从多能干细胞产生模拟的先天免疫细胞的方法和试剂盒与流程

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年2月7日提交的新加坡申请第10201700937p号和2017年7月6日提交的新加坡申请第10201705582s号的优先权，其内容援引加入本文。

发明领域

本发明涉及产生先天免疫细胞，优选自然杀伤细胞或γδt-细胞，的方法和试剂盒，在治疗中使用所述先天免疫细胞的方法以及产生诱导的多能干细胞的方法。

背景技术：

在2015年，约9050万人患有癌症，并且每年有约1410万新病例发生(gbd2015,lancet.388(10053)1545-1602)。常用放射疗法、手术、化疗和/或靶向疗法的一些组合治疗癌症。虽然有许多治疗可用，但是每年有880万人死于癌症，并且对新的治疗有持续的需要。

利用先天免疫细胞的癌症免疫疗法是癌症治疗的新希望(wooetal.annualreviewofimmunology33,445-474(2015))。包括自然杀伤(nk)细胞和γδt细胞在内的这些先天免疫细胞可以通过主要组织相容性复合物(mhc)依赖性机制识别广泛的癌细胞(scheper,etal.leukemia28,1181-1190(2014)。这个独特特征允许使用先天免疫细胞治疗许多受体中的癌症，没有常规的基于αβt细胞策略的mhc-限制。目前，健康供体来源的血液细胞是产生大量的先天免疫细胞的常用的细胞来源(kondo,etal.cytotherapy10,842-856(2008))。但是，由于使用可变和有限的起始材料以及复杂的物流，这些供体血液细胞依赖性平台对于集中化、标准化和大规模生产具有挑战性。

γδt-细胞(γδt细胞)是通过主要组织相容性复合物依赖性机制识别癌细胞的先天免疫细胞。这个特征允许使用供体来源的γδt细胞治疗不同患者中的癌症。γδt细胞占外周血淋巴细胞的1-10％。在这些循环γδt细胞中，vγ9vδ2t是主要子集，其通过它们的vγ9vδ2t-细胞受体(tcr)与含磷抗原(phosphoantigen)反应，从而识别感染细胞或恶性细胞。在体内发育期间，tcrg和tcrd基因的体细胞重组是γδt细胞获得它们的tcrγ链和δ链的早期关键步骤。为了从ipsc产生γδt细胞，合乎逻辑的策略是在体外分化期间准确重述tcrg和tcrd基因的体细胞重组的这个过程以产生功能性γδtcr。但是这样的策略对于目前的技术来说仍然非常困难。

自然杀伤细胞(nk细胞)是能够杀死广谱的恶性细胞和病毒感染细胞的先天免疫系统的淋巴细胞(domogala,etal.frontiersinimmunology6,264(2015))。nk细胞的靶标识别和激活取决于一系列激活受体和抑制受体，这不同于αβt细胞的mhc限制性αβt-细胞受体(tcr)依赖性机制(moretta,etal.frontiersinimmunology5,87(2014))。因此，可以使用同种异体nk细胞治疗癌症，有较少机会引起移植物抗宿主疾病(gvhd)(leung.clinicalcancerresearch:anofficialjournaloftheamericanassociationforcancerresearch20,3390-3400(2014).)。nk细胞独特的靶标识别机制显著扩展自体nk细胞以外的可以用于癌症的过继免疫疗法的潜在细胞来源。

在目前的临床试验中，需要5x10⁶-5x10⁷/kg体重的大剂量nk细胞(laptevaetal.criticalreviewsinoncogenesis19,121-132(2014))。获得这样大量的同种异体nk细胞的一个典型方法是从大体积的供体外周血富集nk细胞。从供体来源的白细胞去除术产物开始，已建立不同方案以通过t细胞和b细胞的免疫磁性消耗以及cd56+细胞的选择来制备nk细胞(koehl,etal.frontiersinoncology3,118(2013))。这类产物的纯度对于同种异体环境中的临床应用特别重要，其中残余的t细胞可以引起gvhd并阻止高剂量的输注。目前高纯度nk细胞产物的产生需要延长的过程，其不仅损害nk细胞的回收，而且还影响他们的活力和效力。回收率低，难以从单一白细胞去除术产物获得足够的nk细胞。产生nk细胞疗法的另一流行方法是nk细胞扩增，利用饲养细胞，如用膜结合分子如白介素(il)-15和4-1bb配体(k562-mb15-41bbl)修饰的k562细胞(fujisaki,etal.cancerresearch69,4010-4017(2009))。这些饲养细胞可以从外周血单个核细胞(pbmc)快速扩增nk细胞21.6-倍(fujisaki,etal.)，或者从冻存的分离产物快速扩增nk细胞70-倍(laptevaetal.)。这类nk细胞产物的纯度是约70％，此外，消耗伴随cd3+t细胞的耗时的方法对于同种异体使用是必需的(laptevaetal.)。上述两种方法对于从供体细胞产生nk细胞治疗物是可行的，但是像任何其他供体细胞依赖性制备方法一样，由于可变的起始材料，从各种供体的原代细胞产生nk细胞产物难以标准化。它需要特殊的技能和设施、复杂的物流以及高操作成本，因此不适合批量生产。

目前，健康供体来源的血液细胞是常用的细胞来源以产生大量的先天免疫细胞。但是，由于使用可变和有限的起始材料以及复杂的物流，这些供体血液细胞依赖性平台对于集中化、标准化和大规模生产具有挑战性。目前nk细胞生产策略面临的另一障碍是nk细胞表达称作杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)的克隆分布的抑制性受体(parham,2005nat.rev.immunol.5,201–214)。每种单独的kir识别称作kir配体的特异性人白细胞抗原(hla)i类分子，例如，kir2dl1结合hla-c2，kir2dl2和kir2dl3结合hla-c1，kir3dl1结合hlabw4，以及kir3dl2结合hla-a3和hla-a11(thielensetal.,2012curr.opin.immunol.24,239–245.)。kir配体结合至抑制性kir抑制nk细胞的细胞毒性。为了减轻这种对nk细胞的抑制，从而增强它们对患者癌细胞的细胞毒性，为该特定患者精心选择nk细胞供体以在抗癌方向获得kir-hla不匹配是至关重要的(thielensetal.,2012)。这个选择是基于供体kir分型和受体hla分型。如果供体中存在抑制性kir但受体中不存在kir配体，则供体是合适的(leung,2014clin.cancerres.20,3390–3400)。人免疫系统中包括两个高度多样化的基因家族kir和hla决定了目前供体细胞依赖性制备平台仅可以产生“定制的”nk细胞产物用于有限的患者，而不是“成品的”nk细胞产物用于广泛的患者。因此，探索规避上述这些问题的供选择的制备策略势在必行。

在多能性的阶段，人多能干细胞(hpsc)，特别是诱导的多能干细胞(ipsc)已成为可靠和可标准化的起始材料以产生免疫细胞样树突细胞(zeng,etal.journalofimmunology188,4297-4304(2012))以及nk细胞(woll,etal.blood113,6094-6101(2009))。虽然已开发几个方案以从hpsc产生nk细胞，但是需要富集cd34+细胞(woll,etal.blood113,6094-6101(2009))或旋转拟胚体(embryoidbody，eb)形成(knorr,d.a.etal.stemcellstranslationalmedicine2,274-283(2013))决定了这些现有方案是非常复杂和耗时的，因此更适合实验室使用而不是工业制备。此外，利用这些当前的方法，所得nk细胞表达高水平kir(knorretal.,2013)，这限制它们应用于某些hla分型的受体。到目前为止，尚未建立从各种hpsc来源持续产生nk细胞的稳定(robust)方案。

诱导hpsc的造血分化是从hpsc产生nk细胞的关键第一步。一种方法是将hpsc与骨髓基质细胞如s17和m2-10b4共培养以获得cd34+造血前体细胞(woll,etal.blood113,6094-6101(2009))。但是，这种方法需要长达21天的漫长共培养以及随后在它们进一步分化为nk细胞之前分选cd34+细胞。这个分选步骤不仅使方案复杂化，而且还由于排除许多其他也具有nk细胞分化潜能的造血前体细胞而影响nk细胞产量。产生造血细胞的另一方法是形成eb(tabatabaei-zavareh,etal.plosone2,e232(2007))和最近地，旋转(spin)eb(knorr,d.a.etal.stemcellstranslationalmedicine2,274-283(2013))。但是，这种随机分化方法是高度hpsc系依赖性的，因此对于各种hpsc来源来说不够稳定。此外，旋转eb形成需要先前耗时的hpsc适应tryple消化至少10代，这可能不适用于每个hpsc系。然后将这些tryple适应的hpsc以3,000个细胞/孔的密度接种于96-孔板中并离心下来用于旋转eb形成。这之后收获并以6个旋转eb/孔的密度将旋转eb接种于24-孔板中用于进一步的nk细胞分化。显然，这种劳动密集型和技能要求的旋转eb方法在商业生产中难以扩大规模。

与基质细胞共培养以促进造血祖细胞的进一步分化是从hpsc产生nk细胞的第二步。几种基质细胞系已用于共培养。虽然已证实基质细胞系如ms-5和aft024支持nk细胞发育，但是所得细胞是包含cd56+和cd56-细胞的异质群体(woll,etal.blood113,6094-6101(2009))。已显示基质细胞系el08-1d2更好地支持nk细胞发育(mccullar,v.etal.experimentalhematology36,598-608(2008))；但是，仅用分选的cd34+细胞或旋转eb证实了其效力(woll,etal.blood113,6094-6101(2009))。

发明目的

本发明的一个目的是改善上述困难中的一些，优选通过利用可靠、无限制和可标准化的起始细胞来源的人多能干细胞如诱导的多能干细胞(ipsc)以产生模拟的(mimetic)先天免疫细胞用于免疫疗法治疗。

因此，本发明的第一方面包括一种产生模拟的先天免疫细胞的方法，所述方法包括：

(a)将人多能干细胞与巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷的基质细胞系共培养以产生先天免疫细胞的祖细胞；

(b)在包含干细胞因子(scf)、fms-相关的酪氨酸激酶3配体(flt3l)、白介素7(il7)和/或白介素15(il15)的培养基中将先天免疫细胞的祖细胞与巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷且异位表达notch配体δ样1(dll1)的基质细胞系共培养以产生分化的模拟的先天免疫细胞；

(c)将分化的模拟的先天免疫细胞每周传代3-5周。

本发明的另一方面包括模拟的先天免疫细胞，其包含表达cd56、cd16、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2d、dnam-1、fasl、trailnkg2a/cd94中的至少一种或其组合且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)的细胞。

本发明的另一方面包括如本文所述的模拟的先天免疫细胞用于治疗。

本发明的另一方面包括如本文所述的模拟的先天免疫细胞用于治疗癌症。

本发明的另一方面包括如本文所述的模拟的先天免疫细胞在制备治疗癌症的药物中的用途。

本发明的另一方面包括一种用于产生模拟的先天免疫细胞的试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)人多能干细胞系；

(b)巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)表达缺陷的基质细胞系；

(c)巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷且异位表达notch配体δ样1(dll1)的基质细胞系；

(d)用于共培养人多能干细胞与m-csf表达缺陷的基质细胞系的第一简单培养基；以及

(e)包含干细胞因子(scf)、fms-相关的酪氨酸激酶3配体(flt3l)、白介素7(il7)和/或白介素15(il15)的第二培养基。

本发明的另一方面包括一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括：向所述患者施用模拟的先天免疫细胞，所述模拟的先天免疫细胞表达cd56、cd16、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2d、dnam-1、fasl、trailnkg2a/cd94中的至少一种或其组合且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体kir，通过以下产生：

(a)将人多能干细胞与巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷的基质细胞系共培养以产生先天免疫细胞的祖细胞；

(b)在包含干细胞因子(scf)、fms-相关的酪氨酸激酶3配体(flt3l)、白介素7(il7)和/或白介素15(il15)的培养基中将先天免疫细胞的祖细胞与巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷且异位表达notch配体δ样1(dll1)的基质细胞系共培养以产生分化的模拟的先天免疫细胞；

(c)将分化的模拟的先天免疫细胞每周传代3-5周。

本发明的另一方面包括一种从外周血细胞的非t细胞产生诱导的多能干细胞(ipsc)的方法，所述方法包括：

(a)将重新编程转录因子并入非t细胞；

(b)使并入重新编程转录因子的非t细胞生长成为多能干细胞。

本发明的另一方面包括一种从γδt细胞(γδt细胞)产生诱导的多能干细胞(ipsc)的方法，所述方法包括：

(a)将重新编程转录因子并入γδt细胞；

(b)使并入重新编程转录因子的γδt细胞生长成为多能干细胞。

本发明的另一方面包括诱导的多能干细胞(ipsc)，其包含以tcrg基因构型排列的tcr基因或以tcrd基因构型排列的tcr基因。

本发明的另一方面包括一种产生模拟的nk细胞的方法，所述方法包括：

(a)将人多能干细胞与巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)表达缺陷的基质细胞系共培养以产生始发态的(primed)先天免疫细胞；

(b)在包含干细胞因子(scf)、fms-相关的酪氨酸激酶3配体(flt3l)、白介素7(il7)和/或白介素15(il15)的培养基中将所述始发态的先天免疫细胞与m-csf表达缺陷且异位表达notch配体δ样1(dll1)的基质细胞系共培养以产生分化的模拟的先天免疫细胞；

(c)将分化的模拟的先天免疫细胞每周传代，传代3-5周。

本发明的另一方面包括一种产生模拟的γδt细胞的方法，所述方法包括：

(a)将人多能干细胞与巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)表达缺陷的基质细胞系共培养以产生始发态的先天免疫细胞；

(b)在包含干细胞因子(scf)、fms-相关的酪氨酸激酶3配体(flt3l)、白介素7(il7)和/或白介素15(il15)的培养基中将始发态的先天免疫细胞与m-csf表达缺陷且异位表达notch配体δ样1(dll1)的基质细胞系共培养以产生分化的模拟的先天免疫细胞；

(c)将分化的模拟的先天免疫细胞每周传代，传代3-5周。

本发明的另一方面包括模拟nk细胞，其包含表达cd56、cd16、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2d、dnam-1、fasl、trail、nkg2a/cd94中的至少一种或其组合的细胞，没有cd3表达且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体kir。

本发明的另一方面包括模拟γδt细胞，其包含表达(a)cd56、cd16、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2d、dnam-1、fasl、trail、nkg2a/cd94中的至少一种或其组合；(b)γδtcr；以及(c)低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体kir的细胞。

当回顾本发明的具体实施方案的以下描述连同附图时，本发明的其他方面和特征对本领域技术人员会变得清楚。

附图说明

在仅通过实例的方式说明本发明的实施方案的图中：

图1：从hpsc产生nk细胞。(a):从hpsc衍生nk细胞的两阶段方案的示意图。(b-i):h1细胞分化为nk细胞期间的形态变化。相差图像显示：(b):未分化的h1细胞；(c):h1和op9共培养第12天；(d):第一分化细胞和op9-dll1共培养第7天(第19天)；(e):第二分化细胞和op9-dll1共培养第7天(第26天)；(f-g):第三分化细胞和op9-dll1共培养第7天(第33天)；(h-i):第四分化细胞和op9-dll1共培养第7天(第40天)。(j-l):h1细胞分化为nk细胞期间的表型变化。流式细胞术分析显示(j):来自h1和op9共培养第12天的cd34+细胞；(k-l):来自op9-dll1上的第三(d33)和第四(d40)共培养的cd56+cd45+细胞。

图2：从pbc衍生的ipsc产生nk细胞。(a)从pbc产生ipsc。pbc衍生的ipsc(pbc-ipsc)集落和扩增的ipsc的典型形态学和表型。相差图像显示第20天和第25天的pbc-ipsc集落以及第1代和第2代扩增的ipsc系。荧光图像显示pbc-ipsc系中ssea-4、tra-1-60、tra-1-81和碱性磷酸酶的免疫染色。(b-e)从pbc-ipsc产生nk细胞。示出pbc-ipsc系pbc-ipsc#9分化为nk细胞期间的表型变化。流式细胞术分析显示分化过程中不存在tcrαβ表达。

图3：从gdt-ipsc产生γδt细胞。利用图1a中建立的方案分化γδt细胞衍生的ipsc系gdta/nf-ipsc#1。(a-l):通过流式细胞术分析的在第33天和第47天来自gdta/nf-ipsc#1系的分化的细胞的表型。(m):在第47天来自gdta/nf-ipsc#1系的分化的细胞的形态学。分化非t细胞衍生的ipsc系gdta/nf-ipsc#3作为对照。(n-q):通过流式细胞术分析的在第47天来自gdta/nf-ipsc#3系的分化的细胞的表型。

图4：pbc-ipsc衍生的nk细胞的形态学和表型。(a-b):衍生自pbc-ipsc#9的nk细胞的形态学(a)和表型(b)。

图5：ipsc-γδt细胞、pb-γδt细胞和pb-nk细胞上激活分子和死亡诱导配体的表达。利用图1a中建立的方案从gdta/nf-ipsc#1系产生ipsc-γδt细胞。pb-γδt细胞和pb-nk细胞扩增自健康供体的pbmc。通过流式细胞术分析ipsc-γδt细胞(a)、扩增的pb-γδt细胞(b)和扩增的pb-nk细胞(c)的表型。

图6：ipsc-γδt细胞、pb-γδt细胞和pb-nk细胞上抑制受体和kir的表达。利用图1a中建立的方案从gdta/nf-ipsc#1系产生ipsc-γδt细胞。pb-γδt细胞和pb-nkt细胞扩增自健康供体的pbmc。通过流式细胞术检测ipsc-γδt细胞(a)、扩增的pb-γδt细胞(b)和扩增的pb-nk细胞(c)上抑制受体和kir的表达。

图7：pbc-ipsc衍生的nk细胞的功能。(a-b):通过elispot测定检测的k562和raji细胞刺激之后衍生自pbc-ipsc#9的nk细胞的ifn-γ分泌。示出elispot图像(a)和斑点计数(b)。(c-d):通过elispot测定检测的k562细胞刺激之后来自pbc-ipsc#9的nk细胞的grb分泌。示出elispot图像(c)和斑点计数(d)。(e-f):通过流式细胞术测量的衍生自pbc-ipsc#9的nk细胞对k562和raji细胞的细胞毒性。示出代表性流式细胞术分析(e)和结果总结(f)。(g-h):通过流式细胞术测量的在抗cd20人源化抗体存在下nk细胞对raji细胞的adcc。示出代表性流式细胞术分析(g)和结果总结(h)。

图8：ipsc衍生的γδnkt细胞对癌细胞的细胞毒性。γδnkt细胞产生自gdta/nf-ipsc#1系并用于对各种癌细胞系的细胞毒性试验：mcf7、sw480、bt474和sk-ov-3。

图9：外周血γδt细胞的扩增。用zometa和il-2培养pbmc。(a):第1天和第7天pbmc培养物的形态学；(b):第7天pbmc培养物的表型。

图10：gdt-ipsc的产生。利用sendai病毒载体或核转染将pbmc重新编程为ipsc。(a-f):培养的pbmc重新编程为ipsc期间的形态学变化。相差图像显示(a):通过sendai病毒载体转导之后第6天存活的培养的pbmc；(b):接种转导细胞之后第17天在mef上出现ipsc集落；(c):从mef平板转移之后粘附至matrigel包被平板的ipsc集落；(d-f):建立通过核转染产生的3个ipsc系。(g):tcrg基因克隆性测定以鉴定γδt细胞衍生的ipsc系。箭头表示检测gdta/nf-ipsc#1系中的重排tcrg基因。(h):通过流式细胞术检测3个建立的ipsc系中的cd3和γδtcr表达。

图11：新鲜和冻存的pbc-ipsc衍生的nk细胞的扩增。(a-b):用不同nk细胞数量开始通过g-rex10中的k562-mb15-41bbl扩增新鲜的衍生自pbc-ipsc#9的nk细胞。示出14-天扩增期间nk细胞的绝对数量(a)和倍数变化(b)。(c-d):通过流式细胞术测量的14-天扩增之后新鲜nk细胞的表型(c)和对k562的细胞毒性(d)。(e):冻/融过程之后扩增的nk细胞的生存力。(f):冻存nk细胞的扩增。(g):扩增之后冻存nk细胞对k562的细胞毒性。

发明详述

尚未建立从各种hpsc来源持续产生先天免疫细胞的稳定方案。在这方面，已设计大规模生产功能性nk细胞的制备方案，并且证实不仅来自经典hpsc来源，人胚胎干细胞(hesc)，而且还来自方便的hpsc来源，外周血细胞(pbc)衍生的ipsc(pbc-ipsc)，不采用cd34+细胞富集或旋转eb形成。

人多能干细胞(hpsc)，特别是诱导的多能干细胞(ipsc)提供有希望的起始材料以产生模拟的先天免疫细胞如模拟的自然杀伤(nk)细胞和模拟的γδt-细胞用于癌症免疫疗法。为了促进持续的大规模生产，设计并证实了从人多能干细胞(hpsc)制备模拟的先天免疫细胞的总体制备方案。特别地，通过op9细胞上的顺序造血分化和op9-dll1细胞上的淋巴定型(lymphoidcommitment)而不采用cd34+细胞富集和旋转拟胚体形成使hpsc分化为模拟的nk细胞或具有nk特性的模拟的γδt-细胞的稳定方案。

因此，本发明的第一方面包括一种产生模拟的先天免疫细胞的方法，所述方法包括：

(a)将人多能干细胞与巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷的基质细胞系共培养以产生始发态的先天免疫细胞；

(b)在包含干细胞因子(scf)、fms-相关的酪氨酸激酶3配体(flt3l)、白介素7(il7)和/或白介素15(il15)的培养基中将始发态的先天免疫细胞与巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷且异位表达notch配体δ样1(dll1)的基质细胞系共培养以产生分化的模拟的先天免疫细胞；

(c)将分化的模拟的先天免疫细胞每周传代，传代3-5周。

在利用这个方案的各种实施方案中，产生功能性模拟的nk细胞和具有nk特性的模拟的γδt-细胞。

如本文所用，术语“模拟的先天免疫细胞”是指衍生自多能干细胞且具有一些与它们模拟的先天免疫细胞相似的特征和一些与它们模拟的先天免疫细胞不同的特征的细胞。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞称作ipsc衍生的nk细胞。例如，在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞如pbc-ipsc衍生的nk细胞或ipsc衍生的γδnkt细胞具有nk细胞的特征如表达nkp30、nkp44、nkp46、nkg2d、dnam-1、fasl、trail和/或nkg2a/cd94，但是还有天然存在的nk细胞或γδt细胞中不存在的新特征如没有或低表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞如pbc-ipsc衍生的nk细胞具有nk细胞的特征，如表达cd56、cd16、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2d、dnam-1、fasl、trail、nkg2a/cd94中的至少一种或其组合。这些特征具有识别广谱癌细胞的优点。在这个实施方案中，所述细胞还具有新特征，如没有或低表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)。在各种其他实施方案中，除了具有pbc-ipsc衍生的nk细胞中存在的上述特征中的任一种，模拟的先天免疫细胞如ipsc衍生的γδnkt细胞表达可以识别含磷抗原的γδtcr。在各种实施方案中，低kir是指少于20％表达的kir；或者少于10％表达的kir；或者少于5％表达的kir。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞具有5％或更少表达的kir2dl1。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞具有13％或更少表达的kir3dl1。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞具有7％或更少表达的kir3dl1。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞具有18％或更少表达的kir2dl2。kir-阴性或kir-低表达的模拟的先天免疫细胞具有优点，其可以服务广泛的受体而不管他们的hla基因型。有趣的是，用自体pbc-ipsc系开始，可能产生自体kir-阴性或kir-低表达模拟的先天免疫细胞来源在自体环境下使用而不用担心自身hla分子抑制。免疫排斥的风险减少，这些模拟的先天免疫细胞如自体pbc-ipsc-nk细胞可以存活更长，因此提供延长的抗肿瘤活性。

在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞如ipsc衍生的γδnkt细胞具有nk细胞的特征如表达cd56、cd16、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2d、dnam-1、fasl、trail、nkg2a/cd94中的至少一种或其组合，以及新特征如没有或低表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)，还有γδt细胞的特征如cd3+和/或γδt细胞受体如vγ9vδ2(vγ9vδ2)。

巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)表达缺陷的基质细胞系可以具有不表达或表达非功能性突变体的缺陷基因或者可以利用任何已知方法如反义、sirna、shrna或本领域已知敲减蛋白表达的任何其他方法将其敲减。在各种实施方案中，m-csf表达缺陷的基质细胞系可以是间充质干细胞如骨髓间充质干细胞。在各种实施方案中，m-csf表达缺陷的基质细胞系可以是op9细胞。在各种实施方案中，m-csf功能性cdna由核酸序列seqidno.2表示，而功能性m-csf蛋白由氨基酸序列seqidno.3表示。导致功能失调的m-csf的这些序列的任何突变将会是足够的。

在开发工业相容的分化方案的各种实施方案中，已证实通过与经典的m-csf缺陷的基质细胞系op9共培养，一贯可以在12天中实现hesc和pbc-ipsc的高效造血分化，这显著短于使用其他基质细胞系。收获的造血细胞可以直接用于nk细胞生成而不用分选cd34+细胞。因此，利用op9诱导造血分化可以通过避免cd34+细胞分选和eb形成显著简化制备过程。在各种实施方案中，先天免疫细胞的祖细胞包含造血细胞。

巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)表达缺陷且异位表达notch配体δ样1(dll1)的基质细胞系可以是如上文讨论的巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)表达缺陷的基质细胞系，其工程化以外源或异常表达dll1。本领域已知在m-csf表达缺陷的基质细胞系中人工引起dll1表达的任何方法会是合适的。在各种实施方案中，异位表达dll1的m-csf表达缺陷的基质细胞系可以是用dll1转导的间充质干细胞如骨髓间充质干细胞。在各种实施方案中，异位表达dll1的m-csf表达缺陷的基质细胞系可以是op9dll1细胞。在各种实施方案中，dll1cdna由核酸序列seqidno.4表示，而dll1蛋白由氨基酸序列seqidno.5表示。导致功能性dll1的序列的功能性变异是足够的。

在为nk细胞发育提供稳定环境的各种实施方案中，使用以dll1和nk细胞促进细胞因子组合修饰的op9细胞系，所述组合包括scf、flt3l、il-7和il-15。利用这样的方法，收获自hpsc/op9共培养物的异质造血细胞可以直接用于nk细胞产生，并且终产物是具有超过99％cd56+cd45+nk细胞的均质淋巴群体。这种方法的稳定性(robustness)可能是由于notch信号传导途径的激活，其在先天淋巴样细胞的发育中起重要作用。这种分化方法不需要细胞分选、eb形成、旋转eb形成、t或b细胞去除或者nk细胞富集。

不受任何理论限制，假设步骤(a)中巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)的缺陷使细胞继续分化为造血细胞，步骤(b)中巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)的缺陷和培养基中dll1表达的组合刺激淋巴定型，并且一个接一个使用的两种不同类型基质细胞的此两个阶段流程组合导致具有独特特征的模拟的先天免疫细胞。在各种实施方案中，所述流程促进nk细胞特征的表达如cd56、cd16、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2d、dnam-1、fasl、trailnkg2a/cd94或其组合的表达以及nk细胞不常见的其他特征如没有或低表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)。

在各种实施方案中，步骤(b)中使用的培养基也起到重要作用，并且在各种实施方案中，所述培养基包含干细胞因子(scf)、fms-相关的酪氨酸激酶3配体(flt3l)、白介素7(il7)。在各种实施方案中，所述培养基包含干细胞因子(scf)、fms-相关的酪氨酸激酶3配体(flt3l)、白介素15(il15)。在各种其他实施方案中，所述培养基包含干细胞因子(scf)、fms-相关的酪氨酸激酶3配体(flt3l)、白介素7(il7)和白介素15(il15)。同时全部3种组合均能够产生具有独特特征的模拟的先天免疫细胞。令人惊讶的是，单独使用白介素15(il15)或与白介素7(il7)组合显著增加产生的模拟的先天免疫细胞百分比，虽然单独使用白介素7(il7)仍成功产生具有独特特征的模拟的先天免疫细胞。本领域已知的其他淋巴细胞培养基也可以用作基础培养基。

如本文所用，术语“传代(passage)”、“传代(passaging)”或“传代(passaged)”是指将一些或全部细胞传代培养至新鲜培养基中。这可以包括本领域通常知道或使用的任何方法。在各种实施方案中，共培养每7天之后将分化的模拟的先天免疫细胞传代，传代3次，并且在21天之后，优选至33天收获最终模拟的先天免疫细胞。在各种实施方案中，共培养每7天之后将分化的模拟的先天免疫细胞传代，传代4次，并且在28天之后，优选至40天收获最终模拟的先天免疫细胞。在各种实施方案中，共培养每7天之后将分化的模拟的先天免疫细胞传代，传代5次，并且在35天之后，优选至47天收获最终模拟的先天免疫细胞。

在各种实施方案中，将步骤(a)中的人多能干细胞与m-csf表达缺陷的基质细胞系共培养12天。在各种实施方案中，将步骤(a)中的人多能干细胞在包含α最小必需培养基(αmem)和胎牛血清(fbs)的简单培养基中共培养，并且每3-4天更换一半简单培养基对共培养物进行补料。还可以使用本领域已知的其他干细胞分化培养基。

在各种实施方案中，步骤(b)中使用的培养基进一步包含胎牛血清(fbs)；α最小必需培养基(αmem)；或者其组合。

在各种实施方案中，人多能干细胞是人胚胎干细胞(hesc)。hesc在安全方面是个好选择，但是hesc的衍生通常在伦理上是有争议的，并且hesc衍生物的应用仅限于同种异体环境。

在各种实施方案中，人多能干细胞诱导自外周血细胞(pbc(ipsc))。使用ipsc的优点是，它们可以产生自可靠、无限制和可标准化的起始细胞来源如分离自供体或患者的外周血单个核细胞(pbmc)，允许ipsc衍生物用于自体和同种异体应用，并且其还没有任何使用hesc的伦理问题。

目前，大部分ipsc是通过重新编程成年体细胞产生的。起始体细胞的选择不仅会影响重新编程的效率和动力学，而且还会影响产生gmp-级ipsc的实用性。虽然成纤维细胞是最常用的体细胞，但是它们不是非常符合gmp。通过钻取活组织检查采集皮肤样品是侵入性的，并且从皮肤活组织检查样品生长成纤维细胞是耗时的(长达3周)。在gmp下成纤维细胞的衍生本身已经是一项艰巨的任务。相比之下，利用pbc产生ipsc是更实际的选择，因为外周血采集方便，并且从外周血样品分离单个核细胞只需15分钟。在样品采集、运输和加工中容易实现gmp使得pbc成为吸引人的ipsc衍生的起始材料。更重要的是，利用两阶段分化方案，第一次证实从pbc衍生的ipsc产生高纯度、功能性和可扩增的模拟的先天免疫细胞如nk细胞。

在各种实施方案中，将重新编程转录因子并入外周血细胞并生长以产生诱导的多能干细胞(ipsc)。

在各种实施方案中，重新编程转录因子包括传统的yamanaka转录因子oct4、sox2、klf4和c-myc。在各种其他实施方案中，重新编程转录因子可以是oct3/4和sox家族的成员，包括sox1、sox2、sox3或sox15中的任一种。或者，在各种其他实施方案中，重新编程转录因子可以是oct3/4；转录因子的sox家族的成员，包括sox1、sox2、sox3或sox15中的任一种；nanog和lin28。或者，在各种其他实施方案中，重新编程转录因子可以是oct3/4；转录因子的sox家族的成员，包括sox1、sox2、sox3或sox15中的任一种；转录因子的klf家族的成员，包括klf1、klf2、klf4或klf5，以及转录因子的myc家族的成员，包括c-myc、l-myc或n-myc。或者，在各种其他实施方案中，重新编程转录因子可以是oct3/4；转录因子的sox家族的成员，包括sox1、sox2、sox3或sox15中的任一种；转录因子的klf家族的成员，包括klf1、klf2、klf4或klf5，以及glis1，或者本领域已知从分化的成年细胞开始有效产生表达阶段特异性胚胎抗原(ssea-3和ssea-4)和/或tra-1-60、tra-1-81抗体识别的表位的多能细胞的任何重新编程转录因子。

在各种实施方案中，可以通过逆转录病毒转导将重新编程转录因子并入外周血细胞。在各种实施方案中，可以通过慢病毒表达系统将重新编程转录因子并入外周血细胞。在各种实施方案中，可以利用单盒重新编程载体将重新编程转录因子并入外周血，在所述载体中每个重新编程因子通过自我切割肽信号如stemcca分开。在各种实施方案中，可以通过腺病毒表达系统将重新编程转录因子并入外周血细胞。在各种实施方案中，可以通过仙台病毒表达系统将重新编程转录因子并入外周血细胞。在各种实施方案中，可以通过蛋白扩散入细胞将重新编程转录因子并入外周血细胞。在各种实施方案中，可以通过mrna转染将重新编程转录因子并入外周血细胞。在各种实施方案中，可以通过mirna感染或转染将重新编程转录因子并入外周血细胞。在各种实施方案中，可以通过利用转座子系统的piggybac系统将重新编程转录因子并入外周血细胞。在各种实施方案中，可以通过仅含有真核启动子和待表达的cdna的小环载体将重新编程转录因子并入外周血细胞。在各种实施方案中，可以通过游离型质粒中重现编程因子的瞬时表达或本领域已知将重新编程转录因子递送至外周血细胞中的任何其他方法将重新编程转录因子并入外周血细胞，以便高效产生诱导的多能干细胞(ipsc)。

在各种实施方案中，所述方法进一步包括在将重新编程转录因子并入外周血细胞以产生诱导的多能干细胞(ipsc)之前在氨基-双膦酸(amino-bisphosphonate)和白介素2(il2)的存在下扩增外周血细胞。

在各种实施方案中，氨基-双膦酸和白介素2(il2)一般用来诱导γδt细胞的扩增，所述γδt细胞被发现表达vγ9vδ2t细胞。不受任何理论限制，假设因为vγ9vδ2t细胞与含磷抗原反应，所以氨基-双膦酸刺激这类vγ9vδ2t细胞的形成。

在各种实施方案中，氨基-双膦酸是唑来膦酸(zoledronate)或唑来膦酸(zoledronicacid)或其商业上称为zometa的盐。优选地，因为唑来膦酸在商业上可容易获得，但是任何氨基-双膦酸会是合适的。唑来膦酸(zoledronate)如下式。

在各种实施方案中，ipsc包含以tcrg基因构型排列的tcr基因。在各种实施方案中，tcrg基因构型包含tcr体细胞重组为tcrg，并且还可以包括tcrd基因构型，所述tcrd基因构型包含tcr体细胞重组为tcrd。在各种实施方案中，tcrg基因构型由核酸序列seqidno.1表示，还会包括导致表达功能性tcrγ的序列的功能性变异。在各种实施方案中，ipsc包含以tcrd基因构型排列的tcr基因。在各种实施方案中，tcrd基因构型包含tcr体细胞重组为tcrd，导致表达功能性tcrδ的任何已知tcrd序列会是合适的。

如本文所用，以tcrg基因构型排列的tcr基因包含核酸分子，所述分子通常编码γtcr多肽、等位变体或类似物，包括它们的片段。具体提供用于筛选tcrg基因构型的dna分子和用于保证γtcr多肽表达的dna分子，选自：(a)seqidno:1中示出的dna分子，或其片段；(b)与(a)中定义的dna分子杂交的dna分子或其可杂交片段；以及(c)编码任何前述dna分子编码的氨基酸序列表达的dna分子。

如果在其天然状态下或通过本领域技术人员公知的方法操纵时，其可以转录和/或翻译以产生mrna和/或多肽或其片段，则说多核苷酸“编码”多肽。反义链是这样的核酸的互补体，并且编码序列可以由其推断。

“tcrg基因序列”、“tcrg基因”、“tcrg核酸”或“tcrg多核苷酸”每个是指可能在正常t-细胞中表达的多核苷酸，包括能够表达功能性γtcr多肽的tcrg基因序列的突变。

tcrg基因序列意在包括编码序列、间隔序列以及控制转录和/或翻译的调节元件。tcrg基因序列意在包括能够表达γtcr多肽的dna序列的所有等位变异。

如果在与其他核酸(或其互补链)最佳比对(有适当核苷酸插入或缺失)时，在核苷酸碱基的至少约60％，通常至少约70％，更通常至少约80％，优选至少约90％，并且更优选核苷酸碱基的至少约95-98％有核苷酸序列相同性，则核酸或其片段与另一核酸或其片段“基本上同源”(“或基本上相似”)。

其他优选多核苷酸包含与编码γtcr的氨基酸的seqidno:1的序列具有大于40、50、60或70％相同性，更优选大于80、90、95或97％相同性的连续序列。

tcrg基因构型的检测可以按照本领域已知的方法进行，包括诸如southern印迹杂交、聚合酶链反应的技术，或者可以使用其他合适的方法。

在各种实施方案中，本发明具有第一次证实利用γδt细胞衍生的ipsc产生γδt细胞的优点。得到了从γδt细胞衍生ipsc并利用这些ipsc产生γδt细胞和新免疫细胞类型γδ自然杀伤细胞t细胞的工业相容性生产方案和方法。

在各种实施方案中，所述方法进一步包括在包含干细胞因子(scf)；胎牛血清(fbs)；fms-相关的酪氨酸激酶3配体(flt3l)、白介素15(il15)和白介素7(il7)的培养基中在饲养细胞的存在下扩增模拟的先天免疫细胞。

在各种实施方案中，所述饲养细胞是能够扩增nk细胞的经辐照的细胞系。在各种实施方案中，所述饲养细胞是经γ辐照的k562-mbil15-41bbl。

在各种实施方案中，利用饲养细胞系，pbc-ipsc衍生的模拟的nk细胞可以在9天中扩增74-倍，以及在冻存之后扩增38.5-倍。如增加的对k562细胞的细胞毒性所示，这些扩增的模拟nk细胞在功能上变得更有效。从新鲜和冷冻pbc产生ipsc的可能性为gmp生产提供更大的灵活性。为此，在这个研究中证实从冷冻pbc衍生ipsc的可行性。

本发明的另一方面包括模拟的先天免疫细胞，其包含表达cd56、cd16、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2d、dnam-1、fasl、trail、nkg2a/cd94中的至少一种或其组合且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)的细胞。任选地，这些模拟的先天免疫细胞是有或无γδtcr表达的细胞。

在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞包含表达cd56且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)的细胞。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞包含表达cd16且如上文所述低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)的细胞。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞包含表达nkp30且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)的细胞。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞包含表达nkp44且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)的细胞。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞包含表达nkp46且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)的细胞。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞包含表达nkg2d且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)的细胞。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞包含表达dnam-1且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)的细胞。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞包含表达fasl且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)的细胞。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞包含表达trail且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)的细胞。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞包含表达nkg2a/cd94且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)的细胞。在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞包含表达cd56、cd16、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2d、dnam-1、fasl、trail、nkg2a/cd94中任2种、或任3种、或任4种、或任5种、或任6种、或任7种、或任8种、或任9种、或全部的组合且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)的细胞。

在各种实施方案中，可以通过本领域已知用于测量蛋白表达的任何方法确定细胞表达谱。例如色谱法如hplc、lcms，或者聚丙烯酰胺凝胶电泳。或者抗体法，其中将杂交至蛋白的抗体标记用于检测，如elisa、流式细胞术、蛋白免疫沉淀、免疫-电泳或蛋白印迹。在各种实施方案中，具有缀合标签如颜色标签、磁性标签、荧光标签、放射性标签、有已知特性的蛋白标签的抗体能够杂交至以下蛋白序列中任一种的部分：氨基酸序列seqidno:6表示的cd56、氨基酸序列seqidno:7表示的cd16、氨基酸序列seqidno:8表示的nkp30、氨基酸序列seqidno:9表示的nkp44、氨基酸序列seqidno:10表示的nkp46、氨基酸序列seqidno:11表示的nkg2d、氨基酸序列seqidno:12表示的dnam-1、氨基酸序列seqidno:13表示的fasl、氨基酸序列seqidno:14表示的trail或氨基酸序列seqidno:15表示的nkg2a/cd94。

在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞是有或无γδtcr表达的细胞。

在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞如本文所述。

在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞进一步包含cd3+表达，一些t-细胞的特征。

在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞进一步包含γδtcr表达，γ/δt-细胞的特征。

在各种实施方案中，γδtcr包含vγ9vδ2(vγ9vδ2)。

在各种实施方案中，该技术已证实从ipsc产生γδt细胞和新免疫细胞类型–γδ自然杀伤t细胞的最好方法。

在开发γδt细胞成为无限的“常备”产品的各种实施方案中，第一次证实从诱导的多能干细胞(ipsc)产生γδt细胞。用γδt细胞富集的血细胞培养物开始，产生ipsc系并鉴定为衍生自γδt细胞的那些。在利用这些γδt细胞衍生的ipsc(gdt-ipsc)的各种实施方案中，产生γδt细胞，其是γδtcr+cd3+和vγ9vδ2+。此外，通过用本文公开的从ipsc产生nk细胞的方案分化gdt-ipsc，产生的γδt细胞，产生的γδt细胞进一步装备有nk细胞的许多“抗癌”分子，其包括激活受体、天然细胞毒性受体和死亡诱导分子。因此，配备γδt细胞和nk细胞的抗癌特征，这些新的ipsc衍生的“γδ自然杀伤t细胞”具有很强的治疗活性以靶向广泛的癌细胞。

本发明的另一方面包括如本文所述的模拟的先天免疫细胞用于治疗。

在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞可以适合治疗病毒感染、细菌感染、真菌感染、任何其他感染或癌症。

本发明的另一方面包括如本文所述的模拟的先天免疫细胞用于治疗癌症。

在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞可以适合治疗癌症，包括肉瘤、癌(carcinoma)和淋巴瘤、白血病、乳腺癌、结肠直肠癌或卵巢癌。

在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞可以适合治疗实体瘤癌症。在各种实施方案中，实体瘤包括肉瘤、癌或淋巴瘤。

在各种实施方案中，模拟的先天免疫细胞可以适合治疗乳腺腺癌、结肠直肠腺癌、乳腺导管癌、卵巢腺癌、乳腺导管癌、卵巢腺癌或白血病。

在各种实施方案中，白血病包括慢性髓性白血病或伯基特淋巴瘤。

在各种实施方案中，显示模拟的先天免疫细胞对癌细胞有毒性，如人髓性白血病细胞、乳腺腺癌细胞、结肠直肠腺癌细胞、乳腺导管癌细胞和卵巢腺癌细胞。

本发明的另一方面包括如本文所述的模拟的先天免疫细胞在制备治疗癌症的药物中的用途。

在各种实施方案中，所述癌症是实体瘤癌症或白血病。

在各种实施方案中，实体瘤癌症包括乳腺腺癌、结肠直肠腺癌、乳腺导管癌或卵巢腺癌。在各种实施方案中，白血病包括急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病或慢性髓性白血病。

在各种实施方案中，癌症包括肉瘤、癌、淋巴瘤、白血病、乳腺癌、结肠直肠癌或卵巢癌。

显示模拟的先天免疫细胞对癌细胞有毒性，如人髓性白血病细胞、乳腺腺癌细胞、结肠直肠腺癌细胞、乳腺导管癌细胞和卵巢腺癌细胞。

本发明的另一方面包括一种用于产生模拟的先天免疫细胞的试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)人多能干细胞系；

(b)巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)表达缺陷的基质细胞系；

(c)巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷且异位表达notch配体δ样1(dll1)的基质细胞系；

(d)用于共培养人多能干细胞与m-csf表达缺陷的基质细胞系的第一简单培养基；以及

(e)包含干细胞因子(scf)、fms-相关的酪氨酸激酶3配体(flt3l)、白介素7(il7)和/或白介素15(il15)的第二培养基。

在各种实施方案中，人多能干细胞系可以包括人胚胎干细胞(hesc)。在各种其他实施方案中，人多能干细胞系可以包括外周血细胞衍生的ipsc系，其可以是非t细胞衍生的ipsc系或γδt细胞衍生的ipsc系。

巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)表达缺陷的基质细胞系以及巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷且异位表达notch配体δ1(dll1)的基质细胞系如上文所述。

在各种实施方案中，第一简单培养基包含α最小必需培养基(αmem)或其他干细胞分化培养基以及胎牛血清(fbs)。

在各种实施方案中，第二培养基包含干细胞因子(scf)、fms-相关的酪氨酸激酶3配体(flt3l)、白介素7(il7)。在各种实施方案中，所述培养基包含干细胞因子(scf)、fms-相关的酪氨酸激酶3配体(flt3l)、白介素15(il15)。在各种其他实施方案中，所述培养基包含干细胞因子(scf)、fms-相关的酪氨酸激酶3配体(flt3l)、白介素7(il7)和白介素15(il15)。同时全部3种组合均能够产生具有独特特征的模拟的先天免疫细胞。令人惊讶的是，单独使用白介素15(il15)或与白介素7(il7)组合显著增加产生的模拟的先天免疫细胞百分比和/或量，虽然单独使用白介素7(il7)仍成功产生具有独特特征的模拟的先天免疫细胞。

在各种实施方案中，第二培养基进一步包含胎牛血清(fbs)；α最小必需培养基(αmem)或其他淋巴细胞培养基；或者其组合。

在各种实施方案中，所述试剂盒进一步包含氨基-双膦酸和白介素2(il2)。在各种实施方案中，氨基-双膦酸是唑来膦酸或其盐。

本发明的另一方面包括一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括：给所述患者施用模拟的先天免疫细胞，所述模拟的先天免疫细胞表达cd56、cd16、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2d、dnam-1、fasl、trailnkg2a/cd94中的至少一种或其组合且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体kir，所述模拟的先天免疫细胞通过以下产生：

(a)将人多能干细胞与巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷的基质细胞系共培养以产生先天免疫细胞的祖细胞；

(b)在包含fms-相关的酪氨酸激酶3配体(flt3l)、白介素7(il7)和/或白介素15(il15)的培养基中将先天免疫细胞的祖细胞与巨噬细胞集落刺激因子表达缺陷且异位表达notch配体δ样1(dll1)的基质细胞系共培养以产生分化的模拟的先天免疫细胞；

(c)将分化的模拟的先天免疫细胞每周传代，传代3-5周。

在各种实施方案中，所述癌症是如本文所述的实体瘤癌症。在各种实施方案中，所述癌症是如本文所述的白血病。

在各种实施方案中，实体瘤癌症包括乳腺腺癌、结肠直肠腺癌、乳腺导管癌或卵巢腺癌。在各种实施方案中，白血病包括急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病或慢性髓性白血病。

本发明的另一方面包括一种从外周血单个核细胞产生诱导的多能干细胞(ipsc)的方法，所述方法包括：

(a)将重新编程转录因子并入外周血单个核细胞；

(b)使并入重新编程转录因子的外周血单个核细胞生长为多能干细胞。

在各种实施方案中，单个核外周血细胞是γδt细胞。这是从γδt-细胞产生ipsc的第一证明。在各种其他实施方案中，单个核外周血细胞是外周血细胞的非t细胞。

在各种实施方案中，所述方法进一步包括在将重新编程转录因子并入γδt-细胞之前在氨基-双膦酸和白介素2(il2)的存在下扩增外周血细胞。

在各种实施方案中，氨基-双膦酸是唑来膦酸或其盐。

在各种实施方案中，ipsc包含以tcrg基因构型排列的tcr基因或以tcrd基因构型排列的tcr基因。在各种实施方案中，tcrg基因构型由核酸序列seqidno.1表示。导致表达功能性tcrγ的序列的功能性变异也是足够的。在各种实施方案中，tcrd基因构型包含tcr体细胞重组为tcrd，导致表达功能性tcrδ的任何已知tcrd序列会是合适的。

本发明的另一方面包括诱导的多能干细胞(ipsc)，其包含以tcrg基因构型排列的tcr基因或以tcrd基因构型排列的tcr基因。

在各种实施方案中，重排的tcrg基因由核酸序列seqidno.1表示。导致表达功能性tcrγ的序列的功能性变异是足够的。在各种实施方案中，tcrd基因构型包含tcr体细胞重组为tcrd，导致表达功能性tcrδ的任何已知tcrd序列会是合适的。

本发明的另一方面包括一种产生模拟的nk细胞的方法，所述方法包括：

(a)将人多能干细胞与巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)表达缺陷的基质细胞系共培养以产生先天免疫细胞的祖细胞；

(b)在包含干细胞因子(scf)、fms-相关的酪氨酸激酶3配体(flt3l)、白介素7(il7)和/或白介素15(il15)的培养基中将先天免疫细胞的祖细胞与m-csf表达缺陷且异位表达notch配体δ样1(dll1)的基质细胞系共培养以产生分化的模拟的先天免疫细胞；

(c)将分化的模拟的先天免疫细胞每周传代，传代3-5周。

本发明的另一方面包括一种产生模拟的γδt细胞的方法，所述方法包括：

(a)将人多能干细胞与巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)表达缺陷的基质细胞系共培养以产生始发态的先天免疫细胞；

(b)在包含干细胞因子(scf)、fms-相关的酪氨酸激酶3配体(flt3l)、白介素7(il7)和/或白介素15(il15)的培养基中将始发态的先天免疫细胞与m-csf表达缺陷且异位表达notch配体δ样1(dll1)的基质细胞系共培养以产生分化的模拟的先天免疫细胞；

(c)将分化的模拟的先天免疫细胞每周传代，传代3-5周。

本发明的另一方面包括模拟的nk细胞，其包含表达cd56、cd16、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2d、dnam-1、fasl、trail、nkg2a/cd94中的至少一种或其组合且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体kir的细胞。

在各种实施方案中，模拟的nk细胞包含不表达cd3或不表达γδtcr的细胞。

本发明的另一方面包括模拟的γδt-细胞，其包含表达cd56、cd16、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2d、dnam-1、fasl、trail、nkg2a/cd94中的至少一种或其组合且低表达或不表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体kir的细胞。

在各种实施方案中，模拟的γδt-细胞是有γδtcr表达或cd3表达的细胞。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本文主题所属的技术人员通常理解的相同的含义。如本文所用，提供以下定义以促进本发明的理解。

在整个文件中，除非另有与此相反的陈述，否则术语“包含”、“由...组成”、“具有”等应当理解为非穷举的，或者换句话说，表示“包括但不限于”。

此外，在整个说明书中，除非上下文另有要求，词语“包括(include)”或变化如“包括(includes)”或“包括(including)”理解为表示包括所述整数或整数的组但不排除任何其他整数或整数的组。

除非上下文另有明确指定，如说明书和所附权利要求书所用，单数形式“一个”和“所述”包括复数指代。

实施例

描述的是从hpsc大规模生产先天免疫细胞的总体方案。与现有方案相比，所述方法更符合工业要求，并且提供生产nk细胞治疗剂所需的便利：(1)起始材料pbc-ipsc是方便、高度易用和gmp相容的hpsc来源；(2)通过排除细胞分选、eb形成和旋转eb形成简化分化过程；(3)产生的pbc-ipsc衍生的细胞已是高纯度和功能性群体，避免需要t-细胞和b-细胞消耗或者先天免疫细胞富集；(4)新鲜和冻存的nk细胞可以在短时间内扩增，这简化了nk细胞治疗剂的运输和制备物流；(5)扩增之后可以实现进一步功能成熟；(6)大部分pbc-ipsc衍生的先天免疫细胞是kir-阴性的，这意味着这些先天免疫细胞可以用作通用的细胞来源用于各种受体而不担心可能减少细胞毒性的抑制性信号传导。因此，利用pbc-ipsc衍生先天免疫细胞是适合大规模生产先天免疫细胞治疗剂的平台。

模拟的先天免疫细胞的产生

尚未建立从各种hpsc来源持续产生先天免疫细胞的稳定方案。在这方面，已设计大规模生产功能性nk细胞的制备方案，并且证实不仅来自经典hpsc来源，人胚胎干细胞(hesc)，而且还来自方便的hpsc来源，外周血细胞(pbc)衍生的ipsc(pbc-ipsc)，不采用cd34+细胞富集或旋转eb形成。

从hesc产生nk细胞。

细胞培养.在matrigel(bdbiosciences,sandiego,ca,http://www.bdbiosciences.com)包被的6-孔板上用mtesr1(stemcelltechnologies,vancouver,bc,canada,http://www.stemcell.com)培养hpsc系h1(wicellresearchinstitute,madison,wi,http://www.wicell.org)。用补充了20％胎牛血清(fbs)(hyclone,logan,ut,http://www.hyclone.com)的α-mem(thermofisherscientific,waltham,ma,http://corporate.thermofisher.com)培养op9细胞(americantypeculturecollection[attc],manassas,va,http://www.atcc.org)和op9/g-dll1细胞(rikenbrccellbank,ibaraki,japan,http://cell.brc.riken.jp/en/)。

两阶段方案.在第一阶段，将op9细胞接种在0.1％明胶(stemcelltechnologies)包被的t75瓶上。当长满(confluence)时，通过更换一半培养基对op9细胞培养物进行补料并过度生长(overgrown)4-6天。然后在补充了10％fbs的α-mem中于过度生长的op9细胞上接种1-1.5x10⁶个hesc并分化12天。每4天通过更换一半培养基对hesc/op9共培养物进行补料。在第二阶段，利用1mg/ml胶原酶iv(stemcelltechnologies)和trypleexpress(thermofisherscientific)从hesc/op9共培养物收获分化的细胞。通过塑料粘附45分钟去除op9细胞，并且通过100μm细胞过滤器(bdbiosciences)进一步去除细胞丛。然后利用包含10％fbs、10ng/mlscf(peprotech,rockyhill,nj,http://www.peprotech.com)、5ng/mlflt3l(peprotech)以及5ng/mlil-7(peprotech)和/或10ng/mlil-15(peprotech)的α-mem，将剩余的非粘附细胞与t75瓶上生长的op9-dll1共培养7天。此后，每周利用versene(thermofisherscientific)收获分化的细胞并且在6-孔板上生长的新的op9-dll1上共培养，进行额外的3-4周。

为了建立从hpsc衍生nk细胞的稳定的两阶段方案(图1a)，使用广泛使用的hesc系h1(图1b)。在第一阶段，为了诱导造血分化，将h1细胞与过度生长的op9细胞(骨髓基质细胞系)共培养。在共培养的第12天，始终观察到许多分化的集落(图1c)和cd34+细胞的小群体(图1j)。在第二阶段，为了诱导淋巴定型，每周收获这些分化的细胞并且在干细胞因子(scf)、fms-相关的酪氨酸激酶3配体(flt3l)和il-7的存在下与notch配体δ样-1(dll1)修饰的op9细胞系op9-dll1共培养。与op9-dll1第一次共培养之后7天(第19天)，大部分分化的细胞仍作为粘附细胞生长(图1d)；第二次共培养之后(第26天)，一些明亮的圆形且半粘附的细胞开始出现(popout)(图1e)；第三次共培养之后(第33天)，这些细胞脱离并在孔的中央聚集(图1f,g)；第四次共培养之后(第40天)，更多悬浮细胞出现(图1h,i)。形态上，这些悬浮细胞是小的、圆形和明亮的淋巴样细胞(图1g,i)；表型上，它们是散点图上的定义群体(图1k,l)；它们中的大部分是cd45⁺cd56⁺，但是cd3^-tcrαβ^-cd4^-cd8^-(图1k,l)，这是nk细胞典型的。因此，通过经历造血分化和淋巴定型，nk细胞可以衍生自hesc而不用富集cd34+细胞或形成旋转eb。

从ipsc产生nk细胞。

细胞培养.用补充了20％胎牛血清(fbs)(hyclone,logan,ut,http://www.hyclone.com)的α-mem(thermofisherscientific,waltham,ma,http://corporate.thermofisher.com)培养op9细胞(americantypeculturecollection[attc],manassas,va,http://www.atcc.org)和op9/g-dll1细胞(rikenbrccellbank,ibaraki,japan,http://cell.brc.riken.jp/en/)。

两阶段方案.在第一阶段，将op9细胞接种在0.1％明胶(stemcelltechnologies)包被的t75瓶上。当长满时，通过更换一半培养基对op9细胞培养物进行补料并过度生长4-6天。然后在补充了10％fbs的α-mem中于过度生长的op9细胞上接种1-1.5x10⁶个hesc并分化12天。每4天通过更换一半培养基对hesc/op9共培养物进行补料。在第二阶段，利用1mg/ml胶原酶iv(stemcelltechnologies)和trypleexpress(thermofisherscientific)从hesc/op9共培养物收获分化的细胞。通过塑料粘附45分钟去除op9细胞，并且通过100μm细胞过滤器(bdbiosciences)进一步去除细胞丛。然后利用包含10％fbs、10ng/mlscf(peprotech,rockyhill,nj,http://www.peprotech.com)、5ng/mlflt3l(peprotech)连同5ng/mlil-7(peprotech)和/或10ng/mlil-15(peprotech)的α-mem，将剩余的非粘附细胞与t75瓶上生长的op9-dll1共培养7天。此后，每周利用versene(thermofisherscientific)收获分化的细胞并且在6-孔板上生长的新op9-dll1上共培养，进行额外的3-4周。

从pbc-ipsc产生nk细胞.为了进一步促进在良好生产规范(gmp)下从hpsc产生nk细胞，重要的是用gmp相容的方便的hpsc来源。虽然hesc和产生自成纤维细胞或脐带血cd34+细胞的ipsc已用来衍生nk细胞，但是产生自外周血细胞的ipsc(pbc-ipsc)是一种新的、从制备角度来看更易接近和可行的选择。为了证实pbc-ipsc用于nk细胞产生的可行性，首先利用携带重新编程因子的sendai病毒载体从pbc产生ipsc系(图2a)，并在下文进行描述。这些获得的pbc-ipsc表现出典型的hpsc形态学和表型(图2a)。

然后，检查nk细胞产生的两阶段方案以确定所述方法是否仍适用于这些pbc-ipsc。利用pbc-ipsc#9系(图2b)，与op9共培养12-天之后衍生包含显著cd34+群体的分化的细胞(图2c)。不分选cd34+细胞，收获这些分化细胞并直接与op9-dll1共培养。第二次共培养之后(第26天)出现小cd45+cd56+群体；这个群体在第五次共培养之后(第47天)变得更明显，其包含61％的淋巴样细胞(图2e)。在整个分化过程中未观察到tcrαβ或cd3表达：在多能干细胞(图2b)、造血细胞(图2c)或淋巴样细胞(图2d,e)中均未观察到。此外，在淋巴样细胞中没有明显的cd4或cd8表达，证实两阶段方案也可以用于从pbc-ipsc产生nk细胞。

提高衍生自pbc-ipsc的nk细胞的纯度和产量.除了gmp相容的起始hpsc来源，进一步提高衍生自pbc-ipsc的nk细胞的纯度和产量会促进这种新nk细胞来源的生产和平移使用。为此，测试不同细胞因子以增强nk细胞定型(图2f)。结果(表1)显示在淋巴定型期间使用il-7连同scf和flt3l在分化的第40天带来61％的纯度，而产量为0.21x10⁶个cd56+cd45+细胞(来自53x10⁶个pbc-ipsc)；使用il-15增加纯度至99％，并且增加产量至0.75x10⁶；而联合使用il-7和il-15在第40天给出99％的纯度和7.93x10⁶的产量，在第47天这进一步增加至15x10⁶。

表1：细胞因子提高pbc-ipsc衍生的nk细胞的纯度和产量

从ipsc产生γδnkt细胞。

细胞培养.在matrigel(bdbiosciences,sandiego,ca,http://www.bdbiosciences.com)包被的6-孔板上用mtesr1(stemcelltechnologies,vancouver,bc,canada,http://www.stemcell.com)培养产生的ipsc系。细胞系：如atcc推荐地培养op9(美国典型培养物保藏中心[attc],manassas,va,http://www.atcc.org)。在补充了20％胎牛血清(fbs)(hyclone,logan,ut,http://www.hyclone.com)的α-mem(thermofisherscientific,waltham,ma,http://corporate.thermofisher.com)中培养细胞系op9-dll1(rikenbrccellbank,ibaraki,japan,http://cell.brc.riken.jp/en/)。

从gdt-ipsc产生γδt细胞.为了从gdt-ipsc产生γδt细胞，使用先前建立的两阶段方案(上文描述用于从ipsc产生nk细胞)。在第一阶段，在补充了20％fbs的α-mem中于过度生长的op9或op9-dll1细胞上接种1-1.5×10⁶个ipsc并分化12天。每4天通过更换一半培养基对共培养物进行补料。在第二阶段，利用1mg/ml胶原酶iv(stemcelltechnologies)和trypleexpress(thermofisherscientific)从共培养物收获分化的细胞。通过塑料粘附45分钟去除op9或op9-dll1细胞，并且通过100μm细胞过滤器(bdbiosciences)进一步去除细胞丛。然后利用包含20％fbs、10ng/mlscf(peprotech,rockyhill,nj,http://www.peprotech.com)、5ng/mlflt3l(peprotech)连同5ng/mlil-7(peprotech)和/或10ng/mlil-15(peprotech)的α-mem将剩余的非粘附细胞与t75瓶上生长的op9-dll1细胞共培养7天。此后，每周利用versene(thermofisherscientific)收获分化的细胞并且与在6-孔板上生长的新op9-dll1细胞共培养，进行额外的3-4周。

为了产生γδt细胞，先前描述的以上方案用于从ipsc产生nk细胞以分化下文描述的γδt细胞衍生的gdta/nf-ipsc#1系。在分化的第33天，观察到同质淋巴群体(图3a)，其中53％是γδtcr+cd3+(图3b)。这些γδtcr+cd3+细胞中的大多数还是vγ9vδ2+(图3c)和cd56+(图3d)，表明这些ipsc衍生的γδt细胞仅仅(exclusively)是可能具有nk细胞样表型的vγ9vδ2子集。这个结果与53％的淋巴群体是cd3+cd56+而45％是cd3-cd56+(图3e)且54％是vδ2+(图3f)的发现非常符合。在第47天，淋巴群体变得更明显(图3g,m)。更多γδtcr+cd3+细胞出现(图3h)，其保留vγ9vδ2+(图3i)和cd56+(图3j)。通过cd3+cd56+群体和vδ2+群体的增加以及cd3-cd56+群体的减少(图3k,l)进一步证实这种变化。同样地，当利用非t细胞衍生的gdta/nf-ipsc#3用于分化时，在第47天仍观察到明显的淋巴群体(图3n)；但是，这个群体是cd3-cd56+(图3p)，并且没有观察到γδtcr+cd3+细胞(图3o)或vδ2+细胞(图3q)。这些发现强烈表明发生了从γδt细胞衍生的ipsc系产生cd56+vγ9vδ2t细胞。

模拟的先天免疫细胞的表征

模拟的nk细胞

流式细胞术.为了研究hpsc分化期间表型的变化，收获细胞，利用抗cd34、cd43、cd45、cd56、tcrαβ、cd3、cd4、cd8、nkp44、nkp46、nkg2d、cd16、nkg2a、cd94、cd158e1/e2、cd158i、cd158a,h抗体(bdbiosciencesandbeckmancoulter,https://www.beckmancoulter.com)染色并用facscalibur流式细胞仪(bdbiosciences)分析。

elispot测定.为了检测ifn-γ分泌，使用人ifn-γelispotpro试剂盒(mabtech,nackastrand,sweden,https://www.mabtech.com)。简单地说，将0-10x104个pbc-ipsc衍生的nk细胞和5x104个k562或raji细胞在ifn-γelispot平板上共温育过夜。根据制造商的使用手册染色ifn-γ斑点。为了测量grb分泌，使用人颗粒酶belispot试剂盒(r&dsystems,minneapolis,mn,https://www.rndsystems.com)。简单地说，将0-1.2x104个pbc-ipsc衍生的nk细胞在人grb微孔板上用或不用5x104个k562细胞温育4小时。然后如制造商的使用手册所述染色grb斑点。利用immunospot分析仪(ctl,shakerheights,oh,http://www.immunospot.com)计数ifn-γ和grb斑点。

利用il7和il15细胞因子组合产生的nk细胞.利用优化的细胞因子组合，从pbc-ipsc#9衍生了高纯度淋巴样细胞(图4)。这些细胞表现出典型的nk细胞形态学(图4a)。如细胞图像(图4a)和散点图(图4b)所示，它们是同质群体。它们中大多数是cd56+cd45+cd3-，典型的nk细胞表型(图4b)。这些细胞还表达激活受体如nkp30、nkp44、nkp46和nkg2d以及抑制受体如cd94:nkg2a(图4b)。它们还是cd16+(图4b)，这对于nk细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)是重要的。在杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)方面，它们显示没有或低表达kir2dl1、kir2dl4、kir2dl5、kir3dl1、kir2ds1、kir2ds4和kir3ds1。仅一小部分细胞被cd158b(18％)或cd158e/k(13％)抗体染色，提示大多数nk细胞是kir2dl2、kir2dl3、kir3dl1和kir3dl2阴性的(图4b)。这种抑制性kir-阴性表型可能有利于这些nk细胞的细胞毒性。因此，利用优化的两阶段方案可以持续从pbc-ipsc产生大量高纯度nk细胞。

模拟的γδnkt细胞

流式细胞术.为了研究ipsc分化期间的表型变化，收获细胞，利用抗cd3、cd56、γδtcr、vδ2tcr、vγ9tcr、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2d、nkg2a、cd94、cd16、fasl、trail、dnam-1、cd158a,h(kir2dl1/s1)、cd158b(kir2dl2/l3/s2)、cd158f(kir2dl5)、cd158i(kir2ds4)、cd158e1/e2(kir3dl1/s1)和cd158e/k(kir3dl1/l2)抗体(bdbiosciences；beckmancoulter,https://www.beckmancoulter.com；miltenyibiotec,http://www.miltenyibiotec.com)染色并用facscalibur流式细胞仪(bdbiosciences)分析。

供体衍生的pb-nk细胞的扩增.为了衍生pb-nk细胞，利用垂直位置的t75瓶将2×10⁶个来自健康供体的pbmc与4×10⁶个经γ-辐照(100gy)的k562-mbil15-41bbl细胞在补充了10％fbs和50iu/mlil-2的cellgroscgm不含血清的培养基中共培养。每2-3天用新鲜培养基更换一半培养基并补充新鲜il-2直至第7天。此后，将2×10⁶个细胞每周用2×10⁶个k562-mbil15-41bbl细胞重新刺激另外两周。在第21天收获细胞用于实验。

cd56是nk细胞的典型表面标记。为了查明这样产生的ipsc衍生的模拟的γδt细胞(ipsc-γδt细胞)是否还表达nk细胞的其他表面分子，进行详细的表型分型(图5a)。流式细胞术分析显示大多数ipsc-γδt细胞高表达激活受体：nkg2d和dnam-1；天然细胞毒性受体(ncr)：nkp30、nkp44和nkp46；以及死亡诱导配体：trail(图5a)。此外，41％表达cd16，介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)的表面分子；5％表达fasl，另一死亡诱导配体(图5a)。ipsc-γδt细胞的这种表面分子表达谱非常像扩增的外周血nk(pb-nk)细胞(图5c)，其具有低水平trail表达。相比之下，虽然扩增的外周血γδt(pb-γδt)细胞还表达nkg2d和dnam-1，但是它们不表达ncr、死亡诱导配体和cd16(图5b)。在抑制受体和杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)方面，ipsc-γδt细胞像pb-nk细胞和pb-γδt细胞一样表达cd94/nkg2a受体；但是，与pb-nk细胞和pb-γδt细胞不同，ipsc-γδt细胞不表达kir(图6a-c)，这使得它们不受受体hla表型限制。因此，ipsc-γδt细胞装备有pb-γδt细胞和pb-nk细胞中观察到的两组“抗癌”分子，并且这类新的gdt-ipsc衍生的“γδnkt细胞”可以对抗广谱的癌细胞。

利用模拟的先天免疫细胞的癌症免疫疗法

用模拟的nk细胞治疗

细胞培养.用补充了10％fbs的rpmi1640(thermofisherscientific)培养k562细胞(atcc)、k562-mb15-41bbl细胞(由prof.dariocampana,departmentofpaediatrics,nationaluniversityofsingapore,singapore友好提供)和raji细胞(atcc)。

细胞毒性和adcc测定.为了检测pbc-ipsc衍生的nk细胞对靶细胞的直接细胞毒性，使用流式细胞术方法。简单地说，将0-0.5x10⁶个nk细胞与2x10⁴个羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(cfse；thermofisherscientific)标记的k562或raji细胞共培养4-6小时。然后将样品用7-氨基-放线菌素d(7-aad,bdbiosciences)在冰上染色10分钟。洗涤之后，通过facscalibur流式细胞仪基于cfse阳性群体中7-aad染色细胞的百分比评价靶细胞死亡。为了评价pbc-ipsc衍生的nk细胞的adcc功能，在各种浓度的人igg1(sigma-aldrich)、抗cd20-migg1(invivogen,sandiego,ca,http://www.invivogen.com)或抗cd20-higg1(invivogen)的存在下建立nk细胞和cfse标记的raji细胞的共培养物，如上文所述通过流式细胞仪测量靶细胞死亡。

pbc-ipsc衍生的nk细胞的功能.在激活时分泌细胞因子如干扰素-γ(ifn-γ)是nk细胞的重要功能特征。为了研究ifn-γ分泌，将pbc-ipsc衍生的nk细胞与刺激细胞共培养，然后酶联免疫斑点(elispot)测定用来检测分泌ifn-γ的nk细胞。如图7a和7b所示，nk细胞敏感细胞系k562有效刺激衍生自pbc-ipsc#9的nk细胞的ifn-γ分泌；相反，nk细胞抗性细胞系raji显示效率低得多，表明这些pbc-ipsc衍生的nk细胞能够应答刺激分泌细胞因子。

细胞毒性是nk细胞的另一标志性特征，其取决于细胞毒性分子如颗粒酶b(grb)的分泌。elispot结果显示高频率的pbc-ipsc衍生的nk细胞在通过k562刺激时分泌grb(图7c,d)，这进一步证实这些ipsc衍生的nk细胞的功能性能力。更重要的是，这些ipsc衍生的nk细胞表现出与原代nk细胞相似的直接杀死谱。如图7e和7f中证实的，它们能够直接杀死nk敏感的白血病细胞k562，但不能杀死nk不敏感的淋巴瘤细胞raji。有趣的是，通过利用这些ipsc衍生的nk细胞的adcc功能，仍能够杀死raji细胞(图7g,h)。如图7g和7h所示，单独的nk细胞不能杀死raji细胞；添加人igg1或抗cd20-migg1也不能；但是，在抗cd20-higg1的存在下，观察到明显的对raji细胞的细胞毒性。因此，这些pbc-ipsc衍生的nk细胞的adcc功能可以显著扩大它们的恶性细胞杀死谱。

用模拟的γδnkt细胞治疗

细胞培养.如atcc推荐地培养细胞系：sk-ov-3、sw480、mcf-7和bt474(americantypeculturecollection[attc],manassas,va,http://www.atcc.org)。

细胞毒性测定.为了检测ipsc衍生的γδnkt细胞对靶细胞的细胞毒性，使用基于流式细胞术的方法。简单地说，将0-0.5×10⁶个γδnkt细胞与2×10⁴个羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(cfse；thermofisherscientific)标记的癌细胞以各种效应子比靶标(e:t)比例共培养4-6小时。然后将样品用7-氨基-放线菌素d(7-aad,bdbiosciences)在冰上染色10分钟。洗涤之后，用流式细胞仪通过cfse阳性群体中7-aad染色细胞的百分比评价靶细胞死亡。

为了测试γδnkt细胞的细胞毒性，将4种不同的实体瘤细胞系用作靶细胞：mcf7(乳腺癌)、sw480(结肠直肠腺癌)、bt474(乳腺导管癌)和sk-ov-3(卵巢腺癌)。结果显示γδnkt细胞能够杀死这些癌细胞系(图8)。在某些情况下，甚至在非常低的e:t比例下观察到细胞毒性(图8)，表明γδnkt细胞的高效力。

从外周血细胞产生ipsc

从pbc产生ipsc.为了从pbc产生ipsc，将来自健康供体的冷冻外周血单个核细胞(pbmc)(stemcelltechnologies)解冻并在完全rpmi1640培养基中用5μg/ml植物凝集素(pha；sigma-aldrich,stlouis,mo,http://www.sigmaaldrich.com)培养2天，完全rpmi1640培养基由rpmi1640(thermofisherscientific)、10％热灭活的人血清ab(geminibio-products,westsacramento,ca,http://www.gembio.com)、2mml-谷氨酰胺(thermofisherscientific)、0.1mm非必需氨基酸(thermofisherscientific)和0.1mm2-巯基乙醇(thermofisherscientific)组成。然后将培养的血细胞在包含10ng/ml的il-2、il-7和il-15的完全rpmi1640培养基中用来自cytotuneips2.0sendai重新编程试剂盒(thermofisherscientific)的sendai重新编程载体以5:5:3的moi(kos,hc-myc,hklf4)转导过夜。然后将转导的细胞洗涤并培养5天，之后接种至丝裂霉素c(sigma-aldrich)处理的小鼠胚胎成纤维细胞(mef)生长的6-孔板。用ipsc培养基接种之后第1-3天更换一半培养基，ipsc培养基由dmem/f12(thermofisherscientific)、20％敲除血清替代物(thermofisherscientific)、2mml-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、0.1mm2-巯基乙醇和5ng/ml基本成纤维细胞生长因子(peprotech)组成。接种之后3-4周，将所得ipsc首先在ipsc培养基中的mef上扩增，然后在matrigel包被的平板上于mtesr1中扩增。

免疫染色.为了检测多能性标记，将pbc-ipsc在4％多聚甲醛(sigma-aldrich)中于室温下固定15min，然后用5％牛血清白蛋白封闭1小时。然后将细胞用抗ssea-4、tra-1-60、tra-1-81的一抗(thermofisherscientific)在室温下温育1小时。洗涤之后，将细胞用alexafluor594缀合的山羊抗小鼠igg(h+l)抗体(thermofisherscientific)在室温下温育1小时以在荧光显微镜下可视化。为了检测碱性磷酸酶(ap)，根据制造商的方案使用碱性磷酸酶活性染色(thermofisherscientific)。为了证实pbc-ipsc用于nk细胞产生的可行性，首先产生利用携带重新编程因子的sendai病毒载体的来自pbc的ipsc系(图2a)。这些所得pbc-ipsc表现出典型的hpsc形态学和表型(图2a)。

γδt细胞的扩增.为了扩增γδt细胞用于ipsc产生，将来自健康供体的冷冻pbmc(stemcelltechnologies)解冻并在包含5μmzometa(novartis)的pbmc培养基[补充了10％热灭活的人ab血清(geminibio-products,westsacramento,ca,http://www.gembio.com)和10ng/mlil-2(thermofisherscientific)的optmizerctst-cellexpansionsfm(thermofisherscientific)]中培养。每2-3天用没有zometa的新鲜pbmc培养基更换一半培养基。

gdt-ipsc的产生.为了从扩增的γδt细胞产生ipsc，在第7天将培养的pbmc用来自cytotuneips2.0sendai重新编程试剂盒(thermofisherscientific)的sendai重新编程载体以5:5:3的moi(kos,hc-myc,hklf4)转导过夜。然后将转导的细胞洗涤并培养5天，之后接种至丝裂霉素c(sigma-aldrich)处理的mef生长的6-孔板。用ipsc培养基接种之后第1-3天更换一半培养基，ipsc培养基由dmem/f12(thermofisherscientific)、20％敲除血清替代物(thermofisherscientific)、2mml-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、0.1mm2-巯基乙醇和5ng/ml基本成纤维细胞生长因子(peprotech)组成。接种之后3-4周，挑出所得ipsc集落并在matrigel包被的板上于mtesr1中扩增。

为了利用非病毒方法从γδt细胞产生ipsc，如上文所述用zometa和il-2培养pbmc并在第7天或第13天使用。在第0天，利用amaxanucleofector2b(lonza,http://www.lonza.com)通过核转染(nucleofection)将来自epi5游离型ipsc重新编程试剂盒(thermofisherscientific)的游离型重新编程载体递送至培养的pbmc中。然后将核转染的细胞接种在丝裂霉素c灭活的mef上。在第2天，使细胞适应pbmc培养基:ipsc培养基的1:1混合物。从第3天开始，将细胞在ipsc培养基中培养，每隔一天更换ipsc培养基。接种之后2-4周，挑出ipsc集落并在matrigel包被的板上于mtesr1中扩增。

tcrb和tcrg基因克隆性测定.利用dneasy血液和组织试剂盒(qiagen,https://www.qiagen.com)根据制造商的说明书从ipsc分离基因组dna。为了检测基因组dna中的tcrβ和tcrγ基因重排，用tcrb和tcrg基因克隆性测定试剂盒(invivoscribetechnologies,sandiego,ca,http://www.invivoscribe.com)中提供的预混液和amplitaqgolddna聚合酶(thermofisherscientific)利用以下程序进行pcr：95℃持续7分钟；35个扩增循环(95℃持续45秒，60℃持续45秒，72℃持续90秒)；以及72℃持续10分钟的最终延伸，然后保持在15℃。在2％metaphor琼脂糖(lonza,http://www.lonza.com)凝胶中通过电泳分离pcr产物。

为了激活和扩增γδt细胞用于ipsc产生，利用zometa和il-2培养来自健康供体的外周血单个核细胞(pbmc)。pbmc培养物中的总细胞数量和细胞丛随时间增加(图9a)，表明γδt细胞成功扩增。流式细胞术分析进一步证实在7-天培养物中多达61％的淋巴细胞是γδt细胞(图9b)。然后将这种富含γδt细胞的pbmc培养物用于ipsc产生。

为了从γδt细胞衍生ipsc系，使用两种重新编程方案。在一个方案中，最初使用携带重新编程因子基因的无整合的sendai病毒载体以转导培养的pbmc。如转导之后第6天观察到的，大多数转导的细胞存活(图10a)。然后将这些细胞接种在丝裂霉素c处理的小鼠胚胎成纤维细胞(mef)上。ipsc集落(图10b)最早在接种之后9天开始出现。可以在接种之后3周挑出这些集落并直接在matrigel包被的平板上于mtesr1培养基中扩增(图10c)。

在另一方案中，核转染用来递送游离型重新编程载体至培养的pbmc中并建立3个ipsc系：gdta/nf-ipsc#1、gdta/nf-ipsc#2和gdta/nf-ipsc#3(图10d-f)。为了鉴定衍生自γδt细胞的ipsc系，进行tcrg基因克隆性测定(图10g)和tcrb基因克隆性测定。由于存在重排的tcrg基因，证实两个ipsc系gdta/nf-ipsc#1和gdta/nf-ipsc#2衍生自γδt细胞，而一个ipsc系gdta/nf-ipsc#3来自非t细胞，因为不存在重排的tcrb和tcrg基因。如非t细胞衍生的gdta/nf-ipsc#3，γδt细胞衍生的gdta/nf-ipsc#1和gdta/nf-ipsc#2不表达γδtcr和cd3(图9h)，表明γδt细胞的完全重新编程。

第一次证实从γδt细胞衍生ipsc以及利用这类γδt细胞衍生的ipsc(gdt-ipsc)产生γδt细胞。此外，通过组合这些新gdt-ipsc系与上文描述的从ipsc产生nk细胞的分化方案，产生了高表达nk细胞的“抗癌”分子的γδt细胞并将这种独特的细胞类型命名为“γδ自然杀伤t(nkt)细胞”。

模拟的先天免疫细胞的扩增

新鲜和冻存的pbc-ipsc衍生的nk细胞的扩增.产生足够的功能性细胞是将这些ipsc衍生的nk细胞转化为临床应用的前提。从ipsc获得治疗规模的nk细胞的一种可能方式是扩大规模的分化培养，但是，这是不划算的。更实用的方式是利用饲养细胞扩增ipsc衍生的nk细胞。为了研究这种可能性，将各种数量的产生自pbc-ipsc#9的nk细胞与辐照的k562-mb15-41bbl细胞以1:10的nk细胞:饲养细胞比例在透气的g-rex10瓶中共培养。结果显示这些ipsc衍生的nk细胞在14-天共培养期间快速扩增(图11a,b)。用10⁶的起始nk细胞数量，在第9天观察到74-倍扩增，虽然通过延长共培养至14天未实现进一步扩增(图11a)。有趣的是，虽然表型没有明显变化，除了cd16表达的下调(图11c)，但是这些扩增的nk细胞在杀死k562细胞中变得更有力(图11d)，可能是由于它们在扩增期间的进一步功能成熟。这些数据表明通过用饲养细胞扩增产生临床规模的功能性ipsc衍生的nk细胞是可行的。

从集中的制备地点运输细胞治疗剂至临床地点用于注射而不影响产品质量对于活细胞产品的临床效力至关重要。运输冻存形式的常规nk细胞产品可以显著降低nk细胞的生存力和效力。这对于pbc-ipsc衍生的nk细胞也是事实(图11e,g)。冻/融过程显著影响扩增的pbc-ipsc衍生的nk细胞的生存力(图11e)，虽然这些扩增的nk细胞的效力在冻/融过程之后在一定程度上保存下来(图11g)。为了克服冻存引起的这些生存力和效力问题，建议一种可能的解决方法：在集中的制备地点在扩增之前首先将pbc-ipsc衍生的nk细胞冻存并以冻存形式运输至临床地点；然后将这些冻存的nk细胞解冻，扩增并在临床地点注射。这种解决方法的可行性取决于扩增冻存的nk细胞的能力。如图11f所示，冻存的nk细胞保持高度可扩增性；从10⁶个冻存的nk细胞开始，在第9天仍可以达到38.5-倍扩增。更重要的是，这些扩增的冻存nk细胞表现出与扩增自非冻存的新鲜nk细胞的那些可比的细胞毒性效力(图11g)。这些结果表明运输扩增前的nk细胞是pbc-ipsc衍生的nk细胞治疗剂的物流的实用解决方法。

产量高达15x10⁶个nk细胞每3x10⁶个pbc-ipsc，具有99％纯度。利用饲养细胞系，这些pbc-ipsc衍生的nk细胞可以在9天中扩增74-倍，以及在冻存之后扩增38.5-倍。如增加的对k562细胞的细胞毒性所示，这些扩增的nk细胞在功能上变得更有效。因此，证实了利用工业相容性生产方案从pbc-ipsc产生nk细胞治疗剂的可行性。

本领域技术人员应当进一步理解上述特征的变化和组合，不是可选物或替代物，可以组合形成本发明的预定范围内的进一步的实施方案。

序列表

<110>新加坡科技研究局

曾洁铭

王朔

<120>从多能干细胞产生模拟的先天免疫细胞的方法和试剂盒

<130>2018.p00972

<150>sg10201700937p

<151>2017-02-07

<150>sg10201705582s

<151>2017-07-06

<160>15

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<210>1

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<400>1

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<212>dna

<213>homosapiens

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<212>prt

<213>homosapiens

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ilecysleuproglycysaspgluglnhisglyphecysasplyspro

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thrgluval

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<212>prt

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leu

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alaserthrtrpgluglyargargargleuasnthrglnthrleu

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