1具有对4-1bb的二价结合和对fap的单价结合的双特异性抗体的生成制备具有对4-1bb的二价结合和对fap的单价结合的双特异性激动性4-1bb抗体，也称作2+1，如图1a和1b中描绘的。通过在第一重链hc1(fc节重链)中引入s354c/t366w突变和在第二重链hc2(fc穴重链)中引入y349c/t366s/l368a/y407v突变来应用节入穴技术以容许生成异二聚体。在这个实施例中，构建物的第一重链hc1由下述构件构成：抗4-1bb结合物(克隆20h4.9)的vhch1，继以fc节，在其c端融合抗fap结合物的vl或vh。第二重链hc2构成如下：抗4-1bb的vhch1，继以fc穴，在其c端分别融合抗fap结合物(克隆4b9)的vh或vl。fap结合物4b9的生成和制备记载于wo2012/020006a2，通过援引将其收入本文。对于4-1bb结合物，依照us7,288,638b2或us7,659,384b2获得克隆20h4.9的vh和vl序列。两条重链的组合容许生成包括一个fap结合模块和两个4-1bb结合fab的异二聚体(图1a和1b)。依照国际专利申请公开文本no.wo2012/130831a1中描述的方法，已经在节和穴重链的恒定区中引入pro329gly，leu234ala和leu235ala突变以消除对fcγ受体的结合。通过使用聚乙烯亚胺用哺乳动物表达载体共转染hek293-ebna细胞来生成双特异性2+1抗4-1bb抗faphuigg1p329glala抗体。以1:1:1比(“载体节重链”:“载体轻链”:“载体穴重链”)用相应的表达载体转染细胞。a-fapvh与fc节重链融合且vl与fc穴重链融合的2+1抗4-1bb，抗fap构建物的碱基对和氨基酸序列可分别见表1。表1：双特异性，二价抗4-1bb/单价抗fap人igg1p329glala抗原结合分子(a-fapvl与fc穴链融合且vh与fc节链融合的构建物，在下文表3中称作穴-vl)的序列a-fapvl与fc节重链融合且vh与fc穴重链融合的2+1抗4-1bb，抗fap构建物的碱基对和氨基酸序列可分别见表2。表2：双特异性，二价抗4-1bb/单价抗fap人igg1p329glala抗原结合分子(a-fapvh与fc穴链融合且vl与fc节链融合的构建物，在下文表3中称作穴-vh)的序列为了500ml摇瓶中的生成，在转染前24小时接种400x106个hek293ebna细胞。为了转染，将细胞以210g离心5分钟，并用预温热的cdcho培养基替换上清液。在20mlcdcho培养基中混合表达载体至200μgdna的最终量。添加540μlpei后，将溶液漩涡震荡15秒并于室温温育10分钟。之后，将细胞与dna/pei溶液混合，转移至500ml摇瓶并在具有5％co2气氛的温箱中于37℃温育3小时。温育后，添加160mlf17培养基并将细胞培养24小时。转染后1天，添加1mm丙戊酸和7％补料。培养7天后，通过以210xg离心15分钟来收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，补充叠氮化钠至0.01％(w/v)的终浓度，并于4℃保持。通过使用蛋白a的亲和层析，继以大小排阻层析自细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质。为了亲和层析，在用40ml20mm磷酸钠，20mm柠檬酸钠ph7.5平衡的hitrap蛋白ahp柱(cv＝5ml，gehealthcare)上加载上清液。通过用至少10个柱体积的含有20mm磷酸钠，20mm柠檬酸钠，0.5m氯化钠的缓冲液(ph7.5)清洗来去除未结合的蛋白质。使用在20个柱体积的20mm柠檬酸钠，0.01％(v/v)tween-20，ph3.0上创建的氯化钠的线性ph梯度(0至500mm)洗脱结合的蛋白质。然后用10个柱体积的含有20mm柠檬酸钠，500mm氯化钠，0.01％(v/v)tween-20，ph3.0的溶液清洗柱。通过添加1/40(v/v)2mtris，ph8.0来调节收集的级分的ph。浓缩并过滤蛋白质，之后在用ph7.4的2mmmops，150mm氯化钠，0.02％(w/v)叠氮化钠溶液平衡的hiloadsuperdex200柱(gehealthcare)上加载。浓缩并过滤蛋白质，之后在用ph6.0的20mm组氨酸，140mm氯化钠溶液平衡的hiloadsuperdex200柱(gehealthcare)上加载。使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过以280nm测量od来测定经过纯化的双特异性构建物的蛋白质浓度。使用labchipgxii(caliper)通过还原剂(invitrogen，usa)存在和缺失下的ce-sds来分析双特异性构建物的纯度和分子量。于25℃使用在25mmk2hpo4，125mmnacl，200mm单盐酸l-精氨酸，0.02％(w/v)nan3，ph6.7运行缓冲液中平衡的tskgelg3000swxl分析性大小排阻柱(tosoh)分析双特异性构建物的聚集体含量(表3)。表3：具有对4-1bb的二价结合和对fap的单价结合的双特异性抗原结合分子(2+14-1bb/fap人igg1p329glala)的生化分析抗原和筛选工具人4-1bbfc(kih)的制备：在节上与人igg1重链ch2和ch3域同框亚克隆编码人4-1bb的外域的dna序列(依照q07011合成)。抗原外域和人igg1的fc之间引入actev蛋白酶切割位点。在抗原-fc节的c端处引入用于定向生物素化的avi标签。含有s354c/t366w突变的抗原-fc节链与含有y349c/t366s/l368a/y407v突变的fc穴链的组合容许生成包括一个拷贝的含有4-1bb外域的链的异二聚体，从而创建单体形式的连接有fc的抗原。表4显示抗原fc融合构建物的cdna和氨基酸序列。表4：单体抗原fc(kih)融合分子(通过组合一条fc穴链与一条抗原fc节链而生成的)的cdna和氨基酸的序列1.2靶向4-1bb二价和fap单价的双特异性抗体(2+1抗原结合分子)的结合1.2.1表面等离振子共振(同时结合)通过表面等离振子共振(spr)评估同时结合人4-1bbfc(kih)和人fap的能力。所有spr实验是用hbs-ep作为运行缓冲液(0.01mhepesph7.4，0.15mnacl，3mmedta，0.005％表面活性剂p20，biacore，freiburg/germany)于25℃在biacoret200上实施的。将生物素化人4-1bbfc(kih)直接偶联至链霉亲合素(sa)传感器芯片的流动室。使用高至400个共振单位(ru)的固定化水平。在90秒里以30μl/min的流以200nm的浓度范围使靶向4-1bb和fap的双特异性抗体流经流动室并将解离设为零秒。以500nm的浓度在90秒里以30μl/min的流注射作为第二分析物的人fap经过流动室。对解离监测120秒。通过减去在没有固定化蛋白质的参照流动室中获得的响应来修正本体折射率差异。测定法的设置在图2a中显示。所有双特异性构建物均能同时结合人4-1bb和人fap(图2b)。1.2.2对人4-1bb的结合–二价抗4-1bb抗原结合分子的竞争测定法为了确认我们的2+1抗4-1bb抗原结合分子结合人4-1bb的能力，应用一种基于细胞的fret测定法(taglite)。因此，将2500个用hu4-1bb-snap融合物转染并用fret供体铽(cisbio)标记的hek293ebna细胞/孔与0.6nm用fret受体d2(cisbio)标记的抗4-1bb20h4.9混合。另外，添加范围为0.006-1000nm的浓度稀释度的未标记的igg(20h4.9)或二价(20h4.9/4b92+1)双特异性抗体并于室温温育2-4小时。于用于荧光供体(铽)的620nm和用于荧光受体染料(m100pro，tecan)的665nm测量荧光信号。计算665/620*1000的比，并减去参照(仅细胞)。为了确定ec50值，在graphpadprism6中分析结果。温育4小时后的观察ec50值在表5中显示。双特异性2+1抗4-1bb和抗fap抗原结合分子(20h4.9/4b92+1)的竞争是如对亲本igg观察的(图3)。表5：二价4-1bb抗原结合分子的竞争性结合的ec50值构建物ec50(nm)20h4.9igg1.5(0.9-2.5)4-1bb(20h4.9)/fap(4b9)2+11.6(1.2-2.3)实施例2：具有对4-1bb的四价结合和对fap的单价结合的双特异性抗体的制备，纯化和表征2.1具有对4-1bb的四价结合和对fap的单价结合的双特异性抗体的生成制备具有对4-1bb的四价结合和对fap的单价结合的双特异性激动性4-1bb抗体，也称作4+1，如图4a和4b中描绘的。通过在第一重链hc1(fc节重链)中引入s354c/t366w突变和在第二重链hc2(fc穴重链)中引入y349c/t366s/l368a/y407v突变来应用节入穴技术以容许生成异二聚体。在这个实施例中，构建物的第一重链hc1由下述构件构成：抗4-1bb结合物(克隆20h4.9)的vhch1_vhch1，继以fc穴，在其c端融合抗fap结合物(克隆4b9)的vl或vh。第二重链hc2构成如下：抗4-1bb结合物(克隆20h4.9)的vhch1_vhch1，继以fc节，在其c端相应融合抗fap结合物(克隆4b9)的vh或vl。fap结合物4b9的生成和制备记载于wo2012/020006a2，通过援引将其收入本文。对于4-1bb结合物，依照us7,288,638b2或us7,659,384b2获得克隆20h4.9的vh和vl序列。两条重链的组合容许生成包括一个fap结合模块和四个4-1bb结合fab的异二聚体。依照国际专利申请公开文本no.wo2012/130831a1中描述的方法，已经在节和穴重链的恒定区中引入pro329gly，leu234ala和leu235ala突变以消除对fcγ受体的结合。通过使用聚乙烯亚胺用哺乳动物表达载体共转染hek293-ebna细胞来生成双特异性4+1抗4-1bb抗faphuigg1p329glala抗原结合分子。以1:1:1比(“载体节重链”:“载体轻链”:“载体穴重链”)用相应的表达载体转染细胞。如关于双特异性二价抗4-1bb和抗faphuigg1p329glala所述(见实施例1.1)生成和纯化抗原结合分子。a-fapvh与fc节重链融合且vl与fc穴重链融合的4+1抗4-1bb，抗fap构建物的碱基对和氨基酸序列可分别见表6。a-fapvl与fc节重链融合且vh与fc穴重链融合的4+1抗4-1bb，抗fap构建物的碱基对和氨基酸序列可分别见表7。表6：双特异性，四价抗4-1bb/单价抗fap人igg1p329glala抗原结合分子(a-fapvl与fc穴链融合且vh与fc节链融合的构建物，称作穴-vl)的序列表7：双特异性，四价抗4-1bb/单价抗fap人igg1p329glala抗原结合分子(a-fapvh与fc穴链融合且vl与fc节链融合的构建物，称作穴-vh)的序列表8：具有对4-1bb的四价结合和对fap的单价结合的双特异性抗原结合分子(4+14-1bb/fap人igg1p329glala)的生化分析2.2靶向4-1bb四价和fap单价的双特异性抗体(4+1抗原结合分子)的结合2.2.1表面等离振子共振(同时结合)通过表面等离振子共振(spr)评估同时结合人4-1bbfc(kih)和人fap的能力。所有spr实验是用hbs-ep作为运行缓冲液(0.01mhepesph7.4，0.15mnacl，3mmedta，0.005％表面活性剂p20，biacore，freiburg/germany)于25℃在biacoret200上实施的。将生物素化人4-1bbfc(kih)直接偶联至链霉亲合素(sa)传感器芯片的流动室。使用高至400个共振单位(ru)的固定化水平。在90秒里以30μl/min的流以200nm的浓度范围使靶向4-1bb和fap的双特异性抗体流经流动室并将解离设为零秒。以500nm的浓度在90秒里以30μl/min的流注射作为第二分析物的人fap经过流动室。对解离监测120秒。通过减去在没有固定化蛋白质的参照流动室中获得的响应来修正本体折射率差异。所有双特异性构建物均能同时结合人4-1bb和人fap(图5b)。2.3对人4-1bb的结合–二价对四价抗4-1bb构建物的竞争测定法为了确认所有四种抗4-1bbfab域结合人4-1bb的能力，应用一种基于细胞的fret测定法(taglite)。因此，将2500个用hu4-1bb-snap融合物转染并用fret供体铽(cisbio)标记的hek293ebna细胞/孔与0.6nm用fret受体d2(cisbio)标记的抗4-1bb克隆20h4.9igg混合。另外，添加范围为0.006-1000nm的浓度稀释度的未标记的抗4-1-bbigg(20h4.9)，二价(20h4.9/4b92+1)或四价(20h4.9/4b94+1)双特异性构建物并于室温温育2-4小时。于用于荧光供体(铽)的620nm和用于荧光受体染料(m100pro，tecan)的665nm测量荧光信号。计算665/620*1000的比，并减去参照(仅细胞)。为了确定ec50值，在graphpadprism6中分析结果。温育4小时后的观察ec50值在表9中显示。四价4+120h4.9抗原结合分子比igg对应物更好地竞争(图6)。表9：二价对四价4-1bb结合分子的竞争性结合的ec50值分子ec50[nm]20h4.9igg1.5(0.9-2.4)4-1bb(20h4.9)/fap(4b9)4+10.5(0.3-0.7)2.4细胞上的结合2.4.1人4-1bb表达性细胞：静息的和激活的人外周血单个核白细胞(pbmc)上的结合静息的(幼稚的)人t细胞上缺失人4-1bb的表达(kienzleg.andvonkempisj(2000)，int.immunol.12(1)，73-82；went.etal.(2002)，j.immunol.168，4897-4906)。以固定化的抗人cd3激动性抗体激活后，4-1bb在cd4+和cd8+t细胞上上调。还报告了激活的人nk细胞(baesslert.et.al.(2010)blood115(15)，3058-3069)，激活的人nkt细胞(coles.l.etal.(2014)j.immunol.192(8)，3898-3907)，激活的人b细胞(zhangetal.(2010)j.immunol.184(2)，787-795)，激活的人嗜曙红细胞(heinischetal.2001)上的4-1bb表达，组成性地人嗜中性细胞(heinischi.v.(2000)jallergyclinimmunol.108(1)，21-28)，激活的人单核细胞(langsteinj.etal.(1998)jimmunol.160(5)，2488-2494；kwajahm.andschwarzh.(2010)eurjimmunol.40(7)，1938-1949)，组成性地人调节t细胞(bacherp.etal.(2014)mucosalimmunol.7(4)，916-928)，人滤泡树状细胞(paulys.etal.(2002)jleukocbiol.72(1)，35-42)，激活的人树状细胞(zhangl.etal.(2004)cellmolimmunol.1(1)，71-76)和恶性人肿瘤的血管(brollk.etal.(2001)amjclinpathol.115(4)，543-549)上的4-1bb表达。为了测试我们的抗4-1bb抗原结合分子对天然细胞表达的人4-1bb的结合，使用静息的外周血单个核细胞(pbmc)或pha-l/proleukin预激活的和cd3/cd28再激活的pbmc。使用histopaque1077(sigmalifescience，目录号10771，聚蔗糖和泛影酸钠，调节至1.077g/ml的密度)，通过ficoll密度离心自从苏黎世献血中心获得的血沉棕黄层分离pbmc并在由供应有10％胎牛血清(fbs，gibcobylifetechnology，目录号16000-044，批次941273，经伽马照射，无支原体且于56℃热灭活35分钟的)，1％(v/v)glutamax-i(gibcobylifetechnologies，目录号35050038)，1mm丙酮酸钠(sigma，目录号s8636)，1％(v/v)mem非必需氨基酸(sigma，目录号m7145)和50μmβ-巯基乙醇(sigma，m3148)的rpmi1640培养基(gibcobylifetechnology，目录号42401-042)组成的t细胞培养基中重悬浮。在分离后直接使用pbmc(静息的细胞)或通过在6孔组织培养板中在补充有200u/mlproleukin(novartispharmaschweizag，chclb-p-476-700-10340)和2μg/mlpha-l(sigma，目录号l2769)的t细胞培养基中培养3至5天，然后在用10μg/ml抗人cd3(克隆okt3，biolegend，目录号317315)和2μg/ml抗人cd28(克隆cd28.2，biolegend，目录号302928)包被的6孔组织培养板中在t细胞培养基中于37℃和5％co2培养2天来进行刺激以诱导t细胞的细胞表面处的4-1bb表达。为了测定对由人pbmc表达的人4-1bb的结合，将0.1-0.2x106个新鲜分离的例如静息的或激活的pbmc添加至圆底悬浮细胞96孔板(greinerbio-one，cellstar，目录号650185)的每个孔。于4℃将板以400xg离心4分钟并丢弃上清液。用200μl/孔dpbs清洗细胞，然后与100μl/ml含有1:5000稀释的可固定存活力染料efluor660(ebioscience，目录号65-0864-18)的dpbs一起于4℃温育30分钟。之后，将细胞用200μl/孔冷的facs缓冲液(供应有2％(v/v)fbs，5mmedtaph8(amresco，目录号e177)和7.5mm叠氮化钠(sigma-aldrich，s2002)的dpbs)清洗一次。接着，添加50μl/孔4℃冷的含有所滴定的双特异性fap靶向性抗人4-1bb抗体的facs缓冲液并将细胞于4℃温育120分钟。将细胞用200μl/孔4℃facs缓冲液清洗四次以去除未结合的分子。之后，将细胞与50μl/孔4℃冷的含有2.5μg/mlpe缀合的affinipure抗人iggfcγ片段特异性山羊f(ab’)2片段(jacksonimmunoresearch，目录号109-116-098)，抗人cd45af488(克隆hi30，biolegend，目录号304019)，0.67μg/mlpercp/cy5.5缀合的抗人cd3小鼠igg1κ(克隆ucht1，biolegend，目录号300430)，0.125μg/mlbv421缀合的抗人cd4moigg1κ(克隆rpa-t4，biolegend，目录号300532)或0.23μg/mlbv421缀合的抗人cd4小鼠igg2bκ(克隆okt4，biolegend，目录号317434)，0.33μg/ml抗人cd8-bv510(moigg1κ，克隆sk1，biolegend，目录号344732)和0.67μg/ml抗人cd19-pe/cy7(moigg1κ，克隆hib19，biolegend，目录号302216)的facs缓冲液一起进一步温育并于4℃温育30分钟。将细胞用200μlfacs缓冲液/孔清洗两次并通过在50μl/孔含有1％甲醛(sigma，ht501320-9.5l)的dpbs中重悬浮来固定。同日或次日，使用3激光macsquant分析仪10(miltenyibiotech)对细胞获取。在cd8+和cd4+t细胞上设置门并使用检测二抗的荧光强度的几何均值(mfi)来分析一抗的结合。使用graphpadprism(graphpadsoftwareinc.)，通过减去空白值(不添加一抗)对数据进行基线校准并使用非线性回归曲线拟合(稳健拟合)计算ec50值。人cd4和cd8t细胞在静息状态时缺乏4-1bb表达但在激活后上调4-1bb。在所描述的激活条件下，人cd8+t细胞显示比cd4+t要强的上调。所生成的抗人4-1bb特异性抗体能结合由激活的人t细胞表达的人4-1bb(图7c和d)，而在静息的cd4和cd8t细胞中检测不到显著的结合(图7a和b)。结合受到细胞的4-1bb表达水平影响，例如，4-1bb特异性分子比激活的cd4t细胞(图7c)更强地结合激活的cd8t细胞(图7d)，而且受到格式影响，例如，二价4-1bb结合物(huiggp329glala和2+1格式)与四价4-1bb结合物(4+1格式)结合不同。由于对4-1bb特异性表位的内部竞争，四价4-1bb结合导致降低的mfi。没有看到ec50的变化(在表10中列出)，想必是由于方法相关有限灵敏度。taglite测定法(图6)更加灵敏(无清洗步骤)且明显显示二价和四价4-1bb结之间ec50的差异。在图8a和8b中，显示了结合曲线下面积(auc)。能看到如下次序的对激活的cd8t细胞的4-1bb结合的明显下降：4-1bb(20h4.9)huigg1p329glala>4-1bb(20h4.9)xfap(4b9)2+1>4-1bb(20h4.9)xfap(4b9)4+1。fap结合域与fc域的融合可能通过掩蔽表位而阻碍多克隆pe缀合的affinipure抗人iggfcγ片段特异性山羊f(ab`)2片段的结合并导致更弱的检测。这可能解释4-1bb(20h4.9)huigg1p329glala和4-1bb(20h4.9)xfap(4b9)2+1之间结合特性的下降，尽管事实上这两种分子均展示二价4-1bb结合位点。如上文解释的对4-1bb特异性表位的内部竞争可能解释4-1bb(20h4.9)xfap(4b9)2+1>4-1bb(20h4.9)xfap(4b9)4+1之间auc的差异。表10：经由流式细胞术测定的对激活的4-1bb表达性人cd4+t细胞和cd8+t细胞的结合曲线的ec50值2.4.2对人fap表达性细胞的结合对于对细胞表面表达的人成纤维细胞激活蛋白(fap)的结合，使用nih/3t3-hufap克隆19细胞或人黑素瘤细胞系wm-266-4(atcccrl-1676)。通过用在cmv启动子下编码人fap的petr4921表达质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞nih/3t3细胞(atcccrl-1658)来生成nih/3t3-hufap克隆19。在1.5μg/ml嘌呤霉素(invivogen，目录号ant-pr-5)存在下维持细胞。将2x105个fap表达性肿瘤细胞添加至圆底悬浮细胞96孔板(greinerbio-one，cellstar，目录号650185)的每个孔。将细胞用200μldpbs清洗一次并在100μl/孔4℃冷的含有1:5000稀释的可固定存活力染料efluor450(ebioscience，目录号65-0863-18)或可固定存活力染料efluor660(ebioscience，目录号65-0864-18)的dpbs缓冲液中重悬浮团粒。将板于4℃温育30分钟并用200μl4℃冷的dpbs缓冲液清洗一次。之后，在50μl/孔4℃冷的含有不同滴定浓度的4-1bb特异性fap靶向性和非靶向性抗体的facs缓冲液中重悬浮细胞，继以于4℃温育1小时。用200μl/孔清洗四次后，将细胞用50μl/孔4℃冷的含有2.5μg/mlpe缀合的affinipure抗人iggfcγ片段特异性山羊f(ab`)2片段(jacksonimmunoresearch，目录号109-116-098)的facs缓冲液于4℃染色30分钟。将细胞用200μl4℃facs缓冲液清洗两次，然后在50μl/孔含有1％甲醛的dpbs中重悬浮用于固定。同日或次日，在100μlfacs缓冲液中重悬浮细胞并使用macsquant分析仪10(miltenyibiotec)获取。如图9中显示的，fap靶向性分子，而非非fap靶向性huigg1p293glala分子有效结合人fap表达性wm-266-4(图9a)和nih/3t3-hufap克隆19细胞(图9b)。因此，包括fap结合侧诱导对人fap表达性细胞的有效靶向效果。结合曲线的ec50值以及曲线下面积的值在表11中列出。表11：对fap表达性细胞系nih/3t3-hufap克隆19和wm-266-4的结合的ec50值和曲线下面积(auc)的值。2.5nfκb激活2.5.1表达人4-1bb和nfκb-萤光素酶的hela细胞的生成用含有在cmv启动子控制下的人4-1bb的序列(uniprot登录号q07011)和嘌呤霉素抗性基因的基于表达载体petr10829的质粒转导宫颈癌细胞系hela(atccccl-2)。在补充有10％(v/v)fbs，1％(v/v)glutamax-i和3μg/ml嘌呤霉素的dmem培养基中培养细胞。通过流式细胞术对4-1bb转导的hela细胞测试4-1bb表达：在100μl含有0.1μgpercp/cy5.5缀合的抗人4-1bb小鼠igg1κ克隆4b4-1(biolegend，目录号309814)或其同种型对照(percp/cy5.5缀合的小鼠igg1κ同种型对照抗体克隆mopc21，biolegend，目录号400150)的facs缓冲液中重悬浮0.2x106个活细胞并于4℃温育30分钟。将细胞用facs缓冲液清洗两次，在含有0.06μgdapi(santacruzbiotec，目录号sc-3598)的300μlfacs缓冲液中重悬浮并使用5激光lsr-fortessa(bdbioscience，diva软件)获取。如描述的实施有限稀释以生成单克隆：将人4-1bb转导的hela细胞在培养基中重悬浮至10，5和2.5个细胞/ml的密度并将200μl细胞悬浮液转移至圆底组织培养物处理的96孔板(6块板/细胞浓度，tpp目录号92697)。收获单克隆，扩充并如上文描述的测试4-1bb表达。选择具有最高4-1bb表达的克隆(克隆5)，用于后续用nfκb-萤光素酶表达载体5495ptranlucenthygb转染。载体赋予转染细胞以对潮霉素b的抗性和在nfκb响应元件(panomics，目录号lr0051)控制下表达萤光素酶的能力二者。为了转染人4-1bb，将hela克隆5细胞培养至70％汇合。将50μg(40μl)线性化的(限制酶asei和sali)5495ptranlucenthygb表达载体添加至无菌0.4cmgenepulser/micropulser杯(biorad，目录号165-2081)。添加400μl无补充物的dmem培养基中的2.5x106个人4-1bbhela克隆5细胞并与质粒溶液小心混合。以如下设置使用genepulserxcell总系统(biorad，目录号1652660)实施细胞转染：指数式脉冲，电容500μf，电压160v，电阻∞。脉冲后立即将转染细胞转移至装有15ml37℃温的供应有10％(v/v)fbs和1％(v/v)glutamaxi的dmem培养基的75cm2组织培养瓶(tpp，目录号90075)。次日，添加含有3μg/ml嘌呤霉素和200μg/ml潮霉素b(roche，目录号10843555001)的培养基。扩充存活细胞并如上文描述的实施有限稀释以生成单克隆。如上文描述的对克隆测试4-1bb表达并如下测试nfκb-萤光素酶活性：在选择培养基中收获克隆并使用细胞计数器vi-cellxr2.03(beckmancoulter，目录号731050)计数。以0.33x106个细胞/ml的细胞密度设置细胞并将150μl此细胞悬浮液转移至带盖的无菌白色96孔平底组织培养板(greinerbioone，目录号655083)的每个孔。将细胞在细胞温箱(heracell)中于37℃和5％co2温育过夜。次日，将50μl含有不同浓度的重组人肿瘤坏死因子α(rhtnfα，peprotech，目录号30001a)的培养基添加至96孔板的每个孔，产生100，50，25，12.5，6.25和0ng/孔的rhtnfα终浓度。将细胞于37℃和5％co2温育6小时，然后用200μl/孔dpbs清洗三次。将报告物裂解缓冲液(promega，目录号e3971)添加至每个孔(40μl)并将板于-20℃保存过夜。次日，将冷冻的细胞和检测缓冲液(萤光素酶1000测定系统，promega，目录号e4550)融化至室温。将100μl检测缓冲液添加至每个孔并尽可能快地使用spectramaxm5/m5e微量板读数仪和softmaxpro软件(moleculardevices)测量板。以对照(不添加rhtnfα)以上对500ms/孔测得的所释放的光的单位(url)作为萤光素酶活性。hela-hu4-1bb-nfκb-luc克隆26展现最高的萤光素酶活性和可观水平的4-1bb表达，选择用于进一步使用。2.5.2与fap表达性肿瘤细胞共培养的表达人4-1bb和萤光素酶的hela报告细胞系中的nfκb激活收获hela-hu4-1bb-nfκb-luc克隆26细胞并在供应有10％(v/v)fbs和1％(v/v)glutamax-i的dmem培养基中重悬浮至0.2x106个细胞/ml的浓度。将100μl(2x104个细胞)此细胞悬浮液转移至带盖的无菌白色96孔平底组织培养板(greinerbioone，目录号655083)的每个孔并将板于37℃和5％co2温育过夜。次日，添加50μl含有所滴定的fap靶向性抗人4-1bb构建物或它们的亲本huigg1p329glala抗体的培养基。将fap表达性nih/3t3-hufap克隆19或wm-266-4在供应有10％(v/v)fbs和1％(v/v)glutamax-i的dmem培养基中重悬浮至2x106个细胞/ml的浓度。将fap表达性肿瘤细胞的悬浮液(50μl)或作为阴性对照的培养基添加至每个孔并将板在细胞温箱中于37℃和5％co2温育6小时。将细胞用200μl/孔dpbs清洗两次。将40μl新鲜制备的报告物裂解缓冲液(promega，目录号e3971)添加至每个孔并将板于-20℃保存过夜。次日，于室温融化冷冻的细胞板和检测缓冲液(萤光素酶1000测定系统，promega，目录号e4550)。将100μl检测缓冲液添加至每个孔并尽可能快地使用spectramaxm5/m5e微量板读数仪和softmaxpro软件(moleculardevices)测量萤光素酶活性。在图10中显示不同fap靶向性4-1bb特异性构建物的激活特性，其中使用4-1bb表达性报告细胞系。在图10a中显示在fap表达性细胞缺失下的激活特性。只有含有四价4-1bb结合侧的分子4-1bb(20h4.9)xfap(4b9)4+1(灰色实心方形)能诱导强激活。仅仅含有二价4-1bb结合侧的分子未能诱导这种强激活，显示4-1bb激活依赖于效应细胞的表面上4-1bb分子的强交联。在接下来的印迹中，以表达中等水平的fap的人黑素瘤细胞系wm-266-4(图10b)或经转染而表达高水平的人fap的小鼠纤维瘤(fibrosoma)细胞系nih/3t3(图10c)的形式添加fap表达性肿瘤细胞。一旦fap靶向性分子经由这种fap表达性肿瘤细胞交联，4-1bb结合侧导致报告细胞系表面上4-1bb的强交联且诱导nfκb介导的萤光素酶表达的强激活。不依赖于4-1bb结合侧的模块，4-1bb(20h4.9)xfap(4b9)2+1和4-1bb(20h4.9)xfap(4b9)4+1的激活相当相似。在fap表达性肿瘤细胞缺失下看到2+1和4+1格式之间唯一明显的差异。拟合曲线下面积(auc)在图11中显示且ec50值在表12中列出。表12：在fap表达性细胞存在下nfκb信号传导途径的激活的ec50值2.6在fap表达性细胞存在下人pbmc的激活测定法对于激动性4-1bb结合物20h4.9的fap结合介导的交联，使用fap表达性贴壁细胞系nih/3t3-hufap克隆19。用dpbs(gibcobylifetechnologies，目录号14190326)清洗nih/3t3-hufap克隆19细胞并用无酶的，基于pbs的细胞解离缓冲液(gibcobylifetechnologies，目录号13151-014)于37℃处理10分钟。收获细胞并在由供应有10％胎牛血清(fbs，us起源，panbiotech，p30-2009，批次p150307gi，经伽马照射，无支原体，于56℃热灭活35分钟的)，1％l-glutamax-i(gibcobylifetechnologies，目录号35050-038)，1mm丙酮酸钠(sigma-aldrich，目录号s8636)，1％mem非必需氨基酸溶液(sigma-aldrich，目录号m7145)，50μmβ-巯基乙醇(sigma-aldrich，目录号m3148)的rpmi1640(gibcobylifetechnologies，目录号42401-042)组成的t细胞培养基中重悬浮并照射50戈瑞(x射线辐照仪rs2000，radsource)。将50μlt细胞培养基中的2x104个nih/3t3-hufap克隆19细胞接种至圆底组织培养96孔板(ttp，目录号92697)的每个孔。分别添加50μl含有不同滴定浓度的4-1bb(20h4.9)huigg1p329glala，4-1bb(20h4.9)xfap(4b9)2+1，4-1bb(20h4.9)xfap(4b9)2+1或对照分子4-1bb(12b3)xfap(4b9)4+1(如pct专利申请no.pct/ep2016/073198中描述的)和dp47huigg1p329glala的t细胞培养基。将人pbmc在37℃温热的含有40nmcfda-se(sigma-aldrich，目录号21888-25mg-f)的dpbs中于37℃标记15分钟。通过添加fbs来停止cfse标记，将pbmc清洗两次并在t细胞培养基中重悬浮至1.5x106个细胞/ml的终浓度。将50μl这种pbmc细胞溶液接种至每个孔以添加7.5x104个cfse标记的pbmc每孔。最后，制备含有2mm激动性抗人cd3人igg1克隆v9的t细胞培养基的储备溶液并将50μl/孔添加至每个孔，给出0.5mm抗人cd3人igg1克隆v9的终浓度。将板于37℃温育4天。用dpbs清洗细胞并用100μl/孔含有1:1000稀释的活的/死的可固定aqua死细胞染色试剂盒(molecularprobesbylifetechnology，目录号l34957)的dpbs于4℃染色30分钟。将细胞用200μl/孔dpbs清洗一次并用50μl含有0.1μg/mlpercp-cy5.5缀合的抗人cd137小鼠igg1κ(克隆4b4-1，biolegend，目录号309814)，0.1μg/mlpe/cy7缀合的抗人pd-1小鼠igg1κ(克隆eh12.2h7，biolegend，目录号329918)，0.03μg/mlapc缀合的抗人cd25小鼠igg1κ(克隆bc96，biolegend，目录号302610)，0.06μg/mlapc/cy7缀合的抗人cd8小鼠igg1κ(克隆rpa-t8，biolegend，目录号3301016)，bv421缀合的抗人cd4小鼠igg1κ(克隆rpa-t4，biolegend，目录号300532)的facs缓冲液(供应有2％fbs，5mmedtaph8(amresco，目录号e177)和7.5mm叠氮化钠(sigma-aldrichs2002)的dpbs)于4℃染色30分钟。将细胞用200μl/孔dpbs清洗两次并与50μl/孔新鲜制备的foxp3透化/固定缓冲液(ebioscience目录号00-5123)一起于4℃温育30分钟。将细胞用200μl/孔dpbs清洗两次，在50μl/孔新鲜制备的供应有pe缀合的1:250稀释的抗人粒酶b小鼠igg1κ(克隆gb11，批号4269803，bdpharmingen，目录号561142)的透化缓冲液(ebioscience，目录号00-8333)中重悬浮并于4℃温育1小时。将板用200μl/孔dpbs清洗两次并将细胞用含有1％甲醛(sigma，ht501320-9.5l)的dpbs固定15分钟。在100μl/孔facs缓冲液中重悬浮细胞并使用macsquant分析仪10(miltenyibiotech)获取。使用flowjov10(flowjo，llc)和graphpadprism6.04(graphpadsoftware，inc)分析数据。如图12中显示的，fap靶向性激动性4-1bb(20h4.9)2+1和4+1抗原结合分子能够在亚最佳的cd3刺激存在下诱导cd25的上调以及改善的cd4和cd8t细胞的增殖。这两种分子均显示比分子4-1bb(12b3)xfap(4b9)4+1要好的效果，后者作为阳性对照添加且之前记载于pct专利申请no.pct/ep2016/073198。因此，在fap表达性细胞和亚最佳的tcr刺激存在下fap靶向性4-1bb(20h4.9)激动剂能诱导t细胞激活和增殖，这不依赖于它的格式，例如，4+1双特异性抗原结合分子并不比2+1双特异性抗原结合分子更加有效。在图13中显示图12中的曲线的曲线下面积(auc)值。作为基线激活，显示对照分子(非靶向性dp47huigg1p329glala)的auc。拟合ec50值在表13中列出。表13：人pbmc激活曲线的ec50值实施例3：具有对4-1bb的单价结合和对fap的单价结合的双特异性抗体的制备，纯化和表征3.1具有对4-1bb的单价结合和对fap的单价结合的双特异性抗体的生成制备具有对4-1bb的单价结合和对fap的单价结合的双特异性激动性4-1bb抗体，也称作1+1，如图1c中描绘的。通过在第一重链hc1(fc节重链)中引入s354c/t366w突变和在第二重链hc2(fc穴重链)中引入y349c/t366s/l368a/y407v突变来应用节入穴技术以容许生成异二聚体。在这个实施例中，构建物的第一重链hc1由下述构件构成：抗4-1bb(克隆20h4.9)的vhch1，继以fc节。第二重链hc2构成如下：抗fap(克隆4b9)的vlch1，继以fc穴。为了改善正确配对，已经在抗4-1bb的ch-cl(fc节链)中引入下述突变(带电荷变体)：cl中的e123r和q124k和ch1中的k147e和k213e。对于4-1bb结合物，自us7659384(b2)获得克隆20h4.9的vh和vl序列。fc节与fc穴链的组合容许生成包括一个fap结合fab和一个4-1bb结合fab的异二聚体。依照国际专利申请公开文本no.wo2012/130831a1中描述的方法，在节和穴重链的恒定区中引入pro329gly，leu234ala和leu235ala突变以消除对fcγ受体的结合。1+1抗4-1bb，抗faphuigg1pglala的氨基酸序列可见表14。表14：双特异性，单价抗4-1bb/单价抗fap人igg1p329glala抗原结合分子的序列通过使用evifect(evitriaag)用哺乳动物表达载体共转染悬浮生长的cho-k1细胞来生成双特异性1+1抗4-1bb，抗faphuigg1pglala。以1:1:1:1比(“载体节重链”:“载体穴重链”:“载体轻链1”:“载体轻链2”)用相应的表达载体转染细胞。为了转染，在evimake(evitriaag)培养基中无血清悬浮培养cho-k1细胞。在具有5％co2气氛的温箱中于37℃7天后，收集培养上清液用于通过离心来纯化并将溶液无菌过滤(0.22mm滤器)并于4℃保存。通过使用蛋白a的亲和层析，继以大小排阻层析自细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质。为了亲和层析，在用40ml20mm磷酸钠，20mm柠檬酸钠ph7.5平衡的蛋白amabselectsure柱(cv＝5ml，gehealthcare)上加载上清液。通过用至少10个柱体积的含有20mm磷酸钠，20mm柠檬酸钠的缓冲液(ph7.5)清洗来去除未结合的蛋白质。使用在15个柱体积的20mm柠檬酸钠，100mm氯化钠，100mm甘氨酸，ph3.0上创建的氯化钠的线性ph梯度(20至100mm)洗脱结合的蛋白质。然后用10个柱体积的20mm柠檬酸钠，100mm氯化钠，100mm甘氨酸，ph3.0清洗柱。通过添加1/40(v/v)2mtris，ph8.0来调节收集的级分的ph。浓缩并过滤蛋白质，之后在用20mm组氨酸，140mm氯化钠，ph6.0平衡的hiloadsuperdex16/600s200柱(gehealthcare)上加载。浓缩并过滤蛋白质，之后在用ph6.0的20mm组氨酸，140mm氯化钠溶液平衡的hiloadsuperdex200柱(gehealthcare)上加载。使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过以280nm测量od来测定经过纯化的双特异性构建物的蛋白质浓度。使用labchipgxii(caliper)通过还原剂(invitrogen，usa)存在和缺失下的ce-sds来分析双特异性构建物的纯度和分子量。于25℃使用在25mmk2hpo4，125mmnacl，200mm单盐酸l-精氨酸，0.02％(w/v)nan3，ph6.7运行缓冲液中平衡的tskgelg3000swxl分析性大小排阻柱(tosoh)分析双特异性构建物的聚集体含量。表15：具有对4-1bb的单价结合和对fap的单价结合的双特异性抗原结合分子(1+14-1bb/fap人igg1p329glala)的生化分析3.2功能性体外表征：经由同时结合4-1bb和fap诱导nfκb激活的能力3.2.1表达人4-1bb和nfκb-萤光素酶的hela细胞的生成用含有在cmv启动子控制下的人4-1bb的序列(uniprot登录号q07011)和嘌呤霉素抗性基因的基于表达载体petr10829的质粒转导宫颈癌细胞系hela(atccccl-2)。在补充有10％(v/v)fbs，1％(v/v)glutamax-i和3μg/ml嘌呤霉素的dmem培养基中培养细胞。通过流式细胞术对4-1bb转导的hela细胞测试4-1bb表达：在100μl含有0.1μgpercp/cy5.5缀合的抗人4-1bb小鼠igg1κ克隆4b4-1(biolegend，目录号309814)或其同种型对照(percp/cy5.5缀合的小鼠igg1κ同种型对照抗体克隆mopc21，biolegend，目录号400150)的facs缓冲液中重悬浮0.2x106个活细胞并于4℃温育30分钟。将细胞用facs缓冲液清洗两次，在含有0.06μgdapi(santacruzbiotec，目录号sc-3598)的300μlfacs缓冲液中重悬浮并使用5激光lsr-fortessa(bdbioscience，diva软件)获取。如描述的实施有限稀释以生成单克隆：将人4-1bb转导的hela细胞在培养基中重悬浮至10，5和2.5个细胞/ml的密度并将200μl细胞悬浮液转移至圆底组织培养物处理的96孔板(6块板/细胞浓度，tpp目录号92697)。收获单克隆，扩充并如上文描述的测试4-1bb表达。选择具有最高4-1bb表达的克隆(克隆5)，用于后续用nfκb-萤光素酶表达载体5495ptranlucenthygb转染。载体赋予转染细胞以对潮霉素b的抗性和在nfκb响应元件(panomics，目录号lr0051)控制下表达萤光素酶的能力二者。为了转染人4-1bb，将hela克隆5细胞培养至70％汇合。将50μg(40μl)线性化的(限制酶asei和sali)5495ptranlucenthygb表达载体添加至无菌0.4cmgenepulser/micropulser杯(biorad，目录号165-2081)。添加400μl无补充物的dmem培养基中的2.5x106个人4-1bbhela克隆5细胞并与质粒溶液小心混合。以如下设置使用genepulserxcell总系统(biorad，目录号1652660)实施细胞转染：指数式脉冲，电容500μf，电压160v，电阻无限。脉冲后立即将转染细胞转移至装有15ml37℃温的供应有10％(v/v)fbs和1％(v/v)glutamaxi的dmem培养基的75cm2组织培养瓶(tpp，目录号90075)。次日，添加含有3μg/ml嘌呤霉素和200μg/ml潮霉素b(roche，目录号10843555001)的培养基。扩充存活细胞并如上文描述的实施有限稀释以生成单克隆。如上文描述的对克隆测试4-1bb表达并如下测试nfκb-萤光素酶活性：在选择培养基中收获克隆并使用细胞计数器vi-cellxr2.03(beckmancoulter，目录号731050)计数。以0.33x106个细胞/ml的细胞密度设置细胞并将150μl此细胞悬浮液转移至带盖的无菌白色96孔平底组织培养板(greinerbioone，目录号655083)的每个孔。将细胞在细胞温箱(heracell)中于37℃和5％co2温育过夜。次日，将50μl含有不同浓度的重组人肿瘤坏死因子α(rhtnfα，peprotech，目录号30001a)的培养基添加至96孔板的每个孔，产生100，50，25，12.5，6.25和0ng/孔的rhtnfα终浓度。将细胞于37℃和5％co2温育6小时，然后用200μl/孔dpbs清洗三次。将报告物裂解缓冲液(promega，目录号e3971)添加至每个孔(40μl)并将板于-20℃保存过夜。次日，将冷冻的细胞板和检测缓冲液(萤光素酶1000测定系统，promega，目录号e4550)融化至室温。将100μl检测缓冲液添加至每个孔并尽可能快地使用spectramaxm5/m5e微量板读数仪和softmaxpro软件(moleculardevices)测量板。以对照(不添加rhtnfα)以上对500ms/孔测得的所释放的光的单位(url)作为萤光素酶活性。hela-hu4-1bb-nfκb-luc克隆26展现最高的萤光素酶活性和可观水平的4-1bb表达，选择用于进一步使用。3.2.2与fap表达性肿瘤细胞共培养的表达人4-1bb的hela细胞报告细胞系中的nfκb激活收获hela-hu4-1bb-nfκb-luc克隆26细胞并在供应有10％(v/v)fbs和1％(v/v)glutamax-i的dmem培养基中重悬浮至0.2x106个细胞/ml的浓度。将100μl(2x104个细胞)此细胞悬浮液转移至带盖的无菌白色96孔平底组织培养板(greinerbioone，目录号655083)的每个孔并将板于37℃和5％co2温育过夜。次日，添加50μl含有滴定浓度的4-1bb(20h4.9)xfap(4b9)1+1，4-1bb(20h4.9)huigg4，4-1bb(20h4.9)huigg1p329glala或非靶向性dp47huigg1p329glala的培养基。将fap表达性人黑素瘤细胞系wm-266-4(atcccrl-1676)在供应有10％(v/v)fbs和1％(v/v)glutamax-i的dmem培养基中重悬浮至2x106个细胞/ml的浓度。将fap表达性wm-266-4细胞的悬浮液(50μl)或作为阴性对照的培养基添加至每个孔并将板在细胞温箱中于37℃和5％co2温育6小时。用200μl/孔dpbs清洗细胞。将40μl新鲜制备的报告物裂解缓冲液(promega，目录号e3971)添加至每个孔并将板于-20℃保存过夜。次日，于室温融化冷冻的细胞板和检测缓冲液(萤光素酶1000测定系统，promega，目录号e4550)。将100μl检测缓冲液添加至每个孔并尽可能快地使用spectramaxm5/m5e微量板读数仪和softmaxpro软件(moleculardevices)测量萤光素酶活性。在图10d和10e中显示4-1bb(20h4.9)xfap(4b9)1+1(黑色实心菱形)，4-1bb(20h4.9)huigg4(空心黑色六边形，点线)，4-1bb(20h4.9)huigg1p329glala(实心灰色方形)或非靶向性dp47huigg1p329glala(空心灰色圆形，点线)的激活特性，使用4-1bb表达性报告细胞系。在图10d中测试在fap表达性wm-266-4缺失下的激活特性，而在图10e中测试在wm-266-4细胞存在下的激活特性。在任何交联缺失下，仅仅对4-1bb(20h4.9)huigg4(空心黑色六边形)看到激活且对含有惰性fcγr结合性fc部分的4-1bb(20h4.9)huigg1p329glala(实心灰色方形)看到较少程度的激活。在fap交联存在下，由于它同时结合和因此fap介导的报告细胞系hela-hu4-1bb-nfκb-luc克隆26细胞的表面上的4-1bb受体的交联的能力，4-1bb(20h4.9)xfap(4b9)1+1(黑色菱形)显示最强激活潜力。ec50值和曲线下面积(auc)在表16中列出且auc值还在图11a至11c中显示。表16：在fap表达性肿瘤细胞存在下nfκb信号传导途径的激活的ec50值和曲线下面积(auc)实施例4具有对4-1bb的二价结合和非靶向性vh和vl模块的双特异性抗原结合分子(对照分子)的制备，纯化和表征4.1具有对4-1bb的二价结合和非靶向性vh和vl模块的双特异性抗体(dp47种系对照)的生成制备具有对4-1bb的二价结合和含有非靶向性(dp47)vh和vl模块的双特异性激动性4-1bb抗体，与实施例1中的2+1格式类似的且如图1a和1b中描绘的。在这个实施例中，构建物的第一重链hc1由下述构件构成：抗4-1bb(克隆20h4.9)的vhch1，继以fc穴，在其c端融合非结合性克隆(dp47)的vl，或vh。第二重链hc2构成如下：抗4-1bb(克隆20h4.9)的vhch1，继以fc节，在其c端融合非结合性克隆(dp47)的vh或vl。对于4-1bb结合物，自us7,659,384(b2)获得克隆20h4.9的vh和vl序列。fc节与fc穴链的组合容许生成包括一个非结合性模块(dp47)和两个4-1bb结合fab的异二聚体(图1a和1b)。依照国际专利申请公开文本no.wo2012/130831a1中描述的方法，已经在节和穴重链的恒定区中引入pro329gly，leu234ala和leu235ala突变以消除对fcγ受体的结合。2+1抗4-1bb，非靶向性(dp47)vh与节融合和vl与穴链融合的氨基酸序列可分别见表17。2+1抗4-1bb，非靶向性(dp47)vl与节融合和vh与穴链融合的氨基酸序列可分别见表18。表17：双特异性，二价抗4-1bb/非靶向性dp47人igg1p329glala抗原结合分子(dp47vl与fc穴链融合且vh与fc节链融合的构建物，下文称作穴-vl)的序列表18：双特异性，二价抗4-1bb/单价dp47人igg1p329glala抗原结合分子(dp47vh与fc穴链融合且vl与fc节链融合的构建物，称作穴-vh)的序列通过使用聚乙烯亚胺用哺乳动物表达载体共转染hek293-ebna细胞来生成双特异性2+1抗4-1bbdp47huigg1p329glala抗原结合分子。以1:1:1比(“载体节重链”:“载体轻链”:“载体穴重链”)用相应的表达载体转染细胞。如实施例1中所述进行生成。实施例5：具有对小鼠4-1bb的二价结合和对fap的单价结合的双特异性抗原结合分子的制备，纯化和表征5.1具有对小鼠4-1bb的二价结合和对fap的单价结合的双特异性抗体的生成制备具有对4-1bb的二价结合和对fap的单价结合的双特异性激动性小鼠4-1bb抗体，也称作2+1，与图1a和1b类似地。在这个实施例中，构建物的第一重链hc1由下述构件构成：抗4-1bb(克隆mu137-1)的vhch1，继以含有突变lys392asp和lys409asp的fc(称作fc-dd)，在其c端融合抗fap结合物(克隆28h1)的vl，或vh。第二重链hc2构成如下：抗4-1bb(克隆mu137-1)的vhch1，继以含有突变glu356lys和asp399lys的fc(称作fc-kk)，在其c端融合抗fap结合物(克隆28h1)的vh或vl。用于增强抗体fc异二聚体形成的ddkk突变格外记载于gunasekaranetal.,j.biol.chem.2010,19637-19646。靶向性抗fap-fcdd与抗4-1bb-fckk链的组合容许生成包括一个fap结合模块和两个鼠小鼠4-1bb结合fab的异二聚体(图1a和1b)。依照例如baudinoetal.,j.immunol.(2008)181,6664-6669或wo2016/030350a1中描述的方法，在重链的恒定区中引入dapg突变以消除对小鼠fcγ受体的结合。简言之，在fc-dd和fc-kk重链的恒定区中引入asp265ala和pro329gly突变以消除对fcγ受体的结合(编号方式依照kabateu索引；即d265a，p329g)。a-fap(28h1)vh与fc-kk融合且vl与fc-dd链融合的2+1抗4-1bb(mu137-1)，抗fap(28h1)构建物的氨基酸序列可分别见表19。a-fap(28h1)vl与fc-kk融合且vh与fc-dd链融合的2+1抗4-1bb(mu137-1)，抗fap(28h1)构建物的氨基酸序列可分别见表20。表19：双特异性，二价抗4-1bb(mu137-1)/抗fap(28h1)小鼠igg1dapg抗原结合分子(fapvl与fc-dd链融合且vh与fc-kk链融合的构建物，下文也称作fc-dd-vl)的序列表20：双特异性，二价抗4-1bb(mu137-1)/单价抗fap(28h1)小鼠igg1dapg抗原结合分子(fapvh与fcdd链融合且vl与fckk链融合的构建物，称作fc-dd-vh)的序列通过使用evifect(evitriaag)用哺乳动物表达载体共转染悬浮生长的cho-k1细胞来生成双特异性2+1抗4-1bb抗fapmuigg1dapg。以1:1:1比(“载体fc-dd重链”:“载体轻链”:“载体fc-kk重链”)用相应的表达载体转染细胞。为了转染，在evimake(evitriaag)培养基中无血清悬浮培养cho-k1细胞。在具有5％co2气氛的温箱中于37℃7天后，收集培养上清液用于通过离心来纯化并将溶液无菌过滤(0.22mm滤器)并于4℃保存。通过使用蛋白a的亲和层析，继以大小排阻层析自细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质。为了亲和层析，在用40ml20mm磷酸钠，20mm柠檬酸钠ph7.5平衡的蛋白amabselectsure柱(cv＝5ml，gehealthcare)上加载上清液。通过用至少10个柱体积的含有20mm磷酸钠，20mm柠檬酸钠的缓冲液(ph7.5)清洗来去除未结合的蛋白质。使用在15个柱体积的20mm柠檬酸钠，100mm氯化钠，100mm甘氨酸，ph3.0上创建的氯化钠的线性ph梯度(20至100mm)洗脱结合的蛋白质。然后用10个柱体积的20mm柠檬酸钠，100mm氯化钠，100mm甘氨酸，ph3.0清洗柱。通过添加1/40(v/v)2mtris，ph8.0来调节收集的级分的ph。浓缩并过滤蛋白质，之后在用20mm组氨酸，140mm氯化钠，ph6.0平衡的hiloadsuperdex16/600s200柱(gehealthcare)上加载。使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过以280nm测量od来测定经过纯化的双特异性构建物的蛋白质浓度。使用labchipgxii(caliper)通过还原剂(invitrogen，usa)存在和缺失下的ce-sds来分析双特异性构建物的纯度和分子量。于25℃使用在25mmk2hpo4，125mmnacl，200mm单盐酸l-精氨酸，0.02％(w/v)nan3，ph6.7运行缓冲液中平衡的tskgelg3000swxl分析性大小排阻柱(tosoh)分析双特异性构建物的聚集体含量。表21:具有对4-1bb的二价结合和对fap的单价结合的双特异性抗原结合分子(2+1)抗4-1bb(mu137-1)，抗fap(28h1)小鼠igg1dapg的生化分析5.2使用小鼠脾细胞激活测定法的功能性体外表征为了功能性测定法，与小鼠成纤维细胞细胞系nih/3t3-小鼠fap克隆36一起共培养小鼠脾细胞。通过用在cmv启动子下编码小鼠fap的表达质粒转染亲本nih/3t3细胞系(atcc–美国典型培养物保藏中心，crl-1658)接受小鼠成纤维细胞细胞系nih/3t3-小鼠fap克隆36。在供应有10％fbs(gibcobylifetechnologies，经伽马照射，热灭活的)和1％(v/v)glutamax-i(gibcobylifetechnologies，目录号35050-038)的dmem(gibcobylifetechnologies，catno42430-082)中在1.5μg/ml嘌呤霉素(invivogen，目录号ant-pr-5)存在下维持细胞nih/3t3-小鼠fap克隆36。为了功能性测定法，将来自6-8周龄雌性c57bl/6小鼠的小鼠脾分离入无菌dpbs(gibcobylifetechnologies，目录号14190136)。通过穿过70μm细胞过滤器(corning，目录号352350)分离脾和穿过30μm预分离滤器(miltenyibiotec，目录号130-041-407)过滤在供应有10％胎牛血清(fbs，gibcobylifetechnologies，经伽马照射，热灭活的)，1％(v/v)glutamax-i(gibcobylifetechnologies，目录号35050-038)，1mm丙酮酸钠(sigma-aldrich，目录号s8636)和50μmβ-巯基乙醇的rpmi1640培养基(gibcobylifetechnologies，目录号42401-042)中生成单细胞脾细胞细胞悬浮液。通过在ack裂解缓冲液(在双蒸水(ddh2o)中的0.15mnh4cl，10mmkhco3，0.1mmedta，ph7.2)中重悬浮细胞和于室温温育10分钟来裂解红细胞。用fbs停止裂解，用无菌dpbs清洗细胞并用0.5μmcelltrace紫色细胞增殖染料(celltracer，目录号c34557)在37℃pbs中标记10分钟。用fbs停止标记。将0.15x106个紫色细胞增殖染料标记的脾细胞与0.02x106个贴壁的经50戈瑞照射的nih/3t3-小鼠fap克隆36细胞，0.5μg/ml(～3.57nm)激动性抗小鼠cd3亚美尼亚仓鼠igg(克隆145-2c11，bd，目录号553057)和不同滴定浓度的激动性小鼠4-1bb抗体抗体(克隆mu137-1)或对照(leaf纯化的小鼠igg1κ同种型对照克隆mopc-21，biolegend，目录号400153)一起在200μl/孔供应有10％胎牛血清(fbs，gibcobylifetechnologies，经伽马照射，热灭活的)，1％(v/v)glutamax-i(gibcobylifetechnologies，目录号35050-038)，1mm丙酮酸钠(sigma-aldrich，目录号s8636)和50μmβ-巯基乙醇的rpmi1640培养基(gibcobylifetechnologies，目录号42401-042)中在96孔组织培养圆底板(ttp，目录号92097)共培养4天。4天后，用facs缓冲液清洗细胞并在50μl/孔冷的含有1:5000稀释的活的/死的可固定aqua死细胞染料的dpbs中于4℃染色30分钟。用pbs清洗细胞后，将细胞在50μl/孔冷的含有抗小鼠cd8a大鼠igg2a-apc/cy7(biolegend，目录号100714，克隆53-6.7)，抗小鼠cd4大鼠igg2b，κ-apc(biolegend，目录号100412，克隆gk1.5)，抗小鼠cd137(4-1bb)叙利亚仓鼠igg-pe(biolegend，目录号106106，克隆17b5)和抗小鼠cd25-percp-cy5.5大鼠igg2b(biolegend，目录号1019112)的facs缓冲液中于4℃染色30分钟。清洗细胞并在新鲜制备的固定/透化缓冲液(foxp3/转录因子染色缓冲液套组，ebioscience，目录号00-5523-00)中于4℃温育30分钟。清洗后，将细胞用50μl/孔含有抗小鼠粒酶b-大鼠igg2b-pe(ebioscience，目录号128822,克隆16g6)的透化缓冲液于4℃染色1小时。然后清洗细胞，在facs缓冲液中重悬浮并使用3激光macsquant分析仪10(miltenyibiotech)获取并使用flowjov10.0.7(flowjollc)分析。如图14a至14j中显示的，用0.5μg/ml激动性抗小鼠cd3亚美尼亚仓鼠igg(信号1)与交联的激动性抗小鼠4-1bb抗体组合激活小鼠t细胞导致增殖升高导致cd8+t细胞(图14a)和cd4+t细胞(图14b)中的4-1bb表达升高，cd8+t细胞(图14c)和cd4+t细胞(图14d)中的cd25表达升高，cd8+t细胞(图14e)和cd4+t细胞(图14f)中的粒酶b表达，cd8+t细胞(图14g)和cd4+t细胞(图14h)中的增殖和通过侧向散射值升高显示的cd8+t细胞(图14i)和cd4+t细胞(图14j)中的尺寸增大。为了4-1bb协同作用，激动性抗小鼠克隆mu137-1不得不交联。这或是通过fcγr交联(实心黑色菱形，小鼠4-1bb(mu137-1)moigg1)介导的，如图14h中通过略微升高的cd4增殖显示的，或是经由双特异性fap结合(灰色星形，点线，小鼠4-1bb(mu137-1)xfap(28h1)moigg1dapg2+1)以强得多的协同方式介导的，如图14a至14f和图14h至14j中显示的。fcγr结合和因此交联惰性的小鼠4-1bb(mu137-1)moigg1dap抗体(空心黑色菱形，点线)现在具有背景以上的协同效应。实施例6：具有对4-1bb的二价结合和对cea的单价结合的双特异性抗原结合分子的制备，纯化和表征6.1具有对4-1bb的二价结合和对cea的单价结合的双特异性抗体的生成制备具有对4-1bb的二价结合和对cea的单价结合的双特异性激动性4-1bb抗体，也称作2+1，如图1a和1b中描绘的。通过在第一重链hc1(fc节重链)中引入s354c/t366w突变和在第二重链hc2(fc穴重链)中引入y349c/t366s/l368a/y407v突变来应用节入穴技术以容许生成异二聚体。在这个实施例中，构建物的第一重链hc1由下述构件构成：抗4-1bb结合物(克隆20h4.9)的vhch1，继以fc节，在其c端融合抗cea结合物(克隆t84.66-lcha或a5b7)的vl或vh。第二重链hc2构成如下：抗4-1bb的vhch1，继以fc穴，在其c端分别融合抗cea结合物(克隆t84.66-lcha或a5b7)的vh或vl。cea结合物t84.66-lcha的生成和制备记载于wo2016/075278a2，通过援引将其收入本文。cea克隆a5b7的vh和vl的序列自wo2007/071426获得且自鼠抗cea克隆a5b7衍生。对于4-1bb结合物，依照us7,288,638b2或us7,659,384b2获得克隆20h4.9的vh和vl序列。两条重链的组合容许生成包括一个cea结合模块和两个4-1bb结合fab的异二聚体(图1a和1b)。依照国际专利申请公开文本no.wo2012/130831a1中描述的方法，已经在节和穴重链的恒定区中引入pro329gly，leu234ala和leu235ala突变以消除对fcγ受体的结合。通过使用聚乙烯亚胺用哺乳动物表达载体共转染hek293-ebna细胞来生成双特异性2+1抗4-1bb抗ceahuigg1p329glala抗体。以1:1:1比(“载体节重链”:“载体轻链”:“载体穴重链”)用相应的表达载体转染细胞。a-cea(t84.66-lcha)vh与fc节重链融合且vl与fc穴重链融合的2+1抗4-1bb，抗cea构建物的碱基对和氨基酸序列可分别见表22。表22：双特异性，二价抗4-1bb/单价抗cea(t84.66-lcha)人igg1p329glala抗原结合分子(a-ceavl与fc穴链融合且vh与fc节链融合的构建物，称作穴-vl)的序列a-cea(t84.66-lcha)vl与fc节重链融合且vh与fc穴重链融合的2+1抗4-1bb，抗cea(t84.66-lcha)构建物的碱基对和氨基酸序列可分别见表23。表23：双特异性，二价抗4-1bb/单价抗cea(t84.66-lcha)人igg1p329glala抗原结合分子(a-ceavh与fc穴链融合且vl与fc节链融合的构建物，称作穴-vh)的序列a-cea(a5b7)vh与fc节重链融合且vl与fc穴重链融合的2+1抗4-1bb，抗cea构建物的碱基对和氨基酸序列可分别见表24。该分子称作2+14-1bb(20h4.9)/cea(a5b7)人igg1pglala(g4s)4,穴vl。表24：双特异性，二价抗4-1bb/单价抗cea(a5b7)人igg1p329glala抗原结合分子(a-ceavl与fc穴链融合且vh与fc节链融合的构建物，称作穴-vl)的序列a-cea(a5b7)vl与fc节重链融合且vh与fc穴重链融合的2+1抗4-1bb，抗cea(a5b7)构建物的碱基对和氨基酸序列可分别见表25。该分子称作2+14-1bb(20h4.9)/cea(a5b7)人igg1pglala(g4s)4,穴vh。表25：双特异性，二价抗4-1bb/单价抗cea(a5b7)人igg1p329glala抗原结合分子(a-ceavh与fc穴链融合且vl与fc节链融合的构建物，称作穴-vh)的序列a-cea(a5b7)vh与fc节重链融合且vl与fc穴重链融合的2+1抗4-1bb，抗cea构建物的氨基酸序列可分别见表26。该分子称作2+14-1bb(20h4.9)/cea(a5b7)人igg1pglala(g4s)2，穴vl。表26：双特异性，二价抗4-1bb/单价抗cea(a5b7)人igg1p329glala抗原结合分子(a-ceavl与fc穴链融合且vh与fc节链融合的构建物，称作穴-vl)的序列a-cea(a5b7)vl与fc节重链融合且vh与fc穴重链融合的2+1抗4-1bb，抗cea(a5b7)构建物的氨基酸序列可分别见表27。该分子称作2+14-1bb(20h4.9)/cea(a5b7)人igg1pglala(g4s)2,穴vh。表27：双特异性，二价抗4-1bb/单价抗cea(a5b7)人igg1p329glala抗原结合分子(a-ceavh与fc穴链融合且vl与fc节链融合的构建物，称作穴-vh)的序列用鼠cea克隆a5b7p(进一步记载于wo92/01059)和cea克隆431/26(进一步记载于ep501215a2)制备别的实施例。亲本a-cea(a5b7p)vh与fc节重链融合且vl与fc穴重链融合的2+1抗4-1bb，抗cea构建物的氨基酸序列可分别见表28。该分子称作2+14-1bb(20h4.9)/cea(a5b7p)人igg1pglala,穴vl。表28：双特异性，二价抗4-1bb/单价抗cea(a5b7p)人igg1p329glala抗原结合分子(a-ceavl与fc穴链融合且vh与fc节链融合的构建物，称作(g4s)4穴-vl)的序列a-cea(a5b7p)vl与fc节重链融合且vh与fc穴重链融合的2+1抗4-1bb，抗cea(a5b7p)构建物的氨基酸序列可分别见表29。该分子称作2+14-1bb(20h4.9)/cea(a5b7p)人igg1pglala，(g4s)4,穴vh。表29：双特异性，二价抗4-1bb/单价抗cea(a5b7p)人igg1p329glala抗原结合分子(a-ceavh与fc穴链融合且vl与fc节链融合的构建物，称作穴-vh)的序列a-cea(431/26)vh与fc节重链融合且vl与fc穴重链融合的2+1抗4-1bb，抗cea构建物的氨基酸序列可分别见表30。该分子称作2+14-1bb(20h4.9)/cea(431/26)人igg1pglala，(g4s)4,穴vl。表30：双特异性，二价抗4-1bb/单价抗cea(431/26)人igg1p329glala抗原结合分子(a-ceavl与fc穴链融合且vh与fc节链融合的构建物，称作穴-vl)的序列a-cea(a5b7p)vl与fc节重链融合且vh与fc穴重链融合的2+1抗4-1bb，抗cea(431/26)构建物的氨基酸序列可分别见表31。该分子称作2+14-1bb(20h4.9)/cea(431/26)人igg1pglala，(g4s)4,穴vh。表31：双特异性，二价抗4-1bb/单价抗cea(431/26)人igg1p329glala抗原结合分子(a-ceavh与fc穴链融合且vl与fc节链融合的构建物，称作穴-vh)的序列如关于双特异性二价抗4-1bb和抗faphuigg1p329glala所述(见实施例1.1)生成和纯化双特异性抗4-1bb/抗cea抗原结合分子。为了500ml摇瓶中的生成，在转染前24小时接种400x106个hek293ebna细胞。为了转染，将细胞以210g离心5分钟，并用预温热的cdcho培养基替换上清液。在20mlcdcho培养基中混合表达载体至200μgdna的最终量。添加540μlpei后，将溶液漩涡震荡15秒并于室温温育10分钟。之后，将细胞与dna/pei溶液混合，转移至500ml摇瓶并在具有5％co2气氛的温箱中于37℃温育3小时。温育后，添加160mlf17培养基并将细胞培养24小时。转染后1天，添加1mm丙戊酸和7％补料。培养7天后，通过以210xg离心15分钟来收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，补充叠氮化钠至0.01％(w/v)的终浓度，并于4℃保持。通过使用蛋白a的亲和层析，继以大小排阻层析自细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质。为了亲和层析，在用40ml20mm磷酸钠，20mm柠檬酸钠ph7.5平衡的蛋白amabselectsure柱(cv＝5ml，gehealthcare)上加载上清液。通过用至少10个柱体积的含有20mm磷酸钠，20mm柠檬酸钠的缓冲液(ph7.5)清洗来去除未结合的蛋白质。使用在15个柱体积的20mm柠檬酸钠，100mm氯化钠，100mm甘氨酸，ph3.0上创建的氯化钠的线性ph梯度(20至100mm)洗脱结合的蛋白质。然后用10个柱体积的20mm柠檬酸钠，100mm氯化钠，100mm甘氨酸，ph3.0清洗柱。通过添加1/40(v/v)2mtris，ph8.0来调节收集的级分的ph。浓缩并过滤蛋白质，之后在用20mm组氨酸，140mm氯化钠，ph6.0平衡的hiloadsuperdex16/600s200柱(gehealthcare)上加载。使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过以280nm测量od来测定经过纯化的双特异性构建物的蛋白质浓度。使用labchipgxii(caliper)通过还原剂(invitrogen，usa)存在和缺失下的ce-sds来分析双特异性构建物的纯度和分子量。于25℃使用在25mmk2hpo4，125mmnacl，200mm单盐酸l-精氨酸，0.02％(w/v)nan3，ph6.7运行缓冲液中平衡的tskgelg3000swxl分析性大小排阻柱(tosoh)分析双特异性构建物的聚集体含量。表32：2+1抗4-1bb，抗cea人igg1p329glala的生化分析6.2功能性体外表征：经由同时结合4-1bb和cea诱导nfκb激活的能力6.2.1表达人4-1bb和nfκb-萤光素酶的hela细胞的生成用含有在cmv启动子控制下的人4-1bb的序列(uniprot登录号q07011)和嘌呤霉素抗性基因的基于表达载体petr10829的质粒转导宫颈癌细胞系hela(atccccl-2)。在补充有10％(v/v)fbs，1％(v/v)glutamax-i和3μg/ml嘌呤霉素的dmem培养基中培养细胞。通过流式细胞术对4-1bb转导的hela细胞测试4-1bb表达：在100μl含有0.1μgpercp/cy5.5缀合的抗人4-1bb小鼠igg1κ克隆4b4-1(biolegend，目录号309814)或其同种型对照(percp/cy5.5缀合的小鼠igg1κ同种型对照抗体克隆mopc21，biolegend，目录号400150)的facs缓冲液中重悬浮0.2x106个活细胞并于4℃温育30分钟。将细胞用facs缓冲液清洗两次，在含有0.06μgdapi(santacruzbiotec，目录号sc-3598)的300μlfacs缓冲液中重悬浮并使用5激光lsr-fortessa(bdbioscience，diva软件)获取。如描述的实施有限稀释以生成单克隆：将人4-1bb转导的hela细胞在培养基中重悬浮至10，5和2.5个细胞/ml的密度并将200μl细胞悬浮液转移至圆底组织培养物处理的96孔板(6块板/细胞浓度，tpp目录号92697)。收获单克隆，扩充并如上文描述的测试4-1bb表达。选择具有最高4-1bb表达的克隆(克隆5)，用于后续用nfκb-萤光素酶表达载体5495ptranlucenthygb转染。载体赋予转染细胞以对潮霉素b的抗性和在nfκb响应元件(panomics，目录号lr0051)控制下表达萤光素酶的能力二者。为了转染人4-1bb，将hela克隆5细胞培养至70％汇合。将50μg(40μl)线性化的(限制酶asei和sali)5495ptranlucenthygb表达载体添加至无菌0.4cmgenepulser/micropulser杯(biorad，目录号165-2081)。添加400μl无补充物的dmem培养基中的2.5x106个人4-1bbhela克隆5细胞并与质粒溶液小心混合。以如下设置使用genepulserxcell总系统(biorad，目录号1652660)实施细胞转染：指数式脉冲，电容500μf，电压160v，电阻无限。脉冲后立即将转染细胞转移至装有15ml37℃温的供应有10％(v/v)fbs和1％(v/v)glutamaxi的dmem培养基的75cm2组织培养瓶(tpp，目录号90075)。次日，添加含有3μg/ml嘌呤霉素和200μg/ml潮霉素b(roche，目录号10843555001)的培养基。扩充存活细胞并如上文描述的实施有限稀释以生成单克隆。如上文描述的对克隆测试4-1bb表达并如下测试nfκb-萤光素酶活性：在选择培养基中收获克隆并使用细胞计数器vi-cellxr2.03(beckmancoulter，目录号731050)计数。以0.33x106个细胞/ml的细胞密度设置细胞并将150μl此细胞悬浮液转移至带盖的无菌白色96孔平底组织培养板(greinerbioone，目录号655083)的每个孔。将细胞在细胞温箱(heracell)中于37℃和5％co2温育过夜。次日，将50μl含有不同浓度的重组人肿瘤坏死因子α(rhtnfα，peprotech，目录号30001a)的培养基添加至96孔板的每个孔，产生100，50，25，12.5，6.25和0ng/孔的rhtnfα终浓度。将细胞于37℃和5％co2温育6小时，然后用200μl/孔dpbs清洗。将报告物裂解缓冲液(promega，目录号e3971)添加至每个孔(40μl)并将板于-20℃保存过夜。次日，将冷冻的细胞板和检测缓冲液(萤光素酶1000测定系统，promega，目录号e4550)融化至室温。将100μl检测缓冲液添加至每个孔并尽可能快地使用spectramaxm5/m5e微量板读数仪和softmaxpro软件(moleculardevices)测量板。以对照(不添加rhtnfα)以上对500ms/孔测得的所释放的光的单位(url)作为萤光素酶活性。hela-hu4-1bb-nfκb-luc克隆26展现最高的萤光素酶活性和可观水平的4-1bb表达，选择用于进一步使用。6.2.2与fap表达性肿瘤细胞共培养的表达人4-1bb的hela细胞报告细胞系中的nfκb激活收获hela-hu4-1bb-nfκb-luc克隆26细胞并在供应有10％(v/v)fbs和1％(v/v)glutamax-i的dmem培养基中重悬浮至0.2x106个细胞/ml的浓度。将100μl(2x104个细胞)此细胞悬浮液转移至带盖的无菌白色96孔平底组织培养板(greinerbioone，目录号655083)的每个孔并将板于37℃和5％co2温育过夜。次日，添加50μl含有所滴定的4-1bb(20h4.9)xcea(a5b7)2+1的培养基。将cea表达性人胃腺癌细胞系mkn45(dsmzacc409)在供应有10％(v/v)fbs和1％(v/v)glutamax-i的dmem培养基中重悬浮至2x106个细胞/ml的浓度。将cea表达性mkn45细胞的悬浮液(50μl)或作为阴性对照的培养基添加至每个孔并将板在细胞温箱中于37℃和5％co2温育6小时。用200μl/孔dpbs清洗细胞。将40μl新鲜制备的报告物裂解缓冲液(promega，目录号e3971)添加至每个孔并将板于-20℃保存过夜。次日，于室温融化冷冻的细胞板和检测缓冲液(萤光素酶1000测定系统，promega，目录号e4550)。将100μl检测缓冲液添加至每个孔并尽可能快地使用spectramaxm5/m5e微量板读数仪和softmaxpro软件(moleculardevices)测量萤光素酶活性。在图15a和15b中显示4-1bb(20h4.9)xcea(a5b7)2+1((g4s)2,穴vh)的激活特性，使用4-1bb表达性报告细胞系。在图15a中测试在cea表达性mkn45缺失下的激活特性，而在图15b中测试在mkn45细胞存在下的激活特性。在任何交联缺失下，仅仅在高浓度和以有限的最大值看到激活。在mkn45细胞存在下，ec50值可能降低且激活最大值升高。因此仅仅在cea介导的交联存在下对4-1bb(20h4.9)xcea(a5b7)2+1看到它的完全潜力。ec50值和曲线下面积(auc)在图15a和15b中的图中指示。6.3包含c端连接的交叉fab的具有对4-1bb的二价结合和对cea的单价结合的双特异性抗体的生成制备具有对4-1bb的二价结合和对cea的单价结合的双特异性激动性4-1bb抗体，也称作2+1交叉fab，如图1d和1e中描绘的。通过在第一重链hc1(fc节重链)中引入s354c/t366w突变和在第二重链hc2(fc穴重链)中引入y349c/t366s/l368a/y407v突变来应用节入穴技术以容许生成异二聚体。在这个实施例中，构建物的hc1由下述构件构成：抗4-1bb(克隆20h4.9)的vhch1，继以fc节和交叉的抗cea克隆(克隆a5b7p)的vhcl，或vlch1。hc2构成如下：抗4-1bb(克隆20h4.9)的vhch1，继以fc穴。构建物的lc1包含抗4-1bb(克隆20h4.9)的的vhch1。构建物的lc2包含交叉的抗cea结合物(克隆a5b7p)的vlch1，或vhcl。在抗原结合分子之一中，为了改善轻链的正确配对，在抗4-1bbfab的ch-cl中引入下述突变：cl域中的e123r和q124k和ch1域中的k147e和k213e。依照国际专利申请公开文本no.wo2012/130831a1中描述的方法，在节和穴重链的恒定区中引入pro329gly，leu234ala和leu235ala突变以消除对fcγ受体的结合。a-cea(a5b7p)chcl交叉fab与fc节重链融合的2+1交叉fab抗4-1bb，抗cea构建物的氨基酸序列可分别见表33。表33：双特异性，二价抗4-1bb/单价抗cea(a5b7p)人igg1p329glala抗原结合分子(a-ceachcl交叉fab与fc节链融合的构建物，称作节-chcl交叉fab)的序列a-cea(a5b7p)chcl交叉fab与fc节重链融合的2+1交叉fab抗4-1bb，抗cea构建物的氨基酸序列可分别见表34。表34：具有带电荷变体的双特异性，二价抗4-1bb/单价抗cea(a5b7p)人igg1p329glala抗原结合分子(a-ceavhvl交叉fab与fc节链融合的构建物，称作节-vhvl交叉fab)的序列通过瞬时转染hek293ebna细胞来生成包含交叉fab的双特异性抗体。将细胞离心并用预温热的cdcho培养基替换培养基。在cdcho培养基中混合表达载体，添加pei，将溶液漩涡震荡并于室温温育10分钟。之后，将细胞与dna/pei溶液混合，转移至摇瓶并在具有5％co2气氛的温箱中于37℃温育3小时。温育后，添加具有补充物的excell培养基。转染后1天，添加12％补料。7天后收获细胞上清液并通过标准方法纯化。参考标准方案自过滤的细胞培养物上清液纯化蛋白质。简言之，通过使用蛋白a的亲和层析术自细胞培养物上清液纯化含有fc的蛋白质。于ph3.0实现洗脱，立即继以中和样品。浓缩蛋白质并在20mm组氨酸，140mm氯化钠，ph6.0中通过大小排阻层析术将聚集的蛋白质与单体蛋白质分开。依照paceetal.,proteinscience,1995,4,2411-1423，使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过以280nm测量光密度(od)来测定纯化的构建物的蛋白质浓度。使用labchipgxii通过还原剂存在和缺失下的ce-sds来分析蛋白质的纯度和分子量。于25℃使用在25mmk2hpo4，125mmnacl，200mm单盐酸l-精氨酸，ph6.7运行缓冲液中平衡的分析性大小排阻柱(tskgelg3000swxl)通过hplc层析术实施聚集体含量的测定。表35：2+1抗4-1bb，抗cea交叉fab人igg1pglala抗原结合分子的生化分析6.3.1包含c端连接的cea交叉fab的2+1双特异性4-1bb抗体的功能性表征使用抗原n(a2-b2)a(其指cea上的特定表位区域)，通过表面等离振子共振(spr)评估同时结合人4-1bbfc(kih)和人cea的能力。所有spr实验是用hbs-ep作为运行缓冲液(0.01mhepesph7.4，0.15mnacl，3mmedta，0.005％表面活性剂p20，biacore，freiburg/germany)于25℃在biacoret200上实施的。通过胺偶联将人n(a2-b2)a直接偶联至流动室(cm5传感器芯片)。使用750个共振单位(ru)的固定化水平。在90秒里以30μl/min的流以200nm的浓度范围使cea靶向性4-1bb抗体流经流动室并将解离设为零秒。以500nm的浓度在90秒里以30μl/min的流注射作为第二分析物的人4-1bbfc(kih)经过流动室(图20a)。对解离监测120秒。通过减去在没有固定化蛋白质的参照流动室中获得的响应来修正本体折射率差异。如在图20b和20c的图中能看到的，具有对cea的单价结合的2+1双特异性激动性4-1bb抗体能同时结合人n(a2-b2)a和人4-1bb。6.4细胞上的结合6.4.1人4-1bb表达性细胞系jurkat-hu4-1bb-nfκb-luc2上的结合为了测定对细胞表达的4-1bb的结合，使用jurkat-hu4-1bb-nfκb-luc2(promega，cs196004)细胞。因此将0.2x106个jurkat-hu4-1bb-nfκb-luc细胞添加至圆底悬浮细胞96孔板(greinerbio-one，cellstar，目录号650185)的每个孔。于4℃将板以400xg离心4分钟并丢弃上清液。用200μl/孔dpbs清洗细胞，然后与100μl/ml含有1:5000稀释的可固定存活力染料efluor450(ebioscience，目录号65-0863-18)的dpbs一起于4℃温育30分钟。之后，将细胞用200μl/孔冷的dpbs清洗一次。接着，添加50μl/孔4℃冷的含有所滴定的双特异性cea靶向性抗人4-1bb分子的facs缓冲液并将细胞于4℃温育60分钟。将细胞用200μl/孔4℃冷的facs缓冲液清洗四次以去除未结合的分子。之后，将细胞与50μl/孔4℃冷的含有2.5μg/mlpe缀合的affinipure抗人iggfcγ片段特异性山羊f(ab`)2片段(jacksonimmunoresearch，目录号109-116-098)的facs缓冲液一起进一步温育并于4℃温育30分钟。将细胞用200μlfacs缓冲液/孔清洗两次并通过在50μl/孔含有1％甲醛(sigma，ht501320-9.5l)的dpbs中重悬浮来固定。同日或次日，使用3激光macsquant分析仪10(miltenyibiotech)对细胞获取。在活的细胞上设置门并使用检测二抗的荧光强度的几何均值(mfi)来分析一抗的结合。使用graphpadprism(graphpadsoftwareinc.)，通过减去空白值(不添加一抗)对数据进行基线校准，并使用非线性回归曲线拟合(稳健拟合)以及曲线下面积(auc)计算ec50值。在图21a中显示双特异性cea靶向性4-1bb激动性分子对jurkat-hu4-1bb-nfκb-luc2的结合。所有分子均含有二价4-1bb抗原结合克隆20h4.9模块且显示相似的对人4-1bb表达性细胞的结合，不依赖于它们的cea结合模块(克隆或融合不同)。只有4-1bb(20h4.9)xcea(a5b7)2+1(黑色三角形)相似稍低一点的ec50值(表36)和略微升高的auc(图21c)。所包括的阴性对照例如非靶向性dp47huigg1p329glala(空心黑色圆形)展示基线。在表36中列出ec50值。表36：对人4-1bb表达性转基因细胞系jurkat-hu4-1bb-nfkb-luc2的结合曲线的ec50值6.4.2对人cea表达性肿瘤细胞系的结合为了测定对细胞表达的cea的结合，使用人胃癌细胞系mkn45(dsmzacc409)。因此将0.2x106个mkn45细胞添加至圆底悬浮细胞96孔板(greinerbio-one，cellstar，目录号650185)的每个孔。于4℃将板以400xg离心4分钟并丢弃上清液。用200μl/孔dpbs清洗细胞，然后与100μl/ml含有1:5000稀释的可固定存活力染料efluor450(ebioscience，目录号65-0863-18)的dpbs一起于4℃温育30分钟。之后，将细胞用200μl/孔冷的dpbs清洗一次。接着，添加50μl/孔4℃冷的含有所滴定的双特异性cea靶向性抗人4-1bb分子的facs缓冲液并将细胞于4℃温育60分钟。将细胞用200μl/孔4℃facs缓冲液清洗四次以去除未结合的分子。之后，将细胞与50μl/孔4℃冷的含有2.5μg/mlpe缀合的affinipure抗人iggfcγ片段特异性山羊f(ab`)2片段(jacksonimmunoresearch，目录号109-116-098)的facs缓冲液一起进一步温育并于4℃温育30分钟。将细胞用200μlfacs缓冲液/孔清洗两次并通过在50μl/孔含有1％甲醛(sigma，ht501320-9.5l)的dpbs中重悬浮来固定。同日或次日，使用3激光macsquant分析仪10(miltenyibiotech)对细胞获取。在活的细胞上设置门并使用检测二抗的荧光强度的几何均值(mfi)来分析一抗的结合。使用graphpadprism(graphpadsoftwareinc.)，通过减去空白值(不添加一抗)对数据进行基线校准，并使用非线性回归曲线拟合(稳健拟合)以及曲线下面积(auc)计算ec50值。在图21b中显示双特异性cea靶向性4-1bb激动性分子对cea表达性人胃癌细胞系mkn45的结合。对分子4-1bb(20h4.9)xcea(a5b7)2+1(黑色三角形)看到最强的亲和力，通过8.9nm的最低ec50值和图21d中显示的最高的auc值展示。所有其它结合曲线均没有在所测试的浓度到达平台，因此没有指示别的ec50。取决于格式和分子中整合的cea结合克隆，双特异性cea靶向性4-1bb激动性分子展示不同的对cea表达性mkn45细胞的亲和力，也如图21d中的auc展示的。6.5nfκb激活6.5.1与cea表达性肿瘤细胞共培养的表达人4-1bb和萤光素酶的hela或jurkat报告细胞系中的nfκb激活使用hela-hu4-1bb-nfκb-luc克隆26(像图15中，在2.5.1下描述的生成)或jurkat-hu4-1bb-nfκb-luc2(购自promega，cs196004)作为报告细胞系。收获hela-hu4-1bb-nfκb-luc克隆26细胞并在供应有10％(v/v)fbs和1％(v/v)glutamax-i的dmem培养基中重悬浮至0.2x106个细胞/m的浓度。在使用jurkat-hu4-1bb-nfκb-luc2细胞作为报告细胞系的情况中，收获细胞并在供应有10％(v/v)fbs和1％(v/v)glutamax-i的rpmi1640培养基中重悬浮至0.2x106个细胞/ml的浓度。将100μl(2x104个细胞)此细胞悬浮液转移至带盖的无菌白色96孔平底组织培养板(greinerbioone，目录号655083)的每个孔。在hela-hu4-1bb-nfκb-luc克隆26细胞的情况中将板于37℃和5％co2温育过夜。为了实施测定法，添加50μl含有所滴定的双特异性cea靶向性抗人4-1bb分子的培养基。将cea表达性人胃腺癌细胞系mkn45(dsmzacc409)在供应有10％(v/v)fbs和1％(v/v)glutamax-i的dmem培养基(如果使用hela-hu4-1bb-nfκb-luc克隆26作为报告细胞系的话)或rpmi1640培养基(如果使用jurkat-hu4-1bb-nfκb-luc2作为报告细胞系的话)中重悬浮至2x106个细胞/ml的浓度。将cea表达性mkn45细胞的悬浮液(50μl)或作为阴性对照的培养基添加至每个孔并将板在细胞温箱中于37℃和5％co2温育6小时。用200μl/孔dpbs清洗细胞。将40μl新鲜制备的报告物裂解缓冲液(promega，cat-no：e3971)添加至每个孔并将板于-20℃保存过夜。次日，于室温融化冷冻的细胞板和检测缓冲液(萤光素酶1000测定系统，promega，目录号e4550)。将100μl检测缓冲液添加至每个孔并尽可能快地使用spectramaxm5/m5e微量板读数仪和softmaxpro软件(moleculardevices)测量萤光素酶活性。在图23a和23b中显示不同cea靶向性4-1bb(20h4.9)分子的激活特性，使用4-1bb表达性报告细胞系jurkat-hu4-1bb-nfκb-luc2。在图23a中测试在cea表达性mkn45缺失下的激活特性而在图23b中测试在mkn45细胞存在下的激活特性。在任何交联缺失下，仅仅在高浓度和以有限的最大值看到激活。在cea靶向性4-1bb(20h4.9)分子存在下在mkn45细胞存在下ec50值降低且激活最大值升高。auc值在图23c中展示。激活特性与图21b中显示的对cea表达性mkn45细胞的结合亲和力正相关。ec50值在表37中列出。表37：在cea表达性mkn45肿瘤细胞存在下jurkat-hu4-1bb-nfκb-luc2报告细胞系激活曲线的ec50值ec50[nm]4-1bb(20h4.9)xcea(a5b7p)2+1chcl交叉fab0.094-1bb(20h4.9)xcea(a5b7p)2+1vhvl交叉fab0.054-1bb(20h4.9)xcea(a5b7p)2+10.164-1bb(20h4.9)xcea(t84.66-lcha)2+10.194-1bb(20h4.9)xcea(a5b7)2+10.034-1bb(20h4.9)xdp472+10.094-1bb(20h4.9)huigg1p329glala0.026.6在cea表达性肿瘤细胞存在下人pbmc的激活测定法用dpbs(gibcobylifetechnologies，目录号14190326)清洗cea表达性人胃癌细胞系mkn45并用无酶，基于pbs的细胞解离缓冲液(gibcobylifetechnologies，目录号13151-014)于37℃处理10分钟。收获细胞并在由供应有10％胎牛血清(fbs，us起源，panbiotech，p30-2009，批次p150307gi，经伽马照射，无支原体，于56℃热灭活35分钟的)，1％l-glutamax-i(gibcobylifetechnologies，目录号35050-038)，1mm丙酮酸钠(sigma-aldrich，目录号s8636)，1％mem非必需氨基酸溶液(sigma-aldrich，目录号m7145)，50umβ-巯基乙醇(sigma-aldrich，目录号m3148)的rpmi1640(gibcobylifetechnologies，目录号42401-042)组成的t细胞培养基中重悬浮并照射50戈瑞(x射线辐照仪rs2000，radsource)。将50μlt细胞培养基中的2x104个mkn45细胞接种至圆底组织培养96孔板(ttp，目录号92697)的每个孔。分别添加50μl含有不同滴定浓度的cea靶向性4-1bb激动性分子或对照的t细胞培养基。将人pbmc在37℃温热的含有40nmcfda-se(sigma-aldrich，目录号21888-25mg-f)的dpbs中于37℃标记15分钟。通过添加fbs来停止cfse标记，将pbmc清洗两次并在t细胞培养基中重悬浮至1.5x106个细胞/ml的终浓度。将50μl这种pbmc细胞溶液接种至每个孔以添加7.5x104个cfse标记的pbmc每孔。最后，制备含有2mm激动性抗人cd3人igg1克隆v9的t细胞培养基的储备溶液并将50μl/孔添加至每个孔，给出0.5mm抗人cd3人igg1克隆v9的终浓度。将板于37℃温育4天。用dpbs清洗细胞并用100μl/孔含有1:1000稀释的活的/死的可固定aqua死细胞染色试剂盒(molecularprobesbylifetechnology，目录号l34957)的dpbs于4℃染色30分钟。将细胞用200μl/孔dpbs清洗一次并用50μl含有0.1μg/mlpercp-cy5.5缀合的抗人cd137小鼠igg1κ(克隆4b4-1，biolegend，目录号309814)，0.1μg/mlpe/cy7缀合的抗人pd-1小鼠igg1κ(克隆eh12.2h7，biolegend，目录号329918)，0.03μg/mlapc缀合的抗人cd25小鼠igg1κ(克隆bc96，biolegend，目录号302610)，0.06μg/mlapc/cy7缀合的抗人cd8小鼠igg1κ(克隆rpa-t8，biolegend，目录号3301016)，bv421缀合的抗人cd4小鼠igg1κ(克隆rpa-t4，biolegend，目录号300532)的facs缓冲液(供应有2％fbs，5mmedtaph8(amresco，目录号e177)和7.5mm叠氮化钠(sigma-aldrichs2002)的dpbs)于4℃染色30分钟。将板用200μl/孔dpbs清洗两次并将细胞用含有1％甲醛(sigma，ht501320-9.5l)的dpbs固定15分钟。在100μl/孔facs缓冲液中重悬浮细胞并使用macsquant分析仪10(miltenyibiotech)获取。使用flowjov10(flowjo，llc)和graphpadprism6.04(graphpadsoftware，inc)分析数据。如图23a至23d中显示的，4-1bb(20h4.9)xcea(a5b7)2+1(g4s)2分子能够在亚最佳的cd3刺激存在下诱导cd25上调以及改善的cd4和cd8t细胞增殖。非靶向性4-1bb(20h4.9)xdp472+1或4-1bb(20h4.9)huigg1p329glala分子仅仅诱导有限的t细胞激活。因此，在cea表达性细胞和亚最佳的tcr刺激存在下，4-1bb(20h4.9)xcea(a5b7)2+1(g4s)2激动剂能诱导比非靶向性分子更强的t细胞激活和增殖。在表38中列出ec50值。表38：在cea表达性mkn45肿瘤细胞存在下pbmc激活曲线的ec50值如图24a至24d中显示的，监测如图23中显示的来自另一名供体的pbmc的激活。所有cea靶向性4-1bb(20h4.9)激动性分子均能够在亚最佳的cd3刺激存在下诱导cd25上调以及改善的cd4和cd8t细胞增殖，超出非靶向性4-1bb(20h4.9)分子。在表39中列出ec50值。表39：在cea表达性mkn45肿瘤细胞存在下pbmc激活曲线的ec50值实施例7：具有对4-1bb的四价结合和对cea的单价结合的双特异性抗体的制备，纯化和表征7.1具有对4-1bb的四价结合和对cea的单价结合的双特异性抗体的生成制备具有对4-1bb的四价结合和对cea的单价结合的双特异性激动性4-1bb抗体，也称作4+1，如图4a和4b中描绘的。通过在第一重链hc1(fc节重链)中引入s354c/t366w突变和在第二重链hc2(fc穴重链)中引入y349c/t366s/l368a/y407v突变来应用节入穴技术以容许生成异二聚体。在这个实施例中，构建物的第一重链hc1由下述构件构成：抗4-1bb结合物(克隆20h4.9)的vhch1_vhch1，继以fc穴，在其c端融合抗cea结合物(克隆t84.66-lcha或a5b7)的vl或vh。第二重链hc2构成如下：抗4-1bb结合物(克隆20h4.9)的vhch1_vhch1，继以fc节，在其c端分别融合抗fap结合物(克隆t84.66-lcha或a5b7)的vh或vl。cea结合物t84.66-lcha的生成和制备记载于wo2016/075278a2，通过援引将其收入本文。cea克隆a5b7的vh和vl序列自wo2007/071426获得且自鼠抗cea克隆a5b7衍生。对于4-1bb结合物，依照us7,288,638b2或us7,659,384b2获得克隆20h4.9的vh和vl序列。两条重链的组合容许生成包括一个cea结合模块和四个4-1bb结合fab的异二聚体。依照国际专利申请公开文本no.wo2012/130831a1中描述的方法，已经在节和穴重链的恒定区中引入pro329gly，leu234ala和leu235ala突变以消除对fcγ受体的结合。通过使用聚乙烯亚胺用哺乳动物表达载体共转染hek293-ebna细胞来生成双特异性4+1抗4-1bb抗faphuigg1p329glala抗原结合分子。以1:1:1比(“载体节重链”:“载体轻链”:“载体穴重链”)用相应的表达载体转染细胞。如关于双特异性二价抗4-1bb和抗faphuigg1p329glala所述(见实施例1.1)生成和纯化抗原结合分子。a-ceavh与fc节重链融合且vl与fc穴重链融合的4+1抗4-1bb，抗cea(t84.66-lcha)构建物的碱基对和氨基酸序列可分别见表40。a-ceavl与fc节重链融合且vh与fc穴重链融合的4+1抗4-1bb，抗cea(t84.66-lcha)构建物的碱基对和氨基酸序列可分别见表41。表40：双特异性，四价抗4-1bb/单价抗cea(t84.66-lcha)人igg1p329glala抗原结合分子(a-ceavl与fc穴链融合且vh与fc节链融合的构建物，称作穴-vl)的序列表41：双特异性，四价抗4-1bb/单价抗cea(t84.66-lcha)人igg1p329glala抗原结合分子(a-ceavh与fc穴链融合且vl与fc节链融合的构建物，称作穴-vh)的序列a-ceavh与fc节重链融合且vl与fc穴重链融合的4+1抗4-1bb，抗cea(a5b7)构建物的碱基对和氨基酸序列可分别见表42。a-ceavl与fc节重链融合且vh与fc穴重链融合的4+1抗4-1bb，抗cea(a5b7)构建物的碱基对和氨基酸序列可分别见表43。表42：双特异性，四价抗4-1bb/单价抗cea(a5b7)人igg1p329glala抗原结合分子(a-ceavl与fc穴链融合且vh与fc节链融合的构建物，称作穴-vl)的序列表43：双特异性，四价抗4-1bb/单价抗cea(a5b7)人igg1p329glala抗原结合分子(a-ceavh与fc穴链融合且vl与fc节链融合的构建物，称作穴-vh)的序列a-ceavh与fc节重链融合且vl与fc穴重链融合的4+1抗4-1bb，抗cea(a5b7p)构建物的碱基对和氨基酸序列可分别见表44。a-ceavl与fc节重链融合且vh与fc穴重链融合的4+1抗4-1bb，抗cea(a5b7p)构建物的碱基对和氨基酸序列可分别见表45。表44：双特异性，四价抗4-1bb/单价抗cea(a5b7p)人igg1p329glala抗原结合分子(a-ceavl与fc穴链融合且vh与fc节链融合的构建物，称作穴-vl)的序列表45：双特异性，四价抗4-1bb/单价抗cea(a5b7p)人igg1p329glala抗原结合分子(a-ceavh与fc穴链融合且vl与fc节链融合的构建物，称作穴-vh)的序列a-ceavh与fc节重链融合且vl与fc穴重链融合的4+1抗4-1bb，抗cea(431/26)构建物的碱基对和氨基酸序列可分别见表46。a-ceavl与fc节重链融合且vh与fc穴重链融合的4+1抗4-1bb，抗cea(431/26)构建物的碱基对和氨基酸序列可分别见表47。表46：双特异性，四价抗4-1bb/单价抗cea(431/26)人igg1p329glala抗原结合分子(a-ceavl与fc穴链融合且vh与fc节链融合的构建物，称作穴-vl)的序列表47：双特异性，四价抗4-1bb/单价抗cea(431/26)人igg1p329glala抗原结合分子(a-ceavh与fc穴链融合且vl与fc节链融合的构建物，称作穴-vh)的序列实施例8：具有对4-1bb的二价结合和对cd19的单价结合的双特异性抗原结合分子的制备，纯化和表征8.1具有对4-1bb的二价结合和对cd19的单价结合的双特异性抗体的生成制备具有对4-1bb的二价结合和对cd19的单价结合的双特异性激动性4-1bb抗体，也称作2+1，如图1a和1b中描绘的。通过在第一重链hc1(fc节重链)中引入s354c/t366w突变和在第二重链hc2(fc穴重链)中引入y349c/t366s/l368a/y407v突变来应用节入穴技术以容许生成异二聚体。在这个实施例中，构建物的第一重链hc1由下述构件构成：抗4-1bb结合物(克隆20h4.9)的vhch1，继以fc穴，在其c端融合抗cd19结合物(克隆2b11或8b8-018)的vl或vh。第二重链hc2构成如下：抗4-1bb的vhch1，继以fc节，在其c端分别融合抗cd19结合物(克隆2b11或8b8-018)的vh或vl。cd19结合物克隆2b11或8b8-018的生成和制备记载于wo2016/075278a2，通过援引将其收入本文。对于4-1bb结合物，依照us7,288,638b2或us7,659,384b2获得克隆20h4.9的vh和vl序列。两条重链的组合容许生成包括一个cd19结合模块和两个4-1bb结合fab的异二聚体(如1a和1b)。依照国际专利申请公开文本no.wo2012/130831a1中描述的方法，已经在节和穴重链的恒定区中引入pro329gly，leu234ala和leu235ala突变以消除对fcγ受体的结合。a-cd19(2b11)vh与节融合且vl与穴链融合的2+1抗4-1bb，抗cd19构建物的氨基酸序列可分别见表48。a-cd19vl与节融合且vh与穴链融合的2+1抗4-1bb，抗cd19(2b11)构建物的氨基酸序列可分别见表49。表48：双特异性，二价抗4-1bb/单价抗cd19(2b11)人igg1p329glala抗原结合分子(a-cd19vl与fc穴链融合且vh与fc节链融合的构建物，也称作穴-vl)的序列表49：双特异性，二价抗4-1bb/单价抗cd19(2b11)人igg1p329glala抗原结合分子(a-cd19vh与fc穴链融合且vl与fc节链融合的构建物，称作穴-vh)的序列a-cd19(8b8-018)vh与节融合且vl与穴链融合的2+1抗4-1bb，抗cd19构建物的氨基酸序列可分别见表50。a-cd19vl与节融合且vh与穴链融合的2+1抗4-1bb，抗cd19(8b8-018)构建物的氨基酸序列可分别见表51。表50：双特异性，二价抗4-1bb/单价抗cd19(8b8-018)人igg1p329glala抗原结合分子(a-cd19vl与fc穴链融合且vh与fc节链融合的构建物，也称作穴-vl)的序列表51：双特异性，二价抗4-1bb/单价抗cd19(8b8-018)人igg1p329glala抗原结合分子(a-cd19vh与fc穴链融合且vl与fc节链融合的构建物，称作穴-vh)的序列通过使用聚乙烯亚胺用哺乳动物表达载体共转染hek293-ebna细胞来生成双特异性2+1抗4-1bb抗cd19huigg1p329glala。以1:1:1比(“载体节重链”:“载体轻链”:“载体穴重链”)用相应的表达载体转染细胞。为了500ml摇瓶中的生成，在转染前24小时接种400x106个hek293ebna细胞。为了转染，将细胞以210g离心5分钟，并用预温热的cdcho培养基替换上清液。在20mlcdcho培养基中混合表达载体至200μgdna的最终量。添加540μlpei后，将溶液漩涡震荡15秒并于室温温育10分钟。之后，将细胞与dna/pei溶液混合，转移至500ml摇瓶并在具有5％co2气氛的温箱中于37℃温育3小时。温育后，添加160mlf17培养基并将细胞培养24小时。转染后1天，添加1mm丙戊酸和7％补料。培养7天后，通过以210xg离心15分钟来收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，补充叠氮化钠至0.01％(w/v)的终浓度，并于4℃保持。通过使用蛋白a的亲和层析，继以大小排阻层析自细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质。为了亲和层析，在用40ml20mm磷酸钠，20mm柠檬酸钠ph7.5平衡的蛋白amabselectsure柱(cv＝5ml，gehealthcare)上加载上清液。通过用至少10个柱体积的含有20mm磷酸钠，20mm柠檬酸钠的缓冲液(ph7.5)清洗来去除未结合的蛋白质。使用在15个柱体积的20mm柠檬酸钠，100mm氯化钠，100mm甘氨酸，ph3.0上创建的氯化钠的线性ph梯度(20至100mm)洗脱结合的蛋白质。然后用10个柱体积的20mm柠檬酸钠，100mm氯化钠，100mm甘氨酸，ph3.0清洗柱。通过添加1/40(v/v)2mtris，ph8.0来调节收集的级分的ph。浓缩并过滤蛋白质，之后在用20mm组氨酸，140mm氯化钠，ph6.0平衡的hiloadsuperdex16/600s200柱(gehealthcare)上加载。使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过以280nm测量od来测定经过纯化的双特异性构建物的蛋白质浓度。使用labchipgxii(caliper)通过还原剂(invitrogen，usa)存在和缺失下的ce-sds来分析双特异性构建物的纯度和分子量。于25℃使用在25mmk2hpo4，125mmnacl，200mm单盐酸l-精氨酸，0.02％(w/v)nan3，ph6.7运行缓冲液中平衡的tskgelg3000swxl分析性大小排阻柱(tosoh)分析双特异性构建物的聚集体含量。表52：具有对4-1bb的二价结合和对cd19的单价结合的双特异性抗原结合分子(2+1抗4-1bb，抗cd19(2b11)人igg1p329glala和2+1抗4-1bb，抗cd19(8b8-018)人igg1p329glala)的生化分析实施例9：具有对4-1bb的四价结合和对cd19的单价结合的双特异性抗体的制备，纯化和表征9.1具有对4-1bb的四价结合和对cd19的单价结合的双特异性抗体的生成制备具有对4-1bb的四价结合和对cd19的单价结合的双特异性激动性4-1bb抗体，也称作4+1，如图4a和4b中描绘的。通过在第一重链hc1(fc节重链)中引入s354c/t366w突变和在第二重链hc2(fc穴重链)中引入y349c/t366s/l368a/y407v突变来应用节入穴技术以容许生成异二聚体。在这个实施例中，构建物的第一重链hc1由下述构件构成：抗4-1bb结合物(克隆20h4.9)的vhch1_vhch1，继以fc穴，在其c端融合抗cd19结合物(克隆2b11或8b8-018)的vl或vh。第二重链hc2构成如下：抗4-1bb结合物(克隆20h4.9)的vhch1_vhch1，继以fc节，在其c端分别融合抗cd19结合物(克隆2b11或8b8-018)的vh或vl。cd19结合物克隆2b11或8b8-018的生成和制备记载于wo2016/075278a1，通过援引将其收入本文。对于4-1bb结合物，依照us7,288,638b2或us7,659,384b2获得克隆20h4.9的vh和vl序列。两条重链的组合容许生成包括一个cd19结合模块和四个4-1bb结合fab的异二聚体。依照国际专利申请公开文本no.wo2012/130831a1中描述的方法，已经在节和穴重链的恒定区中引入pro329gly，leu234ala和leu235ala突变以消除对fcγ受体的结合。通过使用聚乙烯亚胺用哺乳动物表达载体共转染hek293-ebna细胞来生成双特异性4+1抗4-1bb抗cd19huigg1p329glala抗原结合分子。以1:1:1比(“载体节重链”:“载体轻链”:“载体穴重链”)用相应的表达载体转染细胞。如关于双特异性二价抗4-1bb和抗cd19huigg1p329glala所述(见实施例8.1)生成和纯化抗原结合分子。a-cd19vh与fc节重链融合且vl与fc穴重链融合的4+1抗4-1bb，抗cd19(2b11)构建物的氨基酸序列可分别见表53。a-cd19vl与fc节重链融合且vh与fc穴重链融合的4+1抗4-1bb，抗cd19(2b11)构建物的氨基酸序列可分别见表54。表53：双特异性，四价抗4-1bb/单价抗cd19人igg1p329glala抗原结合分子(a-cd19vl与fc穴链融合且vh与fc节链融合的4+1构建物，称作穴-vl)的序列表54：双特异性，四价抗4-1bb/单价抗cd19(2b11)人igg1p329glala抗原结合分子(a-cd19vh与fc穴链融合且vl与fc节链融合的构建物，称作穴-vh)的序列a-cd19vh与fc节重链融合且vl与fc穴重链融合的4+1抗4-1bb，抗cd19(8b8-018)构建物的氨基酸序列可分别见表55。a-cd19vl与fc节重链融合且vh与fc穴重链融合的4+1抗4-1bb，抗cd19(8b8-018)构建物的氨基酸序列可分别见表56。表55：双特异性，四价抗4-1bb/单价抗cd19人igg1p329glala抗原结合分子(a-cd19(8b8-018)vl与fc穴链融合且vh与fc节链融合的4+1构建物，称作穴-vl)的序列表56：双特异性，四价抗4-1bb/单价抗cd19(8b8-018)人igg1p329glala抗原结合分子(a-cd19vh与fc穴链融合且vl与fc节链融合的构建物，称作穴-vh)的序列实施例10：结合4-1bb和cd19的双特异性抗原结合分子的功能性表征10.1对cd19的结合在原代人b细胞或cd19阳性肿瘤细胞系(wsu-dlcl2细胞，dsmzno.acc575)上测量双特异性，二价抗4-1bb/单价抗cd19抗体(称作4-1bbxcd19)对cd19的结合特性。简言之，自来自健康供体的血沉棕黄层纯化总pbmc。将在dpbs(gibcobylifetechnologies，目录号14190326)中重悬浮的细胞添加至圆底悬浮细胞96孔板(greinerbio-one，cellstar，目录号650185)的每个孔。将细胞用200μldpbs清洗一次。在100μl/孔4℃冷的含有1:5000稀释的可固定存活力染料efluor660(ebioscience，目录号65-0864-18)的dpbs缓冲液中重悬浮细胞并将板于4℃温育30分钟。将细胞用200μl/孔4℃冷的dpbs缓冲液清洗一次并在50μl/孔4℃冷的以一系列浓度含有构建物4-1bb(20h4.9)xcd19(2b11)2+1，4-1bb(20h4.9)xcd19(8b8-018)2+1(二者的结构均在图16a中显示)，cd19(2b11)x4-1bbl(图16b，记载于wo2016/075278a1)和dp-47x4-1bbl(图16c，记载于wo2016/075278a1)的facs缓冲液(供应有2％fbs，5mmedtaph8(amresco，目录号e177)和7.5mm叠氮化钠(sigma-aldrichs2002)的dpbs)中重悬浮，继以于4℃温育1小时。广泛清洗后，将细胞进一步用50μl/孔4℃冷的含有5μg/mlpe缀合的affinipure抗人iggf(ab`)2片段特异性山羊f(ab`)2片段(jacksonimmunoresearch，目录号109116098)的facs缓冲液，并用apc-h7缀合的cd20ab(bd，目录号560734)，和apc缀合的抗cd3ab(biolegend，目录号300312)，和/或fitc缀合的抗cd19抗体(bd)于4℃染色30分钟。将细胞用200μl/孔4℃facs缓冲液清洗两次并在50μl/孔含有1％甲醛(sigma，ht501320-9.5l)的dpbs中固定细胞。在100μl/孔facs缓冲液中重悬浮细胞并使用facslsrii(bdbiosciences)获取。使用flowjov10(flowjo，llc)和graphpadprism6.04(graphpadsoftware，inc)分析数据。在cd3-cd20+活的群体上对细胞控门，并将pe缀合的affinipure抗人iggiggfcγ片段特异性山羊f(ab`)2片段的荧光强度的几何均值针对构建物的滴定浓度绘图。如图17a和17b中显示的，4-1bb(20h4.9)xcd19(2b11)以与cd19(2b11)x4-1bbl相比更低的亲和力以剂量依赖性方式结合人b细胞，而非靶向性dp47x4-1bbl并不结合b细胞(图17a)。类似地，4-1bb(20h4.9)xcd19(2b11)构建物以与原代b细胞相似的方式结合cd19+wsu肿瘤细胞(图17b)。4-1bb(20h4.9)xcd19(8b8-018)显示与4-1bb(20h4.9)xcd19(2b11)相比相同的结合特性。在表57中列出cd19+肿瘤结合曲线的ec50值。表57：对cd19+肿瘤细胞的结合曲线的ec50值10.2对激活的t细胞上的4-1bb的结合为了检查4-1bbxcd19对4-1bb表达性t细胞的结合，将人pbmc通过tcr刺激(以上调t细胞上的4-1bb)预激活48小时。将纯化的pbmc稀释至2.8x106/ml的浓度，在rpmi培养基(gibco，目录号72400-054)+10％fbs(gibco，目录号20012-068)和1％青霉素-链霉素(gibco，目录号15070-063)和50μm2-巯基乙醇(gibco，目录号31350-010)中重悬浮。将90μl细胞添加至圆底96孔板(greinerbio-one，cellstar，目录号650185)的每个孔。然后以8x105个珠/ml将另外50μl抗cd3和抗cd28微珠(lifetechnologies，目录号11131d)添加至孔。2天后，将细胞用冷的pbs(gibco，20012-068)清洗一次，并用90μl冷的pbs重悬浮，并与10μl含有构建物(4-1bb(20h4.9)xcd19(2b11)，4-1bb(20h4.9)xcd19(018)和cd19(2b11)x4-1bbl)的溶液一起于4℃温育1小时。广泛清洗后，将细胞进一步用50μl/孔冷的含有5μg/mlpe缀合的affinipure抗人iggf(ab`)2片段特异性山羊f(ab`)2片段(jacksonimmunoresearch，目录号109116098)的facs缓冲液，和另外用抗人cd3(biolegend，目录号300312)，cd4(biolegend，目录号317434)和cd8(biolegend，目录号344710)ab于4℃染色30分钟。将细胞用200μl/孔4℃facs缓冲液清洗两次并在50μl/孔含有1％甲醛(sigma，ht501320-9.5l)的dpbs中固定细胞。在100μl/孔facs缓冲液中重悬浮细胞并使用facslsrii(bdbiosciences)获取。使用flowjov10(flowjo，llc)和graphpadprism6.04(graphpadsoftware，inc)分析数据。在纯的cd4和cd8细胞群体上对特异性结合控门。4-1bb(20h4.9)xcd19(2b11)以剂量依赖性方式但与cd19(2b11)-4-1bbl相比略微更低的亲和力显示卓越的对4-1bb表达性cd4或cd8t细胞的结合(图18a和18b)。4-1bb(20h4.9)xcd19(018)显示与4-1bb(20h4.9)xcd19(2b11)相比相同的结合特性。在表58中列出cd4+或cd8+t细胞结合曲线的ec50值。表58：对cd4+或cd8+肿瘤细胞的结合曲线的ec50值10.34-1bbxcd19显示生物学活性为了测量在生理背景中的生物学活性，使用激活的人pbmc通过共刺激t细胞和nk细胞来检查效应器功能分子ifnγ的释放。简言之，以一系列浓度将与构建物(4-1bb(20h4.9)xcd19(2b11)，4-1bb(20h4.9)xcd19(018)，cd19(2b11)x4-1bbl和dp-47x4-1bbl)共培养的纯化的pbmc添加至孔，和8x105个珠/ml的另外50μl抗cd3和抗cd28微珠(lifetechnologies，目录号11131d)。温育48小时后，收集上清液用于通过elisa(duoset人ifngelisa试剂盒，r&dsystems，目录号dy285)测量ifn-γ。图19显示4-1bb(20h4.9)xcd19(2b11)和cd19(2b11)x4-1bbl构建物均以剂量依赖性方式刺激pbmc生成相似量的ifnγ，而非靶向性dp47x4-1bbl(阴性对照)由于缺乏交联并不激活t或nk细胞。4-1bb(20h4.9)xcd19(018)显示与4-1bb(20h4.9)xcd19(2b11)相似的生物学活性。在表59中列出ifn-γ生成的ec50值。表59：ifn-γ生成的ec50值序列表<110>豪夫迈·罗氏有限公司（f.hoffmann-larocheag）<120>包含抗4-1bb克隆20h4.9的双特异性抗原结合分子<130>p34053-wo<150>ep17164224.2<151>2017-03-31<150>ep17150150.5<151>2017-01-03<160>217<170>patentinversion3.5<210>1<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>4-1bb(20h4.9)cdr-h1<400>1glytyrtyrtrpser15<210>2<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>4-1bb(20h4.9)cdr-h2<400>2gluileasnhisglyglytyrvalthrtyrasnproserleugluser151015<210>3<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>4-1bb(20h4.9)cdr-h3<400>3asptyrglyproglyasntyrasptrptyrpheaspleu1510<210>4<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223>4-1bb(20h4.9)cdr-l1<400>4argalaserglnservalsersertyrleuala1510<210>5<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>4-1bb(20h4.9)cdr-l2<400>5aspalaserasnargalathr15<210>6<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223>4-1bb(20h4.9)cdr-l3<400>6glnglnargserasntrpproproalaleuthr1510<210>7<211>121<212>prt<213>人工序列<220><223>4-1bb(20h4.9)vh<400>7glnvalglnleuglnglntrpglyalaglyleuleulysproserglu151015thrleuserleuthrcysalavaltyrglyglyserpheserglytyr202530tyrtrpsertrpileargglnserproglulysglyleuglutrpile354045glygluileasnhisglyglytyrvalthrtyrasnproserleuglu505560serargvalthrileservalaspthrserlysasnglnpheserleu65707580lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala859095argasptyrglyproglyasntyrasptrptyrpheaspleutrpgly100105110argglythrleuvalthrvalserser115120<210>8<211>109<212>prt<213>人工序列<220><223>4-1bb(20h4.9)vl<400>8gluilevalleuthrglnserproalathrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysargalaserglnservalsersertyr202530leualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleuile354045tyraspalaserasnargalathrglyileproalaargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglupro65707580gluaspphealavaltyrtyrcysglnglnargserasntrppropro859095alaleuthrpheglyglyglythrlysvalgluilelys100105<210>9<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(28h1)cdr-h1<400>9serhisalametser15<210>10<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(28h1)cdr-h2<400>10alailetrpalaserglygluglntyrtyralaaspservallysgly151015<210>11<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(28h1)cdr-h3<400>11glytrpleuglyasnpheasptyr15<210>12<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(28h1)cdr-l1<400>12argalaserglnservalserargsertyrleuala1510<210>13<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(28h1)cdr-l2<400>13glyalaserthrargalathr15<210>14<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(28h1)cdr-l3<400>14glnglnglyglnvalileproprothr15<210>15<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(4b9)cdr-h1<400>15sertyralametser15<210>16<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(4b9)cdr-h2<400>16alaileileglyserglyalaserthrtyrtyralaaspservallys151015gly<210>17<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(4b9)cdr-h3<400>17glytrppheglyglypheasntyr15<210>18<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(4b9)cdr-l1<400>18argalaserglnservalthrsersertyrleuala1510<210>19<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(4b9)cdr-l2<400>19valglyserargargalathr15<210>20<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(4b9)cdr-l3<400>20glnglnglyilemetleuproprothr15<210>21<211>116<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(28h1)vh<400>21gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserserhis202530alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045seralailetrpalaserglygluglntyrtyralaaspservallys505560glyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyrleu65707580glnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysala859095lysglytrpleuglyasnpheasptyrtrpglyglnglythrleuval100105110thrvalserser115<210>22<211>108<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(28h1)vl<400>22gluilevalleuthrglnserproglythrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysargalaserglnservalserargser202530tyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleu354045ileileglyalaserthrargalathrglyileproaspargpheser505560glyserglyserglythraspphethrleuthrileserargleuglu65707580progluaspphealavaltyrtyrcysglnglnglyglnvalilepro859095prothrpheglyglnglythrlysvalgluilelys100105<210>23<211>117<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(4b9)vh<400>23gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr202530alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045seralaileileglyserglyalaserthrtyrtyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alalysglytrppheglyglypheasntyrtrpglyglnglythrleu100105110valthrvalserser115<210>24<211>108<212>prt<213>人工序列<220><223>fap(4b9)vl<400>24gluilevalleuthrglnserproglythrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysargalaserglnservalthrserser202530tyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleu354045ileasnvalglyserargargalathrglyileproaspargpheser505560glyserglyserglythraspphethrleuthrileserargleuglu65707580progluaspphealavaltyrtyrcysglnglnglyilemetleupro859095prothrpheglyglnglythrlysvalgluilelys100105<210>25<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>cea(t84.66-lcha)-cdr-h1<400>25aspthrtyrmethis15<210>26<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>cea(t84.66-lcha)-cdr-h2<400>26argileaspproalaasnglyasnserlystyrvalprolysphegln151015gly<210>27<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>cea(t84.66-lcha)-cdr-h3<400>27pheglytyrtyrvalserasptyralametalatyr1510<210>28<211>15<212>prt<213>人工序列<220><223>cea(t84.66-lcha)-cdr-l1<400>28argalaglygluservalaspilepheglyvalglypheleuhis151015<210>29<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>cea(t84.66-lcha)-cdr-l2<400>29argalaserasnargalathr15<210>30<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>cea(t84.66-lcha)-cdr-l3<400>30glnglnthrasngluaspprotyrthr15<210>31<211>121<212>prt<213>人工序列<220><223>cea(t84.66-lcha)vh<400>31glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyser151015servallysvalsercyslysalaserglypheasnilelysaspthr202530tyrmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet354045glyargileaspproalaasnglyasnserlystyrvalprolysphe505560glnglyargvalthrilethralaaspthrserthrserthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alapropheglytyrtyrvalserasptyralametalatyrtrpgly100105110glnglythrleuvalthrvalserser115120<210>32<211>111<212>prt<213>人工序列<220><223>cea(t84.66-lcha)vl<400>32gluilevalleuthrglnserproalathrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysargalaglygluservalaspilephe202530glyvalglypheleuhistrptyrglnglnlysproglyglnalapro354045argleuleuiletyrargalaserasnargalathrglyileproala505560argpheserglyserglyserglythraspphethrleuthrileser65707580serleugluprogluaspphealavaltyrtyrcysglnglnthrasn859095gluaspprotyrthrpheglyglnglythrlysleugluilelys100105110<210>33<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>cea(a5b7)-cdr-h1<400>33sertyrtrpmethis15<210>34<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>cea(a5b7)-cdr-h2<400>34pheileargasnlysalaasnglyglythrthrglutyralaalaser151015<210>35<211>10<212>prt<213>人工序列<220><223>cea(a5b7)-cdr-h3<400>35aspargglyleuargphetyrpheasptyr1510<210>36<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>cea(a5b7)-cdr-l1<400>36thrleuargargglyileasnvalglyalatyrseriletyr1510<210>37<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223>cea(a5b7)-cdr-l2<400>37tyrlysseraspserasplysglnglnglyser1510<210>38<211>10<212>prt<213>人工序列<220><223>cea(a5b7)-cdr-l3<400>38metiletrphisserglyalaseralaval1510<210>39<211>121<212>prt<213>人工序列<220><223>cea(a5b7)vh<400>39gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglyarg151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrvalsersertyr202530trpmethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045glypheileargasnlysalaasnglyglythrthrglutyralaala505560servallysglyargphethrileserargaspaspserlysasnthr65707580leutyrleuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyr859095tyrcysalaargaspargglyleuargphetyrpheasptyrtrpgly100105110glnglythrthrvalthrvalserser115120<210>40<211>116<212>prt<213>人工序列<220><223>cea(a5b7)vl<400>40glnalavalleuthrglnproalaserleuseralaserproglyala151015seralaserleuthrcysthrleuargargglyileasnvalglyala202530tyrseriletyrtrptyrglnglnlysproglyserproproglntyr354045leuleuargtyrlysseraspserasplysglnglnglyserglyval505560serserargpheseralaserlysaspalaseralaasnalaglyile65707580leuleuileserglyleuglnsergluaspglualaasptyrtyrcys859095metiletrphisserglyalaseralavalpheglyglyglythrlys100105110leuthrvalleu115<210>41<211>1734<212>dna<213>人工序列<220><223>vhch1(20h4.9)-重链穴-vl(4b9)(核苷酸序列)<400>41caggtgcagctgcagcagtggggagccggactgctgaagcctagcgagacactgagcctg60acctgcgccgtgtacggcggcagcttcagcggctactactggtcctggatcagacagagc120cccgagaagggcctggaatggatcggcgagatcaaccacggcggctacgtgacctacaac180cccagcctggaaagcagagtgaccatcagcgtggacaccagcaagaaccagttcagcctg240aagctgagcagcgtgacagccgccgacacagccgtgtactactgcgccagagattacggc300cctggcaactacgactggtacttcgacctgtggggcagaggcaccctcgtgaccgtgtct360agcgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctct420gggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtg480tcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcc540tcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccag600acctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgag660cccaaatcttgtgacaaaactcac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