聚乙烯醇降解酶和其制造方法与流程

本发明涉及聚乙烯醇降解酶和其制造方法，详细而言，涉及新颖的聚乙烯醇降解酶及其制造方法、编码该酶的dna、以及包含该dna的重组dna和转化体。

背景技术：

聚乙烯醇(以下简称“pva”。)是对使乙酸乙烯酯单体聚合而得到的聚合物即聚乙酸乙烯酯进行皂化(碱水解)而得到的水溶性聚合物，粘接性、粘结性、成膜性、被膜性、表面活性优异且具有高的化学稳定性，因此作为维尼纶纤维、纤维施胶剂、纸加工剂、粘接剂、膜和聚合助剂等的原料在工业上被广泛使用。其中，在纤维施胶剂等用途中需要在使用后除去pva，由于除去pva时使用大量的水和试剂等，因此对成本的影响、给环境造成的负荷大。pva是合成高分子，因此具有在自然界中不易降解的缺点。

作为降解pva的手段，已大量报道了从用于处理含pva的工厂废液的活性污泥中分离具有pva降解能力的微生物、并且用该微生物来降解pva的尝试。作为具有pva降解能力的微生物，专利文献1至5等中公开了假单胞菌、不动杆菌属、鞘脂单胞菌属(以前分类为鞘氨醇单孢菌或假单胞菌)、丛毛单胞菌属(紫色细菌、光合细菌)、微杆菌属、肠杆菌属、棒状杆菌属、红球菌属、乳酪杆菌属、黄单孢菌属、奈瑟氏菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、埃希氏菌属、气杆菌属、产碱杆菌属、农杆菌属、节杆菌属、类芽孢杆菌属、心杆菌属、链霉菌属、极地杆菌属(以前分类为类固醇杆菌(steroidobacter))、海旋菌(thalassospira)等细菌，另外还公开了青霉菌、地霉类、担子菌类。

据报道，利用微生物进行的pva降解一般通过氧化pva的酶和将氧化后的pva水解的酶的共同作用而进行(非专利文献1)。图1示意性示出pva的酶解机制。由图1可看到，作为氧化pva的酶，已知有pva氧化酶(pvaoxydase，也称为“仲醇氧化酶(secondaryalcoholoxidase)”。)、以吡咯喹啉醌(pqq)为辅酶的pva脱氢酶(pvadehydrogenase，pvadh)这两种，另一方面，作为将氧化后的pva水解的酶，已知有氧化pva水解酶(氧化pva脱氢酶(oxidizedpvahydrolase、oph)，也称为“β-二酮水解酶”。)。

关于假单胞菌属微生物来源的仲醇氧化酶(pva氧化酶)和氧化pva水解酶，1970年代后期至1980年代前期已分别报道了酶的纯化和其性质(非专利文献2和3)、pva氧化酶被表征为分子量约50,000的单体多肽，而氧化pva水解酶被表征为分子量约38,000的单体多肽。进一步地，还报道了使用特定的色谱用载体高效地分离纯化pva氧化酶和氧化pva水解酶的方法(非专利文献4)。另外，专利文献6公开了由假单胞菌属微生物的培养液制备的“酶组合物”，并且记载了包含能够氧化pva的酶和能够将氧化后的pva水解的酶的该“酶组合物”可以用于在修复包含pva的文物(日文：文化財)时去除pva。关于以pqq为辅酶的pva脱氢酶，多种微生物来源的酶的氨基酸序列已经明确(专利文献7、非专利文献5)，关于氧化pva水解酶，假单胞菌属微生物来源的酶的氨基酸序列(参照专利文献3)及其立体结构已经明确(非专利文献6)。另一方面，pva氧化酶作为多肽而纯化到单体水平、并且阐明理化学性质的报道例子较少，而具体的氨基酸序列等则完全没有报道。因此，参与pva降解的现有公知的酶或酶组的不明之处较多，其本体已明确到足以稳定且高效地以工业规模进行pva降解的pva降解酶尚属未知。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特开2004-000259号公报

专利文献2:日本特开2005-278639号公报

专利文献3:日本特开2006-042611号公报

专利文献4:日本特开2006-042612号公报

专利文献5:日本特开2006-180706号公报

专利文献6:日本专利第5891478号公报

专利文献7:日本特开平09-206079号公报

非专利文献

非专利文献1:matsumura等，『macromolecules』、32卷、7753-7761页(1999年)

非专利文献2:morita等，『agric.biol.chem.』，第43卷、1225-1235页(1979年)

非专利文献3:sakai等，『agric.biol.chem.』，第45卷、63-71页(1981年)

非专利文献4:sakai等，『agric.biol.chem.』，第47卷、153-155页(1983年)

非专利文献5:shimao等，『biosci.biotechnol.biochem.』、60卷、1056-1062页(1996年)

非专利文献6:yang等，『chembiochem.』、15卷，1882-1886页(2014年)

技术实现要素：

发明所要解决的课题

本发明的课题在于，提供其本体在氨基酸序列水平上已经明确的新颖的pva降解酶，并且提供其制造方法、编码该酶的dna、包含该dna的重组dna和转化体，从而有助于以工业规模稳定且高效地降解pva。

用于解决课题的手段

为了解决上述课题，本发明人们对产生参与pva降解的酶的微生物反复进行了研究，以期得到新颖的pva降解酶。在该过程中发现，一直以来已知产生pva氧化酶、氧化pva水解酶的假单胞菌(pseudomonassp.)vt1b株(nbrc110478)意外地产生一种同时具有pva氧化活性和氧化pva水解活性两者而可以作为杂化酶独自降解pva的、全新的pva降解酶。然后明确了该pva降解酶的氨基酸序列以及诸性质并建立了其制造方法，另外建立了编码该酶的dna以及包含该dna的重组dna和转化体，从而完成了本发明。

即，本发明提供具有下述(1)至(3)的特征的新颖的pva降解酶，并且提供该酶的制造方法、编码该酶的dna以及包含该dna的重组dna和转化体，从而解决上述课题：

(1)具有氧化pva、生成过氧化氢的活性；

(2)具有水解β-二酮的活性；和

(3)在sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示100,000±20,000的分子量。

发明的效果

根据本发明，可以提供其本体在氨基酸序列水平以及dna水平已经明确的新颖的pva降解酶和其制造方法，因此得到下述优点：工业化地或以工业规模更高效、稳定地进行降解酶的产生以及pva的降解。另外，该pva降解酶是同时具有pva氧化活性和氧化pva水解活性这两者的杂化酶，无需与其它酶组合使用，可以独自高效地氧化和降解pva，因此具有使用方便的优点。因此，本发明所提供的新颖的pva降解酶不仅可以用于pva降解，还可以有效用于含pva制品的改性、改良等与pva有关的广泛领域。

附图说明

图1是示意性示出基于pva氧化酶和氧化pva水解酶的共同作用的pva降解机制的图。

图2是pva降解酶的纯化标品的sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图3是示出pva降解酶的纯化标品pva-a的pva氧化活性的最适温度的图。

图4是示出pva降解酶的纯化标品pva-a的pva氧化活性的最适ph的图。

图5是示出pva降解酶的纯化标品pva-a的pva氧化活性的温度稳定性的图。

图6是示出pva降解酶的纯化标品pva-a的pva氧化活性的ph稳定性的图。

图7是示出本发明的pva降解酶的n末端侧前半部的氨基酸序列与公知的pva脱氢酶的同源性的调查结果的图。

图8是示出本发明的pva降解酶的c末端侧后半部的氨基酸序列与公知的氧化pva水解酶的同源性的调查结果的图。

图9是示意性示出pva降解酶、pva-a和pva-b的结构的图。

图10是示出包含编码pva降解酶pva-a的dna的可自主复制的重组dna“prseta-pva-a”的结构的示意图。

图11是示出使pva降解酶pva-a作用于底物pva而得到的pva降解物的凝胶过滤色谱图。

具体实施方式

本发明为具有下述(1)至(3)的特征的新颖的pva降解酶：

(1)具有氧化pva、生成过氧化氢的活性；

(2)具有水解β-二酮的活性；和

(3)在sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示100,000±20,000的分子量。

如上述(1)所示，本发明的pva降解酶具有对氧化作为底物的pva、并生成过氧化氢的反应进行催化的活性、即pva氧化活性。pva氧化活性例如可以通过以下方法来测定。

＜pva氧化活性的测定方法＞

向将pva(试剂级聚乙烯醇、聚合度2,000、nacalaitesque株式会社销售)以2％(w/v)的浓度溶解于100mm磷酸钠缓冲液(ph7.0)而成的底物溶液0.5ml中添加2％(w/v)的叠氮化钠溶液15μl，向其中添加酶液0.5ml，在27℃下边振荡60分钟边进行反应。反应后，将反应液0.32ml与钛试剂0.8ml混合而终止反应，以410nm的吸光度(a410)为指标测定由酶反应生成的过氧化氢与钛试剂进行反应所产生的黄色显色。另行向底物溶液中添加酶液，立即与钛试剂混合并同样进行测定，将所得的值作为反应0分钟的值，基于下式求出所生成的过氧化氢的量，计算pva氧化活性。顺便说明一下，已知当生成3.65微摩/ml的过氧化氢时，410nm的吸光度(a410)变为“1”，因此下述式1中在吸光度的变化量上乘以“3.65”的系数。pva氧化活性的1单位定义为：在上述条件下1分钟生成1微摩的过氧化氢的酶量。需要说明的是，钛试剂是将硫酸钛(iv)溶液(5％、nacalaitesque株式会社销售)用10％(w/w)硫酸稀释25倍而制备的。

式1：

[数1]

另外，如上述(2)所示，本发明的pva降解酶具有水解β-二酮的活性、即β-二酮水解活性。具有β-二酮水解活性的酶可以水解具有β-二酮结构的氧化后的pva(氧化pva)。β-二酮水解活性可以通过调查作为具有β-二酮结构的氧化pva的模型化合物的2,4-戊二酮的水解来确认。pva降解酶水解2,4-戊二酮而生成丙酮和乙酸。因此，可以使用2,4-戊二酮作为底物，通过例如下述方法确认β-二酮水解活性。

＜β-二酮水解活性的确认方法＞

以将2,4-戊二酮(试剂，和光纯药工业株式会社销售)制备成0.2％(w/v)的浓度的50mm磷酸钠缓冲液(ph7.0)1ml为底物溶液，向其中添加酶液0.2ml、50mm磷酸钠缓冲液(ph7.0)0.8ml，在27℃下振荡反应3小时。反应后，将2ml的反应液分注到玻璃小瓶中，密闭，95℃下加热40分钟，收取小瓶中的气体1ml供于下述的气体色谱(gc)分析，从而检测作为2,4-戊二酮的水解产物的丙酮。将可观察到丙酮的生成的酶液判定为“有β-二酮水解活性”。

(gc条件)

装置：gc-2010plus(株式会社岛津制作所制)

色谱柱：db-5(partnumber.122-5032)(agilenttechnology株式会社制)

气化室温度：150℃；注入模式：分流；

载气：氦；

控制模式：线速度压力：114.6kpa

总流量：12.6ml/分钟柱流量：1.6ml/分钟

线速度：35.0cm/秒吹扫流量：3.0ml/分钟

分流比：5.0

柱温：40℃；平衡时间：1.0分钟；

柱温程序：在柱温40℃下保持5分钟后，用12分钟以5℃/分钟升温到100℃，然后用15分钟以10℃/分钟升温到250℃后，在250℃下保持3分钟

检测器：fid；检测器温度：260℃；

本发明的pva降解酶由于同时具有上述的pva氧化活性(特征(1))和β-二酮水解活性(特征(2))而具有pva降解活性，单独即可作为pva降解酶起作用，例如可以通过下述方法以伴随pva降解的pva溶液的粘度降低为指标来测定作为pva降解酶的活性。

＜pva降解活性(粘度降低活性)的测定方法＞

向将pva(试剂级聚乙烯醇、聚合度2,000、nacalaitesque株式会社销售)以2％(w/v)的浓度溶解于100mm磷酸钠缓冲液(ph7.0)而成的底物溶液0.5ml中添加2％(w/v)的叠氮化钠溶液15μl，向其中添加酶液0.5ml，在27℃下边振荡60分钟边进行反应。反应后，使用反应液0.6ml，用锥板型粘度计(商品名『dv-ii+pro』、brookfield公司制)在30℃下测定粘度。另行向底物溶液中添加酶液，立即进行测定，将得到的粘度作为反应0分钟的粘度，基于下式即使pva降解活性。pva降解活性的1单位定义为：在上述条件下1分钟导致降低10％的相对粘度的酶量。

式2：

[数2]

其中，相对粘度降低率(％)＝{(v0-v60)/(v0-vw)}×100

v0:反应0分钟的粘度

v60:反应60分钟的粘度

vw:水的粘度

进一步地，本发明的pva降解酶通常具有上述(3)所示的特征、即在sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)中显示100,000±20,000的分子量的特征。

另外，作为本发明的pva降解酶的优选的一方式，可列举在pva氧化活性方面具有下述(4)至(7)的酶学性质的酶：

(4)最适温度

在ph7.0、60分钟的反应条件下为35至40℃；

(5)最适ph

在27℃、60分钟的反应条件下为ph6.5至8.0；

(6)温度稳定性

在ph7.0、保持60分钟的条件下，截至45℃时稳定；和

(7)ph稳定性

在4℃、保持24小时的条件下，在ph4.5至10.5下稳定。

进一步地，作为本发明的pva降解酶的更优选的一方式，可列举还具有下述(8)的特征的酶：

(8)作为n末端氨基酸序列，具有序列表中的序列号1所示的氨基酸序列。

本发明的pva降解酶通常作为多肽具有规定的氨基酸序列，作为其优选例，可列举例如序列表中的序列号2或3所示的氨基酸序列或与它们同源的氨基酸序列。作为具有与序列表中的序列号2或3所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列的酶，可列举在保持氧化pva、生成过氧化氢的活性和分解β-二酮的活性的范围内具有在序列号2或3所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加1个以上的氨基酸的氨基酸序列的酶，优选具有相对于序列表中的序列号2或3所示的氨基酸序列具有通常84％以上、期望90％以上、进一步期望95％以上的同源性(序列一致性)的氨基酸序列的酶。

作为本发明的pva降解酶的氨基酸序列而例示的、序列表中的序列号2或3所示的氨基酸序列如后述实验部分所述均为具有如下的特征性结构的氨基酸序列，所述特征性结构为：在氨基酸序列的n末端侧前半部存在与公知的pva脱氢酶显示同源性的区域，另外在c末端侧后半部存在与公知的氧化pva水解酶显示同源性的区域。具有这种特征性的氨基酸序列的发现启示了如下可能性：本发明的pva降解酶作为杂化酶、在该多肽通过n末端侧前半部氧化pva、在c末端侧后半部将氧化pva水解。

需要说明的是，如后述实验部分也示出那样，已经在假单胞菌vt1b株的培养液中实际观察到了来自多肽的n末端侧前半部的pva氧化酶片段和来自多肽的c末端侧后半部的氧化pva水解酶片段，因此已证实了本发明的pva降解酶作为杂化酶起作用，在该n末端侧前半部和该c末端侧后半部分别存在pva氧化酶和氧化pva水解酶。这表明：根据需要，可以将本发明的pva降解酶人为地用蛋白酶等进行限制性降解，从而分别制备pva氧化酶和氧化pva水解酶。

虽然本发明的pva降解酶不因其来源而受到限制，但是作为优选的来源，可列举属于假单胞菌属的微生物，优选使用本发明人所发现的微生物、假单胞菌(pseudomonassp.)vt1b株或其变异株。

本发明的dna是指：具有编码上述本发明的pva降解酶的氨基酸序列的碱基序列的dna总体。本发明的dna只要具有编码本发明的pva降解酶的氨基酸序列的碱基序列即可，其可以是天然来源的也可以是人工合成的。作为天然来源，可列举例如包括假单胞菌vt1b株在内的假单胞菌属的微生物，可以由这些菌体得到包含本发明的dna的基因组dna。即，将所述微生物接种于营养培养基，在好氧条件下培养约5至10天后，从培养物中收集菌体，用溶菌酶、β-葡聚糖酶等细胞壁溶解酶、超声波进行处理而使包含该dna的基因组dna溶出到菌体外。此时，可以在组合使用蛋白酶等蛋白水解酶或在sds等表面活性剂共存下进行冷冻解冻。对如此得到的处理物应用例如苯酚提取、醇沉淀、离心分离、核糖核酸酶处理等常规方法则可得到目标基因组dna。在人工合成本发明的dna时，例如可以基于序列表中的序列号2或3所示的氨基酸序列进行化学合成。另外，可以以包含该dna的基因组dna为模板且使用合适成为引物的化学合成dna来有利地实施pcr合成。

本发明的dna通常具有规定的碱基序列，作为其一例，可列举序列表中的序列号4或5所示的碱基序列或与它们同源的碱基序列，进一步地，可列举与这些碱基序列互补的碱基序列。作为具有与序列表中的序列号4或5所示的碱基序列同源的碱基序列的dna，可列举在保持所编码的pva降解酶的活性的范围内具有在序列号4或5所示的碱基序列中缺失、置换或添加1个以上的碱基而成的碱基序列的dna，优选具有相对于序列号4或5所示的碱基序列具有通常82％以上、期望为85％以上、进一步期望为90％以上、此外进一步期望为95％以上的同源性(序列一致性)的碱基序列的dna。另外，基于基因编码的简并性且在不改变各自所编码的pva降解酶的氨基酸序列的条件下，编码这些pva降解酶的dna中的1个或2个以上碱基被置换为其它碱基而成的dna当然也包含在本发明的dna中。

将本发明的dna插入到可自主复制的合适载体中，可以有利地制成重组dna。重组dna通常包含dna和可自主复制的载体，如果能获得dna就能够利用常规的重组dna技术较容易地制备。作为所述载体的例子，可以使用质粒、噬菌体或粘粒等，可根据要导入的细胞或导入方法适宜选择。载体的具体种类没有特别限定，适宜选择可在宿主细胞中表达的载体即可。根据宿主细胞的种类来适宜选择启动子序列，以便可靠地表达上述基因，可以使用将其和上述基因整合到各种质粒等中而得的载体来作为表达载体。作为所述表达载体，可利用例如噬菌体载体、质粒载体、病毒载体、逆转录病毒载体、染色体载体、附加体载体和病毒来源载体(例如细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件和病毒(例如杆状病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒(日语：トリポックスウィルス)、假狂犬病病毒、疱疹病毒、慢病毒和逆转录病毒))以及来自它们的组合的载体(例如粘粒和噬菌粒)。

作为用于细菌时优选的载体，可列举例如pqe-70、pqe-60、pbs载体、phagescript载体、bluescipt载体、pnh8a、pnh6a、pnh18a和pnh46a；以及ptrc99a、pkk223-3、pkk233-3、pdr540和prit5等。另外，作为用于真核生物时优选的载体，可列举pwlne0、psv2cat、pog44、pxt1和psg；以及psvk3、pbpv、pmsg和psvl等。

在将本发明的dna插入所述载体时，通常可以采用本领域的常规方法。具体而言，首先将包含目标dna的基因dna和可自主复制的载体用限制酶和/或超声波切断，然后将生成的dna片段和载体片段连接。可以将如此得到的重组dna导入合适宿主而制成转化体，对其进行培养则可以无限复制。

如此得到的重组dna可以导入到以大肠杆菌、枯草杆菌、放线菌、酵母为代表的合适的宿主微生物中。为了取得转化体，可以使用菌落杂交法，或者用营养培养基进行培养并选择产生pva降解酶者。

本发明的pva降解酶同时具有pva氧化活性和氧化pva水解活性，而且如后述实验部分所述，在酶多肽的氨基酸序列的n末端侧前半部具有与公知的pva脱氢酶的氨基酸序列显示虽然低但也是同源性的区域，另外，在c末端侧后半部具有与公知的氧化pva水解酶的氨基酸序列显示较高的同源性的区域。基于该见解，通过在本发明的dna、即编码本发明的pva降解酶的dna的中间部插入终止密码子、终止子序列等，人为地创造了仅编码pva降解酶的n末端侧前半部的氨基酸序列的dna，使用重组dna技术使该改变基因在合适的宿主微生物中表达，从而可以创造仅具有pva氧化活性的多肽(酶)，可以将其作为重组型pva氧化酶来制造和利用。

如后述实验部分所示，作为本发明的pva降解酶的氨基酸序列而例示的序列表中的序列号2所示的氨基酸序列与该序列表中的序列号3所示的氨基酸序列在氨基酸序列整体上显示约84％的同源性(序列一致性)，但是如果限定于与公知的pva脱氢酶的氨基酸序列具有同源性的n末端侧前半部的由约450氨基酸残基构成的氨基酸序列的区域，则其同源性(序列一致性)达到约90％。由此，作为上述创造的仅具有pva氧化活性的酶，可列举：具有序列表中的序列号2或3所示的氨基酸序列的n末端侧前半部的约450氨基酸残基构成的氨基酸序列、或在维持约90％的同源性(序列一致性)的范围内使该氨基酸序列中缺失、添加或置换1个以上的氨基酸残基而成的变异体酶。

另一方面，同样地基于上述见解，通过在本发明的dna、即编码本发明的pva降解酶的dna的中间部插入启动子序列、起始密码子、编码分泌信号序列的碱基序列等而人工创造了仅编码本发明的pva降解酶的c末端侧后半部的氨基酸序列的dna，同样地使其表达，从而可以创造仅具有氧化pva水解活性的多肽(酶)，可以将其作为重组型氧化pva水解酶来利用。

另外，如上所述，作为本发明的pva降解酶的氨基酸序列而例示的序列表中的序列号2所示的氨基酸序列与该序列表中的序列号3所示的氨基酸序列在氨基酸序列整体上显示约84％的同源性(序列一致性)，但是如果限定于与公知的氧化pva水解酶的氨基酸序列具有同源性的c末端侧后半部约340氨基酸残基构成的氨基酸序列的区域，则其同源性(序列一致性)达到约85％。由此，作为上述创造的仅具有氧化pva水解活性的酶，可列举：具有序列表中的序列号2或3所示的氨基酸序列的c末端侧后半部约340氨基酸残基构成的氨基酸序列、或在维持约85％的同源性(序列一致性)的范围内使该氨基酸序列中缺失、添加或置换1个以上的氨基酸残基而成的变异体酶。

进一步地，在作为本发明的pva降解酶的氨基酸序列而例示的序列表中的序列号2和3所示的氨基酸序列的任一者中，在n末端侧前半部的与pva脱氢酶的氨基酸序列显示同源性的区域与c末端侧后半部的与氧化pva水解酶的氨基酸序列显示同源性的区域之间具有约90至100氨基酸残基的序列构成的接头部。本发明的pva降解酶如果仅在n末端侧前半部具有pva氧化酶的功能、仅在c末端侧后半部具有氧化pva水解酶的功能，则认为该接头不会对两种酶活性造成不良影响、并且对杂化酶的构成有益。该接头部可能不仅可用于本发明的pva降解酶，而且可用于将其它合适的两种酶连接而制作杂化酶。

本发明的具有pva降解酶产生能力的微生物(包括转化体)的培养中所用的培养基为微生物可生育且能产生pva降解酶的营养培养基即可，可以是合成培养基和天然培养基中的任一者。作为碳源，只要是微生物的生育中可利用的碳源即可，可使用例如：丙三醇、乙二醇、pva等多元醇类；植物来源的淀粉和植物糖原、动物和微生物来源的糖原和支链淀粉；另外还可使用这些的部分降解物、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、糖蜜等糖质；另外还可以使用柠檬酸、琥珀酸等有机酸。培养基中的这些碳源的浓度可根据碳源的种类来适宜选择。作为氮源，可以适宜使用例如铵盐、硝酸盐等无机氮化合物和例如尿素、玉米浆、酪蛋白、蛋白胨、酵母提取物、肉提取物等含有机氮的物质。另外，作为无机成分，可适宜使用例如钙盐、镁盐、钾盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、锌盐、铁盐、铜盐、钼盐、钴盐等盐类。另外，根据需要还可以适宜使用氨基酸、维生素等。

微生物的培养通常在选自温度15至37℃且ph5.5至10的范围、优选温度20至34℃且ph5.5至8.5的范围内的条件下有氧进行。培养时间为该微生物能够增殖的时间即可，优选为5天至10天。另外，培养条件中的培养液的溶解氧浓度没有特别限制，通常优选为0.5至20ppm。为此而适当采用调整通气量或搅拌等手段。另外，培养方式可以是分批培养或连续培养中的任一者。

在如此进行微生物培养后，回收包含本发明的pva降解酶的培养物。主要在从培养物除去菌体而得到的培养上清中观察到pva降解酶的活性，可以收集培养上清作为粗酶液，也可以将培养物整体作为粗酶液来使用。在从培养物除去菌体时，可以采用公知的固液分离法。例如，可适宜采用对培养物本体进行离心分离的方法或者用预涂过滤器等进行过滤分离的方法、通过平膜、中空纤维膜等膜过滤来分离的方法等。可以将培养上清直接作为粗酶液使用，但通常浓缩后使用。作为浓缩方法，可采用硫酸铵盐析法、丙酮和醇沉淀法、使用平膜、中空膜等的膜浓缩法等。

如上所述，本发明的pva降解酶可以直接使用粗酶液或将粗酶液浓缩后使用，但是也可以根据需要利用公知方法进一步分离·纯化后使用。例如，如后述实验部分所述那样，对将培养液的处理物进行硫酸铵盐析而浓缩的部分纯化酶进行透析后，使用利用『deae-toyopearl650s』的阴离子交换柱色谱、接下来使用利用『cm-toyopearl650s』的阳离子交换柱色谱进行纯化，由此可以得到在电泳中显示一条带的本发明的pva降解酶。另外，pva降解酶的纯化中，此外也可以有利地利用疏水柱色谱、凝胶过滤柱色谱、亲和柱色谱、制备用等电点电泳等合适的纯化方法。

在pva降解酶为重组型酶时，根据宿主的种类，酶有时会在菌体内蓄积。这种情况下，虽然也可以直接使用菌体或培养物，但通常在使用之前根据需要利用浸透压冲击、表面活性剂从菌体中进行提取后或利用超声波、细胞壁溶解酶破碎菌体后，通过过滤、离心分离等从菌体或菌体破碎物中分离重组型酶而有利地使用。

作为本发明的pva降解酶的底物的pva，不因其分子量(或聚合度)、皂化度而受到特别限定，一般可列举分子量为15,000～200,000(聚合度为400～3900)、皂化度为70～99摩尔％等的pva。

在使本发明的pva降解酶作用于作为底物的pva时，其底物浓度没有特别限定，例如在使用底物浓度为0.1％(w/v)的较低浓度溶液时，本发明的pva降解酶也进行反应而降解pva。工业化的情况下，底物浓度优选为1％(w/v)以上，该条件下可以有利地降解pva。关于反应温度，在反应进行的温度、即55℃左右进行即可。优选使用25至50℃左右的温度。反应ph通常可以调节为4.5至8.0的范围、优选为ph5.0至7.5的范围。酶的使用量与反应时间关系密切，可以根据目标的酶反应的进行来适宜选择。

以下通过实验来详细说明本发明。

＜实验1：假单胞菌vt1b株(nbrc110478)的培养和粗酶剂的制备＞

将由pva(试剂级聚乙烯醇、聚合度500、nacalaitesque株式会社销售)1g/l、磷酸氢二钾0.3g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钠0.5g/l、硝酸铵1g/l和水组成的液体培养基调节为ph7.0后，用高压釜(121℃、20分钟)灭菌，向该灭菌培养基中另外添加过滤灭菌后的硫酸镁七水合物、氯化钙二水合物和硫酸铁七水合物，分别达到终浓度0.5g/l、0.05g/l和0.02g/l，进一步添加过滤灭菌后的盐酸硫胺素和吡咯喹啉醌(pqq)，分别达到终浓度0.01g/l和10μg/l，将得到的液体培养基用于培养。

用铂环刮取用平板琼脂培养基传代培养的假单胞菌vt1b株(nbrc110478)，悬浮于灭菌后的0.85％食盐水(约2ml)。将悬浮液的浊度(波长660nm的吸光度、a660)调整为0.5，向装有3ml上述液体培养基的试管中接种60μl，在27℃、240rpm下振荡培养5天而进行种子培养。

再将除了以终浓度0.2g/l添加了消泡剂(adekanollg-126)以外与上述液体培养基相同的培养基向20个500ml容积的三角烧瓶中各分注200ml，分别接种上述所得到的种子培养液各2％(v/v)，在27℃、240rpm下振荡培养10天，作为主培养。培养后，对培养液进行离心分离(8,000rpm、20分钟)，除去菌体，达到培养上清约4l，将其作为粗酶液。粗酶液的pva氧化活性以总活性计为约139单位。

＜实验2：pva降解酶的纯化＞

向实验1中得到的培养上清4l中添加硫酸铵至终浓度达到60％饱和，在4℃放置24小时而进行盐析。通过离心分离(11,000rpm、30分钟)来回收生成的盐析沉淀物，将其溶解于10mm磷酸缓冲液(ph7.0)后，对该缓冲液进行透析，得到约45ml硫酸铵盐析透析液。将该硫酸铵盐析透析液供于使用『deae-toyopearl650s』凝胶(东曹株式会社制)的阴离子交换柱色谱(凝胶体积24ml)。pva氧化活性分为不吸附在用10mm磷酸缓冲液(ph7.0)平衡化的色谱柱而是溶出到非吸附级分中的活性级分、和吸附于色谱柱并通过使该缓冲液的食盐浓度从0m线性上升到0.5m的梯度溶出而溶出的活性级分。将吸附于『deae-toyopearl650s』凝胶并用食盐溶出而得的活性级分相对于10mm磷酸缓冲液(ph7.0)进行透析，作为pva降解酶纯化标品(pva-b)。

然后，将不吸附于使用『deae-toyopearl650s』的阴离子交换柱的活性级分供于使用『cm-toyopearl650s』凝胶(东曹株式会社制)的阳离子交换柱色谱(凝胶体积23ml)。关于pva氧化活性，吸附于『cm-toyopearl650s』凝胶并以食盐浓度0m至0.5m的线性梯度溶出时，在食盐浓度约0.08m附近溶出。回收活性级分，相对于10mm磷酸缓冲液(ph7.0)进行透析，作为pva降解酶纯化标品(pva-a)。

将上述纯化工序的各阶段的pva降解酶的作为pva氧化活性的总活性、总蛋白、比活和收率汇总于表1。另外，还将另行对培养上清(粗酶)和纯化酶标品定性确认的2,4-戊二酮分解活性、与pva氧化活性的测定一起在纯化工序的各阶段中测定的pva降解活性分别汇总于表1。需要说明的是，关于表1中的2,4-戊二酮分解活性的符号“○”，表示检测到作为2,4-戊二酮的水解产物的丙酮。

[表1]

*：定性确认到作为水解产物的丙酮

**：未测定

如表1所示，得到了具有氧化pva而生成过氧化氢的pva氧化活性、水解作为β-二酮的2,4-戊二酮的活性、以及pva降解活性(粘度降低活性)中的任意者的两种纯化酶标品“pva-a”和“pva-b”。

将作为pva降解酶纯化标品的pva-a和pva-b分别供于sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)(8至16w/v％浓度梯度)而检测纯度，结果均显示单一的蛋白条带，可知为高纯度标品。

＜实验3：pva降解酶的性质＞

＜实验3-1：分子量＞

将实验2中得到的pva降解酶纯化标品、即pva-a和pva-b分别供于sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(8至16w/v％浓度梯度)，同时与进行电泳的分子量标志物(商品名『precisionplusproteinuncoloredstandard』、bio-radlaboratoriesinc.,japan.,销售)进行比较而测定分子量。将结果示于图2。需要说明的是，图2中，符号m表示同时进行电泳的分子量标志物，符号a和b分别表示pva-a和pva-b。如图2所示，pva-a和pva-b均显示出几乎单一的蛋白条带，另外通过与分子量标志物的对比可知，具有大致同等的分子量即100,000±20,000。

＜实验3-2：最适温度和最适ph＞

使用实验2中得到的pva降解酶纯化标品中的pva-a，以pva氧化活性为指标，基于活性测定方法调查温度、ph对酶活性的影响。将这些的结果示于图3(最适温度)、图4的(最适ph)。需要说明的是，图4中的符号●、■和▲分别表示在ph控制中使用乙酸缓冲液、磷酸缓冲液和甘氨酸-naoh缓冲液而测定出的值。获知pva氧化活性的最适温度在ph7.0、60分钟的反应条件下为35至40℃，最适ph在27℃、60分钟的反应条件下为6.5至8.0。另外，虽然省略了详细的数据，但是pva-b也显示出与pva-a几乎相同的最适温度和最适ph。

＜实验3-3：温度稳定性和ph稳定性＞

使用通过实验2的方法得到的pva降解酶纯化标品中的pva-a，以pva氧化活性为指标调查温度稳定性和ph稳定性。温度稳定性如下求出：将酶溶液(10mm磷酸缓冲液、ph7.0)在各温度下保持60分钟，水冷后测定残存的酶活性。ph稳定性如下求出：将酶溶液在各ph的100mm缓冲液中在4℃保持24小时后，将ph调节为7.0，测定残存的酶活性。将这些的结果示于图5(温度稳定性)、图6(ph稳定性)。需要说明的是，图6中的符号●、■、▲和◆分别表示在ph控制中使用乙酸缓冲液、磷酸缓冲液、甘氨酸-naoh缓冲液和氯化钾-naoh缓冲液而得到的值。由图5可知，pva氧化活性的温度稳定性截止于45℃。另外，由图6可知，pva氧化活性的ph稳定性为ph4.5至10.5的范围。另外，虽然省略了详细的数据，但pva-b也显示出与pva-a几乎相同的温度稳定性和ph稳定性。

＜实验3-4：各种金属盐对pva氧化活性的影响＞

使用通过实验2的方法得到的pva-a和pva-b的纯化酶标品，以pva氧化活性为指标，在浓度1mm的金属盐的存在下基于活性测定方法调查各种金属盐对酶活性的影响。将结果示于表2。

[表2]

*:与反应产物相互作用而褪色，因此未能评价

**:反应液中产生析出物，因此未能评价

如表2所示，在金属盐对pva氧化活性的影响方面，在pva-a与pva-b之间未观察到明显差异，获知因hg²⁺、fe³⁺离子而被显著抑制，另外也因edta被抑制。

＜实验3-5：关于pva氧化活性的底物特异性＞

使用通过实验2的方法得到的pva-a和pva-b的纯化酶标品，使其作用于作为底物的各种仲醇、伯醇等，来调查关于pva氧化活性的底物特异性。即，测定相对于链长不同的伯醇(甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、癸醇)、仲醇(2-丙醇、2-戊醇、2-己醇、4-庚醇、2-辛醇、4-癸醇、2,4-戊二醇)、叔醇(叔丁醇)的酶活性。底物浓度设为1％(v/v)，不溶于水者则进行悬浮，使其达到饱和浓度。将结果示于表3。

[表3]

如表3所示，以将相对于pva的氧化活性设为100％时的相对活性计，pva-a和pva-b对作为仲醇的4-庚醇作用较弱，为12至21％，对同为仲醇的2-己醇、2-辛醇作用微弱，仅为3至8％，除此之外，对其它仲醇、伯醇、叔醇(叔丁醇)、二醇几乎不起作用。

＜实验3-6：n末端氨基酸序列＞

将实验2中得到的pva降解酶的纯化标品、即pva-a和pva-b分别供于n末端氨基酸序列分析，分析n末端起的20残基的氨基酸序列。需要说明的是，使用肽分析仪(装置名『ppsq-31a』、岛津制作所制)实施n末端氨基酸序列分析。结果获知，pva-a具有序列表中的序列号11所示的氨基酸序列、即丙氨酸-谷氨酸-天冬酰胺-色氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-赖氨酸-天冬酰胺-酪氨酸-谷氨酸-天冬酰胺-苏氨酸-精氨酸-丙氨酸-苏氨酸-丝氨酸-天冬酰胺酸-苏氨酸的氨基酸序列，另外，pva-b具有序列表中的序列号12所示的氨基酸序列、即丙氨酸-谷氨酸-天冬酰胺-色氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-赖氨酸-天冬酰胺-酪氨酸-谷氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-精氨酸-丙氨酸-苏氨酸-丙氨酸-天冬酰胺酸-苏氨酸的氨基酸序列。还获知两者从n末端起至13残基共同地具有相同氨基酸序列、即序列表中的序列号1所示的氨基酸序列。

＜实验4：假单胞菌vt1b株(nbrc110478)的全基因组分析＞

为了对编码本发明的pva降解酶的dna的碱基序列以及pva降解酶的氨基酸序列进行测序，进行了产生该酶的假单胞菌vt1b株(nbrc110478)的全基因组分析。

＜实验4-1：基因组dna的制备＞

将用平板琼脂培养基进行传代培养的假单胞菌vt1b株(nbrc110478)刮取一铂环，接种到装有3ml实验1中使用的液体培养基的试管中，在27℃、240rpm下振荡培养5天。培养结束后，对培养液进行离心分离，使用市售的总dna纯化试剂盒(商品名『dneasyblood&tissuekit』，qiagen公司销售)通过常规方法由回收的菌体制备基因组dna。

＜实验4-2：使用新一代测序仪的全基因组碱基序列测定＞

对于实验4-1中得到的基因组dna，使用市售的试剂盒(商品名『nexteraxtdnalibrarypreparationkit』、illumina公司销售)进行酶切而片段化，进行片段化的dna的末端的平滑化处理和对dna末端添加衔接序列而将dna片段文库化，再用pcr进行扩增，然后使用市售的dna纯化试剂盒(商品名『ampurexp』、beckmancoulter公司销售)进行纯化。然后，使用新一代测序仪(装置名『miseq』、illumina公司制)测定文库化的dna片段的碱基序列，将测定出的各dna片段的碱基序列(重叠群序列)在计算机上整合，由此得到全基因组dna的碱基序列。

然后，使用基因区域预测软件(『glimmer』)对全基因组dna的碱基序列进行分析，预测被推定为编码蛋白质的开放阅读框(openreadingframe、orf：推定基因区域)，结果获知假单胞菌vt1b株(nbrc110478)的全基因组dna中存在4749个orf。

＜实验4-3：编码pva降解酶的orf的鉴定＞

以实验4-2的全基因组分析中观察到的4749个orf为对象，检索编码与实验3-2中确定的两种pva降解酶、即pva-a和pva-b的n末端氨基酸序列一致的氨基酸序列的orf，结果获知orf3286编码与pva-a的n末端氨基酸序列完全一致的氨基酸序列，另外获知orf3283编码与pva-b的n末端氨基酸序列完全一致的氨基酸序列。由该结果明确了：orf3286的碱基序列、即序列表中的序列号4所示的碱基序列为pva-a的结构基因dna，pva-a由从与序列表中的序列号4所示的碱基序列一起记载的氨基酸序列中除去被推定为分泌信号序列的n末端部分的26氨基酸残基而成的氨基酸序列、即序列表中的序列号2所示的氨基酸序列构成。另外，同样明确了：orf3283的碱基序列、即序列表中的序列号5所示的碱基序列为pva-b的结构基因dna，pva-b由从与序列表中的序列号5所示的碱基序列一起记载的氨基酸序列除去被推定为分泌信号序列的n末端部分的26氨基酸残基而成的氨基酸序列、即序列表中的序列号3所示的氨基酸序列构成。

顺便说明一下，经计算，由序列表中的序列号2所示的氨基酸序列构成的pva-a的分子量为101,426，另外由序列号3所示的氨基酸序列构成的pva-b的分子量为109679，这两者的分子量均与上述实验3-1中通过sds-page求出的分子量100,000±20,000一致性良好。使用市售的遗传信息处理软件(『genetyxver.13』、株式会社genetyx销售)调查序列表中的序列号2所示的pva-a的氨基酸序列与序列表中的序列号3所示的pva-b的氨基酸序列的同源性(序列一致性)，计算结果为84％。另外，同样地，编码各自的酶的序列表中的序列号4所示的碱基序列与序列号5所示的碱基序列的同源性(序列一致性)的计算结果为82％。

＜实验5：基于pva降解酶的氨基酸序列的同源性探索＞

基于实验4中得到的pva-a和pva-b的氨基酸序列、即序列表中的序列号2或3所示的氨基酸序列，以序列数据库genbank为对象进行blast检索，结果获知：出乎意料的是，pva-a和pva-b的氨基酸序列与genbank中登录的pva脱氢酶的氨基酸序列和与其催化的反应完全不同的氧化pva水解酶的氨基酸序列这两者显示同源性，进一步获知：这些pva-a和pva-b的氨基酸序列是经由推定为接头的同源性较低的氨基酸序列将与pva脱氢酶显示同源性的n末端侧前半部和与氧化pva水解酶显示同源性的c末端侧后半部连接而成的。

从在上述blast检索中获知与本发明的pva降解酶具有同源性的公知的酶组的氨基酸序列中，选择假单胞菌vm15c株来源的pva脱氢酶的氨基酸序列(genbank登录号no.baa94193.1)和鞘氨醇单胞菌(sphingopyxissp.)113p3株来源的pva脱氢酶的氨基酸序列(genbank登录号no.bad95543.3)这两个氨基酸序列作为与pva-a和pva-b的n末端侧前半部的氨基酸序列具有较高的同源性的酶的氨基酸序列，使用遗传信息处理软件(『genetyxver.13』、株式会社genetyx销售)调查其同源性。

其结果是，pva-a的氨基酸序列、即序列表中的序列号2所示的氨基酸序列的n末端侧前半部(1至442残基)与假单胞菌vm15c株来源pva脱氢酶的氨基酸序列(144至627残基)显示约24％的同源性(序列一致性)，另外该n末端侧前半部(1至429残基)与鞘氨醇单胞菌113p3株来源的pva脱氢酶的氨基酸序列(151至627残基)显示约26％的同源性(序列一致性)。

另一方面，pva-b的氨基酸序列、即序列表中的序列号3所示的氨基酸序列的n末端侧前半部(1至445残基)与假单胞菌vm15c株来源pva脱氢酶的氨基酸序列(144至630残基)显示约23％的同源性(序列一致性)，另外该n末端侧前半部(1至429残基)与鞘氨醇单胞菌113p3株来源的pva脱氢酶的氨基酸序列(151至627残基)显示约25％的同源性(序列一致性)。

将pva-a和pva-b的n末端侧前半部的氨基酸序列以及假单胞菌vm15c株来源和鞘氨醇单胞菌113p3株来源pva脱氢酶的氨基酸序列这4种氨基酸序列的多序列比对示于图7。由图7可直观地看出，pva-a和pva-b的氨基酸序列的n末端侧前半部分别与假单胞菌vm15c株来源或鞘氨醇单胞菌113p3株来源的pva脱氢酶的氨基酸序列显示低同源性。这些结果表明：本发明的pva降解酶的氨基酸序列的n末端侧前半部形成具有pva降解酶所具有的2个活性中的氧化pva的活性的结构域。

另外，与对n末端前半部的氨基酸序列的调查同样地，从在上述blast检索中获知与本发明的pva降解酶具有同源性的公知的酶组的氨基酸序列中，选择假单胞菌vm15c株来源的氧化pva水解酶的氨基酸序列(genbank登录号no.baa94192.1)和鞘氨醇单胞菌113p3株来源的氧化pva水解酶的氨基酸序列(genbank登录号no.bad95542.3)这两个氨基酸序列作为与pva-a和pva-b的c末端侧后半部的氨基酸序列具有较高的同源性的酶的氨基酸序列，同样地调查其同源性。

其结果是，pva-a的氨基酸序列、即序列表中的序列号2所示的氨基酸序列的c末端侧后半部(625至973残基)与假单胞菌vm15c株来源氧化pva水解酶氨基酸序列(34至379残基)显示约54％的同源性(序列一致性)，另外该c末端侧后半部(643至973残基)与鞘氨醇单胞菌113p3株来源的氧化pva水解酶的氨基酸序列(39至363残基)显示约55％的同源性(序列一致性)。

另一方面，pva-b的氨基酸序列、即序列表中的序列号3所示的氨基酸序列的c末端后半部(586至963残基)与假单胞菌vm15c株来源氧化pva水解酶的氨基酸序列(3至379残基)显示约50％的同源性(序列一致性)，另外该c末端侧后半部(619至963残基)与鞘氨醇单胞菌113p3株来源的氧化pva水解酶的氨基酸序列(24至363残基)显示约51％的同源性(序列一致性)。

将pva-a和pva-b的c末端侧后半部的氨基酸序列以及假单胞菌vm15c株来源和鞘氨醇单胞菌113p3株来源氧化pva水解酶的氨基酸序列这4种氨基酸序列的多序列比对示于图8。由图8也可以直观地看出，pva-a和pva-b的氨基酸序列的c末端侧后半部与假单胞菌vm15c株来源或鞘氨醇单胞菌113p3株来源的氧化pva水解酶显示出较高的同源性。这些结果表明：本发明的pva降解酶的氨基酸序列的c末端侧后半部形成具有pva降解酶所具有的2个活性中的氧化pva水解活性的结构域。

将上述见解综合起来，在图9中分别示意性示出作为pva降解酶的pva-a和pva-b的结构。如图9所示，pva-a的氨基酸序列(序列表中的序列号2所示的氨基酸序列)中的至第442位的氨基酸残基为止的n末端侧前半部形成与公知的pva脱氢酶的氨基酸序列显示同源性的、催化pva的氧化的结构域，介由长度为约90残基的氨基酸残基的接头序列，第633位的氨基酸残基至第963位的氨基酸残基的c末端侧后半部形成与公知的氧化pva水解酶的氨基酸序列显示同源性的、催化氧化pva的水解的结构域。pva-b的氨基酸序列(序列表中的序列号3所示的氨基酸序列)的情况也大致相同。

＜实验9：编码pva降解酶的dna的克隆和重组dna的制备＞

使推定为orf3286和orf3283分别编码的pva降解酶的分泌信号序列的部分产生缺失而得的dna进行in-fusion，由此进行了编码pva-a或pva-b的dna的克隆。

＜实验9-1：编码pva降解酶的dna的克隆和重组dna的制备＞

首先，以质粒载体prseta为模板，使用分别具有序列表中的序列号6和7所示的碱基序列的引物1和引物2进行pcr来制作直链状的prseta。然后，以基因组dna为模板，使用分别具有序列表中的序列号8和9所示的碱基序列的引物3和引物4进行pcr，来扩增编码从orf3286所编码的氨基酸序列中除去了信号序列的氨基酸序列、即pva-a的dna。另外，同样地以基因组dna为模板、并且使用分别具有序列表中的序列号8和10所示的碱基序列的引物3和引物5进行pcr，来扩增编码从orf3283所编码的氨基酸序列中除去了信号序列的氨基酸序列、即pva-b的dna。

对于上述制作的直链状质粒和pva-a基因或pva-b基因，使用市售的in-fusion克隆试剂盒(商品名『in-fusionhdcloningkit』、宝生物株式会社销售)进行in-fusion反应而分别制作重组质粒，分别命名为“prseta-pva-a”和“prseta-pva-b”。将通过上述方法得到的、编码pva-a的重组dna即“prseta-pva-a”的结构示意性示于图10中。

＜实验9-2：转化体的制备和pva降解酶蛋白的表达＞

使用实验9-1中得到的编码pva-a的重组dna“prseta-pva-a”，按照常规方法转化大肠杆菌hst08而大量制备重组dna后，转化大肠杆菌bl21(de3)，尝试进行重组酶的表达，结果观测到与重组dna的表达相伴随的表达蛋白的生成。

＜实验10：利用pva降解酶进行的pva降解＞

使用通过实验2的方法得到的pva-a纯化酶标品，对于pva浓度改变的底物溶液，改变酶作用量且进行作用，以溶液的粘度下降为指标来经时调查pva降解。

将作为底物的pva(试剂级聚乙烯醇、聚合度2,000、nacalaitesque株式会社销售)、50mm磷酸钠缓冲液(ph7.0)和溶解于相同缓冲液的pva-a纯化酶液混合，制备pva的终浓度为1％、4％或10％(w/v)、pva-a的酶作用量为相对于1g的pva以pva氧化活性计为1(或1.25)、5或10单位的反应液(反应液量各1ml)，在塑料管内于35℃下边以160rpm振荡边反应1、4或20小时。需要说明的是，将在各pva浓度中添加50mm磷酸钠缓冲液(ph7.0)来代替酶液的情况作为对照(酶作用量为0单位)。将在各条件下反应而得到的反应液0.6ml供于使用锥板型粘度计(商品名『dv-ii+pro』、brookfield公司制)的粘度测定。将各反应条件下的反应液粘度汇总于表4。

[表4]

如表4所示，任一pva浓度下，在使相对于1g的pva以pva氧化活性计为1单位以上的pva降解酶作用时，观察到pva溶液的粘度下降。在以浓度1％(w/v)的pva溶液为底物的反应中，反应开始时的溶液粘度为2.7mpa·s者，在酶作用量为10单位、作用20小时的反应液中粘度降至1.2mpa·s(顺便说明一下，在同一条件下的粘度测定中，纯化水的粘度为约1.0mpa·s。)。另外，在以浓度4％(w/v)的pva溶液为底物的反应中，反应开始时的溶液粘度为约36mpa·s者，在酶作用量为5单位、作用20小时的反应液中粘度降为3.7mpa·s，即约1/10。进一步地，就pva降解酶pva-a而言，即使是10％(w/v)这一较高浓度的底物溶液也良好地进行作用，以相对于1g的pva为5单位的酶作用量作用20小时时，反应液的粘度从反应开始时的2430mpa·s降为231mpa·s，即约1/10。

另一方面，对于pva浓度1％(w/v)、以酶作用量10单位作用20小时而得到的反应液，利用常规的凝胶过滤hplc法分析pva降解物的分子量。使用将2根『tskgelα-4000』(东曹株式会社制)连接而成的柱作为色谱柱，使用50mm磷酸缓冲液(ph7.0)作为溶出液，在柱温40℃、流速0.5ml/分钟的条件进行凝胶过滤hplc，使用差示折射计rid-20a(株式会社岛津制作所制造)进行检测。需要说明的是，基于将分子量测定用支链淀粉标准品(株式会社林原销售)同样供于凝胶过滤hplc而制作的分子量标准曲线，分别计算pva和pva降解物的分子量。图11中，对比作为底物使用的pva自身(图11中的符号a)并示出反应液的凝胶过滤hplc色谱图(图11中的符号b)。

如图11所示，作为底物使用的pva(符号a)在30.6分钟的保留时间处显示峰顶，其重均分子量(mw)的计算结果为约10.6×10⁴。另一方面，在pva浓度1％(w/v)、以酶作用量10单位作用20小时而得到的pva降解反应液(符号b)的情况下，降解物在40.4分钟的保留时间处显示峰顶，其重均分子量(mw)的计算结果为约4,400。由该结果可知，在pva降解反应液中，作为底物的pva已被pva-a降解为低分子。

如上所述，本申请的pva降解酶单独也可以高效地降解pva。这在本申请的pva降解酶为具有pva氧化活性和氧化pva水解活性这两者的杂化酶，首次得以实现。

＜实验11：pva氧化酶片段和氧化pva水解酶片段的检测＞

在实验2的pva-a和pva-b的纯化工序中的、由cm-toyopearl650s柱色谱得到的级分中，除了pva-a和pva-b以外还观察到显示pva氧化活性的级分，将该级分供于与实验3同样的sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果检测到分子量低于pva-a和pva-b的、分子量约50,000的蛋白质条带。对于该蛋白质，用与实验3-6同样的方法调查n末端起20残基的n末端氨基酸序列，结果确认到与pva-a的n末端氨基酸序列完全相同的氨基酸序列，即丙氨酸-谷氨酸-天冬酰胺-色氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-赖氨酸-天冬酰胺-酪氨酸-谷氨酸-天冬酰胺-苏氨酸-精氨酸-丙氨酸-苏氨酸-丝氨酸-天冬酰胺酸-苏氨酸。另外，省略了详细的数据，但在显示pva氧化活性的该级分中未观察到水解氧化pva的活性。该结果表明：存在于该级分中的具有pva氧化活性的酶为来自pva-a的仅具有pva氧化活性的pva氧化酶片段。

另外，同样地，在实验2的pva-a和pva-b的纯化工序中的、由cm-toyopearl650s柱色谱得到的级分中也发现了不同于pva-a和pva-b且具有氧化pva水解活性的级分。将该级分供于sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果检测到分子量低于pva-a和pva-b的、分子量约35,000的蛋白质条带。对于该蛋白质，用与实验3-6同样的方法调查n末端氨基酸序列，结果获知为5氨基酸残基，确认为缬氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-苏氨酸。该氨基酸序列与pva-a的氨基酸序列、即序列表中的序列号2所示的氨基酸序列的623残基至627残基的氨基酸序列完全一致。综合考虑对pva-a和pva-b的氨基酸序列与公知的氧化pva水解酶的氨基酸序列进行比较的图8、以及示意性示出pva-a和pva-b的结构的图9所示出的信息，认为具有该pva-a的氨基酸序列的623残基至627残基的氨基酸序列作为n末端氨基酸序列的、分子量约35,000的蛋白质是来自pva-a的仅具有氧化pva水解活性的氧化pva水解酶片段。

上述结果表明：在假单胞菌vt1b株(nbrc110478)的培养液中，作为同时具有pva氧化活性和氧化pva水解活性这两者的杂化酶而产生的pva降解酶中的至少pva-a被部分降解，生成了pva氧化酶片段和氧化pva水解酶片段。由此认为，通过将作为杂化酶的pva-a和pva-b用蛋白酶人工进行限制性降解，还可分别制备pva氧化酶和氧化pva水解酶。

以下通过实施例进一步详细说明本发明。但是，本发明不受这些实施例限定。

实施例1

＜pva降解酶的制备＞

将由pva(试剂级聚乙烯醇、聚合度500、nacalaitesque株式会社销售)1g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钠0.5g/l、硝酸铵4g/l、硫酸镁七水合物0.5g/l、酵母浸膏(yeastextractd-3h、日本制药株式会社制)0.5g/l和水组成的液体培养基调节为ph7.0后，用高压釜(121℃、20分钟)灭菌，再添加过滤灭菌后的吡咯喹啉醌(pqq)以使终浓度为10μg/l，将得到的液体培养基用于培养。

通过与实验1相同的方法对假单胞菌vt1b株进行种子培养，向在500ml容积的三角烧瓶中分注了上述液体培养基50ml的三角烧瓶中接种种子培养液1％(w/v)，在27℃、240rpm下振荡培养5天。培养后所得到的培养上清的pva降解酶的活性以pva氧化活性计为0.034单位/ml。另外，使本培养上清作用于2,4-戊二酮，结果检测到作为水解产物的丙酮，确认也具有β-二酮水解活性、即氧化pva水解活性。本培养上清可以有利地作为pva降解酶的粗酶来使用。

实施例2

＜pva降解酶剂＞

对通过实施例1的方法得到的假单胞菌vt1b株的培养液约1l进行离心分离(10,000rpm、30分钟)，向得到的培养上清约960ml(pva氧化活性约32单位)中添加硫酸铵至25％饱和而溶解，在冷室中放置一夜。通过离心分离回收所得到的盐析物，溶解于10mm磷酸缓冲液(ph7.0)，对该缓冲液进行透析。对于得到的透析液，用实验3-1的方法进行sds-page，结果仅检测到显示100,000±20,000的分子量的蛋白条带，培养上清中观察到的杂蛋白几乎完全被除去。可知通过该纯化手段可以高效地纯化pva降解酶。确认所得到的部分纯化pva降解酶具有pva氧化活性且具有β-二酮水解活性、即氧化pva水解活性，因此可以有利地作为pva降解酶剂使用。

实施例3

＜pva降解酶剂＞

对通过实验1的方法得到的假单胞菌vt1b株的培养液约600ml进行离心分离(10,000rpm、30分钟)，向得到的培养上清约560ml(pva氧化活性19.1单位)中添加硫酸铵至60％饱和，溶解，在冷室中放置一夜。通过离心分离回收所得到的盐析物，溶解于5mm磷酸缓冲液(ph7.0)，对该缓冲液进行透析。将得到的透析液供于用相同的磷酸缓冲液平衡化的使用填充了『toyopearlaf-bluehc-650m』(具有“cibacronbluef3ga”作为官能团的载体)的柱的液体色谱，利用氯化钾0m至1m的线性梯度进行溶出。在氯化钾浓度约0.2m时pva降解酶被溶出出来，因此回收活性级分作为pva降解酶部分纯化品。已确认本品具有pva氧化活性且还具有β-二酮水解活性、即氧化pva水解活性，因此可以有利地作为pva降解酶剂使用。

产业上的可利用性

根据本发明，能够大量地制造和提供以往未知的、同时具有pva氧化活性和氧化pva水解活性两者的、全新的作为杂化酶的pva降解酶。能够提供全新的pva降解酶的本发明有益于需要将pva降解、除去等的各种使用领域，其产业意义极大。

符号说明

图2中，

m：分子量标志物

a：pva降解酶纯化标品pva-a

b：pva降解酶纯化标品pva-b

图4和图6中，

●：乙酸缓冲液

■：磷酸缓冲液

▲：甘氨酸-naoh缓冲液

◆：氯化钾-naoh缓冲液

图7和图8中，

氨基酸残基以单字母示出，带有灰色网格线的氨基酸残基表示在所比较的4种氨基酸序列中的3种中一致的氨基酸残基，带有黑色网格线的氨基酸残基表示在全部4种氨基酸序列中一致的氨基酸残基。

pva-a：pva-a的氨基酸序列(序列表中的序列号2所示的氨基酸序列)

pva-b：pva-b的氨基酸序列(序列表中的序列号3所示的氨基酸序列)

pvadh＿vm15c：假单胞菌vm15c株来源pva脱氢酶的氨基酸序列

pvadh＿113p3：鞘氨醇单胞菌113p3株来源pva脱氢酶的氨基酸序列

oph＿vm15c：假单胞菌vm15c株来源氧化pva水解酶的氨基酸序列

oph＿113p3：鞘氨醇单胞菌113p3株来源氧化pva水解酶的氨基酸序列

图9中，数字表示氨基酸残基序号，n表示n末端，c表示c末端。

图10中，

f1ori：f1噬菌体复制起点

ampicillin：氨苄青霉素抗性基因

pucori：puc复制起点

pva-a：pva-a基因

图11中，

a：作为底物的pva的凝胶过滤hplc色谱图

b：pva降解物的凝胶过滤hplc色谱图。

序列表

<110>株式会社林原（hayashibaraco.,ltd.）

<120>聚乙烯醇降解酶和其制造方法

<130>wo100128901

<160>12

<210>1

<211>13

<212>prt

<213>假单胞菌（pseudomonassp.）

<400>1

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1510

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