5-甲基-（6S）-四氢叶酸的结晶钠盐的制作方法

本发明涉及5-甲基-(6s)-四氢叶酸((n-[4-[[(2-氨基-1,4,5,6,7,8-六氢-5-甲基-4-氧代-(6s)-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]-l-谷氨酸，本文缩写为mthf)的结晶钠盐，以及其获得方法。四氢叶酸主要作为5-甲酰基四氢叶酸及其盐(亚叶酸和左亚叶酸)，作为5-甲基四氢叶酸及其盐或作为5,10-亚甲基四氢叶酸及其盐用于治疗巨幼红细胞叶酸贫血症，用作解毒剂用于增加叶酸拮抗剂，特别是氨蝶呤和甲氨蝶呤在癌症治疗(“抗叶酸救治”)中的相容性，用于增加氟化嘧啶的治疗效果和用于治疗自身免疫疾病，如牛皮癣和类风湿性关节炎，用于增加针对突变的某些抗寄生虫剂(例如甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲唑)的相容性，以及用于降低二脱氮杂四氢叶酸(dideazatetrahydrofolate)在化疗中的毒性。5-甲基四氢叶酸特别用作药物和食品添加剂，用作维生素制剂，用于预防神经管缺陷，用于治疗抑郁症，以及用于影响同型半胱氨酸水平。5-甲基四氢叶酸及其盐非常不稳定，特别是对氧化非常敏感[这方面也参见a.l.fitzhugh,pteridines4(4),187-191(1993)]，因此难以以药物活性成分或食品添加剂可接受的纯度水平生产。为了克服5-甲基四氢叶酸的不稳定性，已采用各种方法，例如尽可能完全排除氧或加入抗氧化剂如抗坏血酸或还原的l-谷胱甘肽。us6,441,168b1公开了碱土金属盐，特别是钙盐的用途，其作为5-甲基四氢叶酸的盐使用，公开了其结晶和用途。5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钙盐以四种不同的结晶变体存在。5-甲基-(6s)-四氢叶酸的钙盐的缺点在于它们以四种变体存在，因为必须非常精确地控制每种变体的制造方法。另外，所述5-甲基-(6s)-四氢叶酸的钙盐在水中的溶解度相对较差，可能导致生物利用度降低和对其适用的使用形式的限制。此外，当需要溶解这样的化合物用于进一步加工(例如通过重结晶纯化)时，低溶解度导致低的时间-体积收率。另外，us6,441,168b1的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶盐也具有每当量5-甲基四氢叶酸至少1当量的结晶水。药学上有用的化合物的新的晶体形式提供了改进药物产品性能特性的机会。它扩大了配方科学家可用于设计具有改进特性的药物的新剂型的材料储库。本发明的潜在技术问题是提供包含5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶形式，其克服了本领域已知的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钙盐的缺点。另外，新的结晶形式通常显示出所需的不同物理和/或生物学特性，这可能有助于活性化合物的制造或配制，达到监管批准所需的纯度水平和均匀性。该技术问题通过5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐和/或其水合物和/或溶剂化物得以解决，其中5-甲基-(6s)-四氢叶酸与钠的摩尔比为1：1.51至1：2.5。本发明的固体形式具有改进的药理学特性，例如，改进的生物利用度，因此提供了调节和设计改进的药物产品的增强的可能性。另外，本发明的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐显示出相对于本领域已知的5-甲基-(6s)-四氢叶酸及其相应的盐的增加的溶解度，尤其是增加的动力学溶解度。本发明的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐的增加的溶解度，尤其是增加的动力学溶解度可导致不同的加工参数，例如，更短的溶解时间，和因此减少的对产品和/或最终的甚至其他应用形式(例如快速溶解的粉末)的氧化应激。优选地，结晶盐和/或其水合物和/或溶剂化物具有的5-甲基-(6s)-四氢叶酸与钠的摩尔比为1：1.75至1：2.25。在另一种优选的实施方案中，5-甲基-(6s)-四氢叶酸与钠的摩尔比约为1：2。优选地，5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐是5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶二钠盐。优选地，本发明的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐具有在3.2，6.4，7.8，9.6，12.7，13.3，13.9，14.2，14.7，15.6，16.3，16.7，17.2，17.8，18.2，18.5，19.3，19.6和20.3处具有至少一个特征峰(以2θ±0.3°2θ表示(cukα辐射))的pxrd图。甚至更优选地，本发明的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐具有在3.2，6.4，7.8，9.6，12.7，13.3，13.9，14.2，14.7，15.6，16.3，16.7，17.2，17.8，18.2，18.5，19.3，19.6和20.3处具有至少2个，甚至更优选至少3个，最优选至少4个，优选至少5个，更优选至少6个特征峰(以2θ±0.3°2θ表示(cukα辐射))的pxrd图。优选地，本发明的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐具有在3.2，6.4，7.8，9.6，12.7，13.3，13.9，14.2，14.7，15.6，16.3，16.7，17.2，17.8，18.2，18.5，19.3，19.6，20.0，20.3，20.7，21.5，22.0，22.9，23.5，24.0，24.6，25.0，25.4，27.2和28.7处具有至少一个特征峰(以2θ±0.3°2θ表示(cukα辐射))的pxrd图。甚至更优选地，本发明的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐具有在3.2，6.4，7.8，9.6，12.7，13.3，13.9，14.2，14.7，15.6，16.3，16.7，17.2，17.8，18.2，18.5，19.3，19.6，20.0，20.3，20.7，21.5，22.0，22.9，23.5，24.0，24.6，25.0，25.4，27.2和28.7处具有至少2个，甚至更优选至少3个，最优选至少4个，优选至少5个，更优选至少6个特征峰(以2θ±0.3°2θ表示(cukα辐射))的pxrd图。优选地，本发明的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的钠盐具有基本上如图1、图2和/或图4中所示的pxrd图。本发明的另一方面是5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐，其具有在3055，2929，1611，1582，1536，1483，1462，1418，1381，1329，1311，1276，1192，1021，949，875，835，776，651，621，479和363cm-1处具有至少一个特征峰(以波数cm-1表示，实验不确定度为±1-2cm-1)的拉曼光谱。本发明的又一方面是根据本发明的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐显示出基本上如图3所示的拉曼光谱。本发明的另一方面是获得根据本发明的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐的方法，包括以下步骤：a)提供5-甲基-(6s)-四氢叶酸，任选地在合适的溶剂或溶剂混合物中提供；b)向步骤a)的组合物中加入氢氧化钠；c)任选地将溶剂、溶剂混合物和/或共盐形成剂加入到步骤b)的组合物中，或将步骤b)的组合物加入到溶剂、溶剂混合物和/或共盐形成剂中；d)结晶；e)任选地加入更多溶剂或溶剂混合物；和f)分离所得固体。优选地，步骤b)中5-甲基-(6s)-四氢叶酸与氢氧化钠的摩尔比为1：1.9至1：3。优选地，根据步骤a)、c)和/或e)的溶剂和/或溶剂混合物选自水、水溶性醇、甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、乙腈、四氢呋喃、丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、苯甲醇及其混合物。如本文所用的共盐形成剂是促进根据本发明的结晶钠盐形成的化学物质。根据本发明的共盐形成剂通常是有机碱，其在方法溶剂中充分可溶，使得它们在过滤步骤中被除去或者在过滤后可以容易地洗掉。优选地，步骤c)中的共盐形成剂是pka值为6至11，甚至更优选pka值为7至10的有机碱。甚至更优选地，在步骤d)中温度为至少15℃。优选地，在步骤a)、b)、c)和/或d)中加入晶种。甚至更优选地，晶种是所需的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的钠盐。本发明的另一方面是药物组合物、食品添加剂、维生素和/或其他制剂，其包含根据本发明的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐和任选的一种或多种可接受的赋形剂，和根据本发明的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐作为生产药物和/或食品添加剂的组分的用途。本发明的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐用于同型半胱氨酸降低，治疗贫血症，神经管缺陷，心血管疾病，抑郁症，阿尔茨海默症，认知障碍和骨质疏松症，和/或低血浆和/或低红细胞叶酸和/或低脑脊液叶酸和/或低外周或中枢神经系统叶酸的饮食管理也是本发明的一部分。令人惊奇的是，与us6,441,168b1中公开的结晶钙盐相比，本发明的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐具有改进的动力学溶解度。如实验部分所述进行动力学溶解度的测量。本发明的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐在水(室温)中的溶解度大于100mg/1ml水，而钙盐表现出的溶解度显著小于10mg/1ml水。由于本发明的钠盐的较高的溶解度，因此生物利用度要好得多。这导致这样的口服剂型，其中活性成分的量可以减少，而不会降低药物或食品添加剂的有效性。根据本发明的药物组合物可以应用于所有给药方式，优选用于口服、肠胃外、肌内、脊柱内、鞘内、牙周、局部或直肠给药。综上所述，本发明的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐提供的性质特征有利于用于药剂或用作食品添加剂。实验粉末x射线衍射配备有mythen1k检测器的stoestadip；cu-kα1辐射；标准测量条件：透射；40kv和40ma管电源；弯曲ge单色器；0.02°2θ步长，48s步进时间，1.5-50.5°2θ扫描范围；探测器模式：步进扫描；1°2θ检测器步进；标准样品制备：将10至20mg样品置于两个乙酸酯箔之间；样品架：stoe透射样品架；在测量期间旋转样品。所有样品制备和测量均在环境空气气氛中进行。拉曼光谱在brukermultiramft-raman或brukerrfs100ft-raman系统(具有在1064nm下操作的近红外nd：yag激光器和液氮冷却的锗检测器)上记录ft-拉曼光谱。分辨率为2cm-1的64次扫描累积在3500至-50cm-1的范围内；然而，由于滤波器截止效应，仅评价高于100cm-1的数据。标称激光功率通常为100或300mw。tg-ftir用连接到brukerftir光谱仪vector22的netzschthermo-microbalancetg209(具有针孔的样品盘，n2气氛，加热速率10k/min)进行热重测量。实施例1：由5-甲基-(6s)-四氢叶酸的无定形二钠盐制备的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐(用5-甲基-(6s)-四氢叶酸的钙盐作为晶种结晶)。将250.9mg无定形5-甲基-(6s)-四氢叶酸二钠盐称重到装有磁力搅拌棒的22mlsupelco玻璃小瓶中。加入2.0ml乙醇。将样品超声处理1分钟并在室温下搅拌12分钟。用氮气(约100ml/min)吹扫小瓶的气相1分钟。然后将样品在80℃下搅拌10分钟。加入3.0ml乙醇(总共5.0ml乙醇)并加入0.5ml水(水活度约0.50)。将样品在室温下超声处理约10秒并再次在80℃下搅拌5分钟。将样品用约1mg5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钙盐作为晶种结晶，并在80℃下搅拌3分钟。形成灰白色悬浮液，用刮刀刮下粘附在小瓶玻璃壁上的固体材料，形成黄色悬浮液。将悬浮液在80℃下搅拌约17分钟，并使用刮刀再次从玻璃壁上刮下固体材料。悬浮液易于搅拌。向橙色悬浮液中加入3.0ml乙腈，然后将悬浮液在80℃下搅拌30分钟。进行热过滤。使用多孔玻璃过滤器(孔隙率p4，)过滤悬浮液，并将滤饼风干3分钟。然后将滤饼转移到称重纸中，并在约40％的相对湿度下进一步风干约12分钟。固体产物是178mg细黄色粉末。通过光学显微镜和pxrd表征证实了固体的结晶性质。h-nmr光谱证实了5-甲基-(6s)-四氢叶酸的化学完整性。固体产物显示如图1中所示的pxrd图，其峰位置如表1中所列。通过拉曼光谱进一步检测显示样品表现出如图3中所示的拉曼光谱，其峰位置如表2中所示。表1：实施例1的结晶钠盐的粉末x射线衍射数据：2θ角，d-间距值(以为单位)和定性强度值如下：vs＝非常强，s＝强，m＝中等，w＝弱和vw＝非常弱。表2：实施例1的结晶钠盐的拉曼数据：波数(以cm-1为单位)和强度值。应注意，强度随激光功率、样品量和其他因素而变化。波数(cm-1)强度(任意单位)30550.1529290.3216111.7815820.4915360.4414830.3014620.3214180.2213810.1913290.4413110.4812760.4011920.2410210.159490.148750.288350.147760.156510.556210.244790.173630.15实施例2：由5-甲基-(6s)-四氢叶酸的无定形二钠盐制备的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐(用5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶单钠盐作为晶种结晶)。将1.2055g无定形5-甲基-(6s)-四氢叶酸二钠盐称重到装有磁力搅拌棒的40mlsupelco玻璃小瓶中。加入10.0ml乙醇/水10：1v/v。将悬浮液在室温下搅拌8分钟，并用12mg5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶单钠盐作为晶种结晶。将悬浮液在室温下搅拌5分钟，并用氮气(约100ml/min)吹扫小瓶的气相1分钟。加入另外的10ml乙醇/水10：1v/v(水活度约0.50)。悬浮液现在易于搅拌。将其超声处理1分钟并在室温下搅拌50分钟。悬浮液的显微镜检测显示存在无定形物质。再次用氮气(约100ml/min)吹扫小瓶的气相1分钟。然后将样品在约70℃下搅拌10分钟。将样品在约70℃下进一步搅拌10分钟，再次用5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶单钠盐作为晶种结晶，并在约70℃下搅拌8分钟。形成非常弱的悬浮液。在70℃下继续搅拌约3小时，直至形成不含粘性无定形固体作为混合物一部分的悬浮液。一旦通过光学显微镜进行的过程控制显示样品主要是结晶的，则进行热过滤。将滤饼风干15分钟。通过tg-ftir检测细的淡黄色粉末(0.8424g)。自质量损失为15.4％(水和一些乙醇)以后，将样品转移到15mlsupelco小瓶中并在室温和约10mbar下进一步干燥20分钟。得到约800mg细黄色粉末。通过光学显微镜和pxrd表征证实了固体的结晶性质。h-nmr光谱证实了5-甲基-(6s)-四氢叶酸的化学完整性。实施例3：5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐的动力学溶解度。将50mg5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐(根据实施例1)称重到带有螺帽的4ml玻璃小瓶中。然后加入0.5ml纯化/去离子水。将混合物在室温下剧烈搅拌并短暂超声处理，并且容易获得澄清的浅黄色溶液(在几秒内)。因此，溶解度大于100mg/1ml水。该溶液在室温下几个小时内保持澄清。参照实施例4：5-甲基-(6s)-四氢叶酸的钙盐的动力学溶解度将27.9mg5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钙盐(含有约11％的水，因此相当于约25mg的干重)称重到带有螺帽的4ml玻璃小瓶中。使用可调节的容量移液管将2.535ml纯化/去离子水加入到固体中。将混合物在室温下剧烈搅拌并短暂超声处理。未能获得澄清溶液，并且相当浓缩的悬浮液仍然存在。因此，如本文所述测量的动力学溶解度小于10mg/1ml水。实施例5：从5-甲基-(6s)-四氢叶酸开始制备5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶二钠盐。将10g5-甲基-(6s)-四氢叶酸(分析5-甲基四氢叶酸95.59％w/w)，20g水和1.74g氢氧化钠的混合物在玻璃容器中在氮气气氛下在搅拌的同时加热至72℃。在72℃下，在3.5小时内加入200ml乙醇/5％v/v2-丙醇。然后加入0.05g5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶二钠盐作为晶种材料。在72℃下，在3小时内加入另外的100ml乙醇/5％v/v2-丙醇。将混合物在14小时内冷却至25℃并再次加热至72℃。用超声处理混合物以除去粘在玻璃容器壁上的物质，同时温度降至63℃。在封闭的过滤管中通过氮气压力过滤分离固体，并用100ml乙醇/5％v/v2-丙醇洗涤。将固体在36℃下真空干燥14小时，得到11.03g灰白色粉末，相当于94.5％收率(分析5-甲基四氢叶酸81.86％w/w)。固体产物显示如图4所示的pxrd图。pxrd证实样品的结晶性质，并且h-nmr光谱与5-甲基-(6s)-四氢叶酸的化学完整性一致。通过tga(热重分析)进一步研究显示质量损失约6.1％。通过ic(离子色谱法)发现的钠含量为8.0％，这与二钠盐非常一致。hplc显示纯度为97.4％。参照实施例6：5-甲基-(6s)-四氢叶酸的无定形单钠盐的制备将根据ep17164349.7制备的6.0g结晶5-甲基-(6s)-四氢叶酸单钠盐在室温下加入600g水中。通过抽滤除去固体。将滤液在液氮浴中冷冻，并在0.07mbar下真空冻干。2天后，用氮气置换真空。得到6.0g无定形5-甲基-(6s)-四氢叶酸单钠盐，其纯度为95.2％面积，水含量为8.8％w/w，分析钠为4.5％w/w。实施例7：5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐的稳定性为了比较本发明化合物5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐的长期稳定性和根据参照实施例6制备的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的无定形单钠盐和根据ep1044975b1制备的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钙盐的长期稳定性，在各种温度和湿度下产生了各自的稳定性数据。(a)5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐在25℃/60％rh下的稳定性将根据参照实施例6制备的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的无定形单钠盐，根据文献程序(ep1044975b1)制备的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钙盐，和如实施例1中所公开制备的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐在25℃/60％rh下储存。通过hplc以定期间隔测量样品中剩余的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的含量(％w/w)。结果显示在表1a和图5中。还将剩余的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的含量与制备时的初始值进行比较(％rel.)。结果显示在表1b中。另外，主要降解产物4α-羟基-5-甲基-thf的吡嗪并-s-三嗪衍生物(mefox)的含量通过hplc以周期性间隔测量并以绝对值(％w/w)公开。结果显示在表2和图6中。表1a：5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐在25℃/60％rh下的长期稳定性(％w/w)表1b：5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶单钠盐在25℃/60％rh下的长期稳定性(％rel.)表2：5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐在25℃/60％rh下的长期稳定性(主要降解产物[mefox])(b)5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐在40℃/75％rh下的稳定性将根据参照实施例6制备的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的无定形单钠盐，根据文献程序(ep1044975b1)制备的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钙盐，和如实施例1中所公开制备的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐在40℃/75％rh下储存。通过hplc以周期性间隔(％w/w)测量样品中剩余的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的含量。结果显示在表3a和图7中。还将剩余的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的含量与制备时的初始值进行比较(％rel.)。结果显示在表3b中。另外，主要降解产物4α-羟基-5-甲基-thf的吡嗪并-s-三嗪衍生物(mefox)的含量通过hplc以周期性间隔测量并以绝对值(％w/w)公开。结果显示在表4和图8中。表3a：5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐在40℃/75％rh下的长期稳定性(％w/w)表3b：5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶单钠盐在40℃/75％rh下的长期稳定性(％rel.)表4：5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐在40℃/75％rh下的长期稳定性(主要降解产物[mefox])具有本发明中公开的5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐的稳定性数据的表1至4清楚地表明i)与5-甲基-(6s)-四氢叶酸的无定形单钠盐和结晶钙盐相比，5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐的稳定性存在显著差异，ii)5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钠盐在长时间内显示出与5-甲基-(6s)-四氢叶酸的结晶钙盐相当的稳定性。当前第1页12