用于核酸靶向富集的方法和试剂盒与流程

相关申请的交叉引用本申请要求于2017年4月6日提交的美国临时申请no.62/482,189和2018年2月4日提交的pct申请no.pct/us2018/016778的优先权，其内容通过全文引用并入本文。参考以电子形式提交的序列表在此提交的电子提交序列表的内容，文件名为library_seq_capture_st25.txt，大小为190883字节，以及创建日期为2018年2月26日，均通过全文引用并入本文。本发明大体上涉及诊断和预后领域，具体地涉及生物标志物
技术领域：
，更具体地涉及用于遗传和基因组分析的核酸测定，并且更具体地涉及核酸测定中的用于核酸序列靶向富集的方法和试剂盒。
背景技术：
：基因组测序，尤其是最近的下一代测序(ngs)技术，已经成为可以对疾病或个体背后的所有遗传信息进行全局分析的一种工具。例如，ngs已在临床上广泛用于疾病诊断，用于个性化治疗和疾病监测的伴随诊断。技术实现要素：在第一方面，本发明提供了一种用于由生物样品富集至少一个靶核酸序列的方法。该方法包括以下两个步骤：(1)制备至少一对rna探针组，每对包括第一rna探针组和第二rna探针组，该第一rna探针组和第二rna探针组被配置成分别靶向至少一个靶核酸序列中每一个的成对物段(duplexsegment)的两条反向平行链，其中，第一rna探针组和第二rna探针组的任一组中的每个rna探针都用固定部分标记，该固定部分被配置为使得能够固定在固体载体上；以及(2)通过分别使至少一对rna探针组中的每对中的第一rna探针组和第二rna探针组两者分别与至少一个靶核酸序列的每一个中的成对物段的两条反向平行链杂交，并通过标记在第一rna探针组和第二rna探针组的任一个组的每个rna探针上的固定部分固定至固体载体上，由生物样品捕获至少一个靶核酸序列的每条链。本文中，至少一个靶核酸序列中的每一个能是双链核酸分子(诸如双链dna分子、双链rna分子，或dna-rna杂合分子)，或具有发卡结构的单链核酸分子(即dna或rna)。这样，借助于至少一对rna探针组(其中每对中的第一rna探针组和第二rna探针组分别靶向每个靶核酸序列中成对物段的两个反向平行链)，能由生物样品捕获或富集至少一个靶核酸序列。典型的实例是，生物样品中至少一个靶核酸序列的每一个可以是双链dna分子，其具有反向平行延伸以形成双链体的正链和负链。通过至少一对rna探针组(其中每对中的第一rna探针组和第二rna探针组分别靶向每个靶核酸序列中的两条反向平行链(即，正链和负链))，能由生物样品捕获或富集每个靶dna分子的每条链(包括正链和负链)。本文中，根据该方法的一些实施方案，至少一对rna探针组中的一对或更多对可以通过化学合成来制备。这样，制备至少一对rna探针组的步骤(1)能包括：进行化学合成反应，从而获得至少一对rna探针组中的一对或更多对。在化学合成反应期间，至少一对rna探针组中的一对或更多对中的每一对中的每个rna探针能用固定部分标记。在本文中，固定部分共价附着于固体载体上(即，每个rna探针直接在与固定部分偶联的固体载体上合成)。或者，可以在化学合成反应后，用固定部分标记至少一对rna探针组中的一对或更多对的每一对中的每个rna探针，并因此制备至少一对rna探针组的步骤(1)进一步包括：进行标记反应，使得至少一对rna探针组中的一对或更多对的每一对中的每个rna探针都被固定部分标记。根据该方法的一些其他实施方案，至少一对rna探针组中的一对或更多对通过转录制备。这样，制备至少一对rna探针组的步骤(1)能包括：进行转录反应，从而获得至少一对rna探针组中的一对或更多对。本文中，进行转录反应从而获得至少一对rna探针对中的一对或更多对的子步骤能包括：进行转录反应，使得在每个转录反应过程中至少一对rna探针组中的一对或更多对的任一对中的每个rna探针被固定部分标记。根据一些实施方案，每个转录反应在用固定部分标记的ntp的存在下进行，其中所述ntp包含atp、utp、gtp和ctp中的至少一种。本文中，用固定部分标记的ntp能优选包含经生物素标记的utp，并且在每个转录反应中存在的所有utp中，经生物素标记的utp可具有2％-100％的相对摩尔百分比。或者，在每个转录反应后，在至少一对rna探针对中的一对或更多对中的任一对中的每个rna探针都用固定部分标记。这样，进行转录反应从而获得至少一对rna探针组中的一对或更多对的子步骤能包括：进行转录反应；以及进行标记。根据一些实施方案，进行转录反应的上述子步骤能包括：提供了多个dna载体，其包含至少一对dna载体，每对包含第一dna载体和第二dna载体，其被配置为分别使得第一rna分子和第二rna分子能够转录，所述第一rna分子和第二rna分子能够分别靶向至少一个靶核酸序列的一个或更多个中的每一个的成对物段的两条反向平行的链；以及对多个dna载体进行转录反应。本文中，多个dna载体中的每一个能包括选自t3启动子、t7启动子或sp6启动子之一的启动子。转录反应中的至少一个可以在体外，或体内进行。根据该方法的一些实施方案，对多个dna载体进行转录反应的子步骤包括：合并多个dna载体以获得至少两个dna载体库，使得每对dna载体中的第一dna载体和第二dna载体不在同一dna载体库中；以及分别对至少两个dna载体库的每一个进行转录反应以获得与至少两个dna载体库的每一个相对应的rna分子。在分别对至少两个dna载体库的每一个进行转录反应的子步骤之后以及在进行标记的子步骤之前，该方法能进一步包括：对rna分子进行片段化反应，所述rna分子对应于至少两个dna载体库的每一个。根据该方法的一些其他实施方案，不是在转录之前合并dna载体，而是对多个dna载体进行转录反应的子步骤包括：对多个dna载体中的每一个进行转录反应，从而获得与其对应的rna分子。这样，在对多个dna载体中的每一个进行转录反应的子步骤之后以及在进行标记的子步骤之前，该方法能进一步包括：合并与多个dna载体中的每一个相对应的rna分子以获得至少两个rna库，使得rna分子对不在同一rna库中，所述rna分子对分别靶向至少一个靶核酸序列中的一个或更多个中的任一个的成对物段的两条反向平行链；以及分别对至少两个rna库的每一个进行片段化反应。或者，在对多个dna载体中的每一个进行转录反应的子步骤之后以及在进行标记的子步骤之前，该方法能进一步包括：分别对与多个dna载体的每一个相对应的rna分子进行片段化反应，以获得与多个dna载体的每一个相对应的经片段化的rna分子；以及合并与多个dna载体中每一个相对应的经片段化rna分子，使得一对经片段化的rna分子不在同一rna探针组中，所述一对经片段化的rna分子分别靶向至少一个靶核酸序列中的一个或更多个中的任一个的成对物段的两条反向平行链。在如上所述的方法的任何实施方案中，进行标记的子步骤能包括：进行连接反应，使得经固定部分标记的核苷酸与至少一对rna探针组中的每一对中每个rna探针的一个末端或中间连接。在一个实例中，在每个连接反应中，能将生物素标记的核苷酸的5’磷酸末端连接到至少一对rna探针组中的每一对中每个rna探针的3’羟基末端，并且每个连接反应能通过rna连接酶来进行，该rna连接酶可以包括t4rna连接酶或circligaserna连接酶中的至少一种。根据一些实施方案，制备至少一对rna探针组的步骤包括：在固体载体上进行直接转录，从而获得至少一对rna探针组中的一对或更多对。这可以例如通过附着在固体载体上的rna聚合酶来完成。在本文公开的方法中，由生物样品捕获至少一个靶核酸序列的每条链的步骤(2)能包括以下子步骤：使至少一对rna探针组中的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组均与生物样品中的至少一个靶核酸序列接触；以及将至少一个靶核酸序列固定在固体载体上。本文中，至少一对rna探针组中的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组中的任一组中的每个rna探针能具有约100-150nt的长度。这样，能在约62-70℃的温度下，以及优选在约67.5℃的温度下使至少一对rna探针组中的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组均与生物样品中的至少一个靶核酸序列接触的子步骤进行约6-24小时，优选约12小时。根据该方法的一些实施方案，至少一对rna探针组中的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组被配置成分别靶向至少一个靶核酸序列的每一个中的成对物段的不同部分。这样，使至少一对rna探针组的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组均与生物样品中的至少一个靶核酸序列接触的子步骤能包括：在单次杂交反应中，使至少一对rna探针组中的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组均与至少一个靶核酸序列接触。根据该方法的一些实施方案，至少一对rna探针组中的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组被配置成分别靶向至少一个靶核酸序列的每一个中的成对物段的相同部分。这样，使至少一对rna探针对中的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组都与生物样品中的至少一个靶核酸序列接触的子步骤能包括：在第一杂交反应中，使至少一对rna探针组中的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组中的一组与至少一个靶核酸序列接触；以及在第二杂交反应中，使至少一对rna探针组中的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组中的另一组与至少一个靶核酸序列接触。或者，使至少一对rna探针组中的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组均与生物样品中的至少一个靶核酸序列接触的子步骤能包括：分别地在第三杂交反应和第四杂交反应中，使至少一对rna探针组中的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组分别与至少一个靶核酸序列接触；并结合第三杂交反应和第四杂交反应，从而使得能够进行第五杂交反应。在生物样品中，生物样品中的至少一个靶核酸序列中的一个或更多个分别在包含至少一个非靶序列的多核苷酸中。为了使多核苷酸中的至少一个非靶序列对捕获至少一个靶序列的干扰最小化，在使至少一对nra探针组中的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组均与生物样品中至少一个靶核酸序列接触之前，所述方法能进一步包括：使至少一个封闭寡核苷酸与至少一个靶核酸序列接触，使得至少一个封闭寡核苷酸分别与多核苷酸中至少一个非靶序列的每一个的至少一条链杂交，从而封闭。本文中，如果生物样品中的至少一个靶核酸序列的一个或更多个的每一个的侧翼是多核苷酸中的第一衔接子序列和第二衔接子序列，则至少一个封闭寡核苷酸能配置为分别封闭多核苷酸中的第一衔接子序列的一条链和第二衔接子序列的一条链，并且根据一些实施方案，至少一个封闭寡核苷酸能被配置为分别封闭多核苷酸中的第一衔接子序列的两条反向平行链和第二衔接子序列的两条反向平行链。根据一些实施方案，所述至少一个封闭寡核苷酸包括第一封闭寡核苷酸组和第二封闭寡核苷酸组，每组包括一个或更多个封闭寡核苷酸，其被配置为分别封闭多核苷酸中的第一衔接子序列和第二衔接子序列之一的两条反向平行链，其中，使至少一个封闭寡核苷酸与至少一个靶核酸序列接触的子步骤包括：使第一封闭寡核苷酸组和第二封闭寡核苷酸组中的一组与至少一个靶核酸序列接触；并使第一封闭寡核苷酸组和第二封闭寡核苷酸组中的另一组与至少一个靶核酸序列接触。根据该方法的一些实施方案，由生物样品捕获至少一个靶核酸序列的每条链的步骤(2)能包括：通过标记在至少一对rna探针组中的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组中的每一个rna探针上的固定部分，使至少一对rna探针组偶联到固体载体上，从而获得至少一对偶联固体载体的rna探针组，每对包括偶联固体载体的第一rna探针组和偶联固体载体的第二rna探针组；以及使至少一对偶联固体载体的rna探针组中的每一对中的偶联固体载体的第一rna探针组和偶联固体载体的第二rna探针组与至少一个靶核酸序列接触。在偶联固体载体的第一rna探针组和偶联固体载体的第二rna探针组可能相互干扰的实施方案中，诸如当第一rna探针组和第二rna探针组标记在可以在共同反应中混合的珠子上时，使至少一对偶联固体载体的rna探针组中的每一对中的偶联固体载体的第一rna探针组和偶联固体载体的第二rna探针组均与至少一个靶核酸序列接触的该子步骤能包括：在第六杂交反应中使至少一对偶联固体载体的rna探针组中的每一对中的偶联固体载体的第一rna探针组和偶联固体载体的第二rna探针组中的一组与至少一个靶核酸序列接触；在第七杂交反应中使至少一对偶联固体载体的rna探针组中的每一对中的偶联固体载体的第一rna探针组和偶联固体载体的第二rna探针组中的另一组与至少一个靶核酸序列接触。或者，使至少一对偶联固体载体的rna探针组中的每一对中的偶联固体载体的第一rna探针组和偶联固体载体的第二rna探针组与至少一个靶核酸序列接触的子步骤能包括：分别在第八杂交反应和第九杂交反应中，使至少一对偶联固体载体的rna探针组中的每一对中的偶联固体载体的第一rna探针组和偶联固体载体的第二rna探针组单独地与至少一个靶核酸序列接触；以及将第八杂交反应和第九杂交反应结合，从而使得能够进行第十杂交反应。在偶联固体载体的第一rna探针组和偶联固体载体的第二rna探针组彼此不干扰的实施方案中，诸如当第一rna探针组和第二rna探针组偶联在固体表面上的不同区域(例如玻璃/塑料芯片、柱或微流体通道)时，使至少一对偶联固体载体的rna探针组中的每一对中的偶联固体载体的第一rna探针组和偶联固体载体的第二rna探针组与至少一个靶核酸序列接触的子步骤能包括：在单次杂交反应中使至少一对偶联固体载体的rna探针组中的每一对中的偶联固体载体的第一rna探针组和偶联固体载体的第二rna探针组与至少一个靶核酸序列接触。根据所述方法的一些实施方案，所述固定部分能被配置为能够与偶联到所述固体载体的表面上的偶联伴侣形成稳定的非共价结合，并且这样，所述固定部分能包括生物素部分，并且对应地，偶联到固体载体表面上的偶联伴侣能包含链霉亲和素、亲和素或抗生物素抗体中的至少一种。根据所述方法的一些其他实施方案，所述固定部分能被配置为能够与偶联到所述固体载体的表面上的偶联伴侣形成共价连接。固体载体能包括磁珠、过滤器、树脂珠、纳米球、塑料表面、微量滴定板、玻璃表面、载玻片、膜、微流体通道、芯片、或基质中的至少一种。根据上述实施方案中任一项的方法能进一步包括：从固体载体中洗脱出至少一个靶核酸序列。在第二方面，本发明进一步提供了一种试剂盒，用于利用根据如上所述的任何一个实施方案的方法由生物样品富集至少一个靶核酸序列。根据一些实施方案，试剂盒包括至少一对rna探针组和在其表面上标记有偶联伴侣的固体载体。每对rna探针组包括第一rna探针组和第二rna探针组，其被配置为分别靶向至少一个靶核酸序列的每一个中的成对物段的两条反向平行链，其中，第一rna探针组和第二rna探针组的任一组中的每个rna探针用固定部分标记。偶联伴侣被配置为能够与固定部分形成牢固的偶联，从而使得能够将至少一对rna的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组中的任一组中的每个rna探针固定在固体载体上。本文中，至少一对rna探针组中的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组中的任一组中的每个rna探针能具有约100-150nt的长度。在试剂盒中，至少一对rna探针组中的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组可以被配置为分别靶向至少一个靶核酸序列中的每一个中的成对物段的基本上相同的部分或不同的部分。根据试剂盒的一些实施方案，固定部分能包括生物素部分，固体载体包括磁珠、磁珠、过滤器、树脂珠、纳米球、塑料表面、微量滴定板、玻璃表面、载玻片、膜、微流体通道、芯片、或基质中的至少一种，并且固体载体能用链霉亲和素、亲和素，或者抗生物素抗体的至少一种标记。根据一些实施方案，试剂盒进一步包括具有作为固体载体的工作表面的设备。每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组分别偶联到工作表面上，布置为使得偶联固体载体的第一rna探针组中的每个rna探针基本上不与偶联固体载体的第二rna探针组中的每个rna探针相互作用。本文中，设备可以是柱、微流体通道，或芯片中的一种。可选地，每一对中偶联固体载体的第一rna探针组和偶联固体载体的第二rna探针组能分别布置在设备的工作表面的至少一对，并且优选多于一对的两个不同区域。可选地，每一对中偶联固体载体的第一rna探针组和偶联固体载体的第二rna探针组能混合地布置在设备的工作表面上，配置为使得来自第一rna探针组的每个rna探针与来自第二rna探针组的每个rna探针的距离相对较大，从而基本上防止了其之间的相互作用。在以上任何实施方案中，该设备可以被配置为使得生物样品能够不止一轮地顺序地流过工作表面。在生物样品中，至少一个靶核酸序列中的一个或更多个分别在包含至少一个非靶序列的多核苷酸中。这样，试剂盒能进一步包括至少一个封闭寡核苷酸，其被配置为分别与多核苷酸中的至少一个非靶序列的每一个的至少一条链杂交，从而封闭。如果多核苷酸中的至少一个非靶序列包括在至少一个靶核酸序列的一个或更多个的每一个侧翼的第一衔接子序列和第二衔接子序列，则至少一个封闭寡核苷酸能被配置为分别封闭多核苷酸中第一衔接子序列的一条链和第二衔接子序列的一条链，或分别封闭多核苷酸中第一衔接子序列的两条反向平行链和第二衔接子序列的两条反向平行链。这样，在试剂盒中，至少一个封闭寡核苷酸能包括第一封闭寡核苷酸组和第二封闭寡核苷酸组，其被配置为分别封闭多核苷酸中第一衔接子序列和第二衔接子序列之一的两条反向平行链。第一封闭寡核苷酸组和第二封闭寡核苷酸组能被配置为分别靶向多核苷酸中第一衔接子序列和第二衔接子序列之一中的两个不同部分。根据一些其他实施方案，试剂盒能包括多个dna载体，包含atp、utp、gtp和ctp中的每一种的ntp；经固定部分标记的ntp，其中，ntp包括atp、utp、gtp和ctp中的至少一种；以及固体载体，在其表面上标记有偶联伴侣。多个dna载体包括至少一对dna载体，每一对包括第一dna载体和第二dna载体，所述第一dna载体和第二dna载体经转录而配置为分别获得第一rna探针组和第二rna探针组，所述第一rna探针组和第二rna探针组分别靶向至少一个靶核酸序列的每一个中的成对物段的两条反向平行链。偶联伴侣被配置为能够形成与固定部分的牢固偶联。本文中，固定部分可以包括生物素部分，并且用经固定部分标记的ntp可以包括经生物素标记的utp，在试剂盒中所有utp中相对摩尔百分比为2％-100％。固体载体能包括磁性珠、过滤器、树脂珠、纳米球、塑料表面、微量滴定板、玻璃表面、载玻片、膜、微流体通道、芯片或基质中的至少一种，并且可以用链霉亲和素、亲和素或抗生物素抗体中的至少一种标记固体载体。根据一些实施方案，试剂盒能进一步包括rna连接酶，其包含t4rna连接酶或circligaserna连接酶中的至少一种，其被配置为将至少一对dna载体中的每一对产生的第一rna探针组和第二rna探针组中任一组的每个rna探针的3’羟基末端与经固定部分标记的ntp中的一个连接。多个dna载体中的每一个可以包括dna模板和启动子。该dna模板可以包括与至少一个靶核酸序列的每一个中的成对物段的两条反向平行链之一对应的序列。启动子能被配置为在与启动子相容的rna聚合酶的存在下引发dna模板的转录反应。该启动子选自t3启动子、t7启动子、sp6启动子中的一种，并且该试剂盒能对应地进一步包含t3rna聚合酶、t7rna聚合酶或sp6rna聚合酶，其分别对应于多个dna载体的每一个中的启动子。试剂盒能进一步包括细胞或病毒，所述细胞或病毒包含与多个dna载体的每一个中的启动子相容的rna聚合酶。所述细胞能包括细菌细胞系、酵母细胞系或哺乳动物细胞系中的至少一种。取决于不同的宿主细胞或宿主病毒，启动子可以是t3启动子、t7启动子和sp6启动子中的任何一种，并且能可选地是组织或细胞系特异性启动子。这里没有限制。在试剂盒中，多个dna载体中的每一个能是双链dna载体或单链dna载体。在生物样品中，至少一个靶核酸序列中的一个或更多个分别在包含至少一个非靶序列的多核苷酸中。这样，试剂盒能进一步包括至少一个封闭寡核苷酸，其被配置为分别与多核苷酸中的至少一个非靶序列的每一个的至少一条链杂交，从而封闭。如果多核苷酸中的至少一个非靶序列包括在至少一个靶核酸序列的一个或更多个的每一个侧翼的第一衔接子序列和第二衔接子序列，则至少一个封闭寡核苷酸能被配置为分别封闭多核苷酸中第一衔接子序列的一条链和第二衔接子序列的一条链，或分别封闭多核苷酸中第一衔接子序列的两条反向平行链和第二衔接子序列的两条反向平行链。这样，在试剂盒中，至少一个封闭寡核苷酸能包括第一封闭寡核苷酸组和第二封闭寡核苷酸组，其被配置为分别封闭多核苷酸中第一衔接子序列和第二衔接子序列之一的两条反向平行链。第一封闭寡核苷酸组和第二封闭寡核苷酸组能被配置为分别靶向多核苷酸中第一衔接子序列和第二衔接子序列之一中的两个不同部分。在上述方法和试剂盒中，核酸序列能包括来自测试样品的dna和/或rna序列。核酸序列能是获自生物体的天然序列，或者可以是人工制造的人工序列。这里没有限制。测试样品能是来自生物体的生物样品，或者能是人工获得的样品或经过适当处理后获得的样品，只要测试样品包含一个或更多个核酸序列即可。生物样品可以是dna、rna或任何由核酸序列组成的样品，并且样品可以是化学合成产物或从生物中(诸如多细胞动物、植物、真菌、原生生物、细菌、古细菌或上述生物体的任何类型的组织培养物)提取。该生物能来自原核生物和真核生物的任何域。可以在富集之前对测试样品进行处理。例如，可以在富集和测试之前扩增生物样品中的核酸序列。核酸序列可以包含与人类疾病(包括癌症、糖尿病、心脏病等)相关的遗传标记，但是也可以包括与表型(诸如身高、体重、肤色等)相关的标志物。标志物可以包括定性或定量遗传信息。测试样品能来自患者身体内的任何适当来源，具有可以被收集和测试的来自癌症或病变的核酸。测试样品也能来自患者组织的任何合适来源(诸如ffpe载玻片、ffpe组织块)，并且测试样品也可以来自其他生物样品的任何合适来源，诸如化石、古代人类或动物种类遗体。可以从人体组织、粪便和体液(例如血液、眼泪、唾液、痰、支气管肺泡灌洗液、尿液和不同器官分泌的汁液)中获得合适的测试样品。在某些情况下，核酸将在测试前扩增。可以使用本领域中任何常规手段来收集样品，包括从外科手术样品、活检样品、内窥镜超声(eus)、静脉切开术等中获取样品。可以由进行随后分析的同一个人或另一个人进行采样。样品可以在收集之后和分析之前存储和/或转移。在测定之前，可以将样品分级、处理、纯化、富集。根据本发明的一方面，富集样品中的一部分或全部核酸用于核酸分析。合成了用于一个或更多个感兴趣的分析物的探针组。探针是rna探针。探针是从与要富集的靶核酸共享相同序列的dna模板转录而来。rna探针与靶核酸分析物的正链和负链互补。在平行反应系统中合成与靶核酸分析物的正链和负链互补的rna探针。能使用靶核酸序列作为模板通过体外转录大量生成rna探针组。rna探针与固体载体结合。在杂交条件下使固体载体与包含核酸的样品接触，使得样品中的互补核酸被捕获在固体载体上，并且洗涤固体载体以去除非互补核酸。从固体载体中洗脱经捕获的核酸，用于进一步分析。根据本发明的另一方面，富集样品中的一部分或全部核酸用于核酸分析。合成了用于一个或更多个感兴趣的分析物的探针组。探针是rna探针。探针是从与要富集的靶核酸共享相同序列的dna模板转录而来。rna探针与靶核酸分析物的正链和负链互补。在平行反应系统中合成与靶核酸分析物的正链和负链互补的rna探针。能使用靶核酸序列作为模板通过体外转录大量生成rna探针组。通过超声将转录或合成的rna探针剪切成片段。能将经修饰的核酸(诸如生物素化尿嘧啶)添加入rna探针中，或者能在rna探针的核酸序列的末端或之内进行其他核酸修饰，这两种修饰均能够使得rna探针固定或捕获并在捕获过程后再提取。在杂交条件下，使rna探针与包括核酸的样品接触，使得捕获样品中的互补核酸。使杂交反应混合物与固体载体接触，该固体载体包括特异性地与rna探针上的修饰基团(诸如生物素)反应的化学结构(诸如亲和素或链霉亲和素)。具有经捕获的互补核酸的rna探针被固定，或被捕获在固体载体上。洗涤固体载体以去除非互补核酸。从固体载体中洗脱捕获的核酸，用于进一步分析。对于本领域技术人员而言，在阅读说明书后将显而易见的这些和其他实施方式向本领域提供了用于评估、表征和检测遗传标志物(诸如癌症标志物)和遗传分析(诸如snv鉴定)的方法。特别地，它提供了富集所需分析物的核酸的方法。在整个本发明中，除非另外指出，否则“上游”和“下游”分别定义为核酸序列链(dna链或rna链)的5’末端和3’末端的核酸序列。除非另有说明，否则本文公开的所有dna序列均具有从其5’末端和3’末端的方向。除非另有说明，否则寡核苷酸能是具有至少2nt的序列的单链dna寡核苷酸，或单链rna寡核苷酸。本发明中的术语“约”通常是指所指示数字的正负10％。例如，“约20”可以表示18到22的范围，“约1”可以表示0.9-1.1。从上下文中，“约”的其他含义也很明显，例如四舍五入，因此，例如“约1”也可以表示0.5到1.4。除非另有说明，否则本发明中的术语“探针”被称为诱饵分子，其可用于捕获或富集靶分子。具体地，在本发明中，rna探针基本上是诱饵rna分子，其用于捕获和富集靶核酸序列，rna探针包括dna序列或rna序列或可与rna探针形成杂交分子的任何其他核酸序列。如本文所用，术语“杂交”或“结合”或“退火”是指互补的(包括部分互补的)多核苷酸链的配对。杂交和杂交强度(例如，多核苷酸链之间的结合强度)受到本领域众所周知的许多因素(包括多核苷酸之间的互补程度、受诸如盐浓度、所形成的杂交体的解链温度(tm)、杂交反应的温度、其他组分的存在、杂交链的摩尔浓度和多核苷酸链的g:c含量的条件影响的所涉及条件的严格性)的影响。当说一个多核苷酸“杂交”到另一个多核苷酸时，意味着这两个多核苷酸之间存在某种互补性，或者这两个多核苷酸在高严格条件下形成了杂交。当说一个多核苷酸不与另一个多核苷酸杂交时，意味着这两个多核苷酸之间不存在序列互补性，或者在高严格条件下两个多核苷酸之间不形成杂交。相关地，本发明中的术语“靶”、“靶向”等，诸如短语“靶向dna分子的rna探针”是指rna探针能特异性与dna分子的一条链杂交，或结合，或退火的情况。如本文所用，术语“互补”是指两个多核苷酸链的区域之间(例如，双链结构)或同一多核苷酸链的两个区域之间(例如，“环”或“发卡”结构)的序列互补性的概念。已知第一多核苷酸区域的腺嘌呤碱基能够与第二多核苷酸区域的碱基形成特异性氢键(“碱基配对”)，如果第二多核苷酸区域的碱基是胸腺嘧啶或尿嘧啶，则该第二多核苷酸区域与第一区域反向平行。类似地，已知第一多核苷酸链的胞嘧啶碱基能够与第二多核苷酸链的碱基配对，如果第二多核苷酸区域的碱基是鸟嘌呤，则该第二多核苷酸链与第一链反向平行。如果例如当两个区域以反平行方式排列时，该第一区域的至少一个核苷酸能够与第二区域的碱基进行碱基配对，则该多核苷酸的第一区域与相同或不同多核苷酸的第二区域互补。因此，不需要两个互补的多核苷酸在每个核苷酸位置均碱基配对。“互补”是指与第二多核苷酸100％或“完全”互补的第一多核苷酸，因此在每个核苷酸位置形成碱基对。“互补”也指不是100％互补的(例如90％或80％或70％互补)第一多核苷酸在一个或更多个核苷酸位置上包含错配的核苷酸。在一个实施方案中，两个互补多核苷酸能够在高严格性杂交条件下彼此杂交。如本文所用，术语“靶核酸”或“靶”是指含有待鉴定的靶核酸序列的核酸。靶核酸可以是单链或双链，并且通常是dna、rna、dna或rna的衍生物或其组合。“靶核酸序列”、“靶序列”或“靶区域”是指包含单链核酸的全部或部分序列的特异性序列。靶序列可以在核酸模板内，其可以是任何形式的单链或双链核酸。模板可以是经纯化的或经分离的核酸，或者可以是未纯化的或非分离的。靶或靶核酸通常存在于多核苷酸的部分或全部中，并且通常是多核苷酸分析物。通常已知靶核苷酸序列的同一性的程度足以使得能够制备可与靶材料杂交的各种探针/诱饵序列。靶物质通常是较大分子池的一部分，或者它可以基本上是整个分子，诸如如上所述的多核苷酸。核酸序列的成对物段的术语“反向平行链”是指核酸序列的两条链在相反方向上对齐的情况(即一条链在5’末端至3’末端方向，另一条在3’末端至5’末端方向)，并由于两条链的杂交而形成双链(即“双链”)结构。成对物段的两条反向平行链可能是双链dna片段的两条互补dna链(“dna-dna”)、双链rna片段的两条互补rna链(“rna-rna”)，或双链dna-rna片段的两条互补dna和rna链(“dna-rna”)。核酸序列能是双链的，并且其成对物段的两条反向平行链分别是核酸序列的两条互补链。或者，核酸序列能是单链的，其中成对物段的两条反向平行链基本上形成单链核酸序列的“发卡”或“环”片段。术语“与启动子相容的rna聚合酶”定义为能识别启动子从而使用启动子下游的dna模板启动rna分子转录的rna聚合酶。术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”、“第五”等旨在表示不同的对象(即组件、组成、过程等)，并不代表或暗示发明中的实际顺序。附图说明图1a-1c分别示出了根据本发明的两个实施方案的由生物样品富集至少一个靶核酸序列的方法的流程图；图1d-1j分别示出了根据本发明的几个不同实施方案的设备的示意性结构，所述设备具有rna探针组的每一对，所述rna探针组的每一对布置在其内表面上以使得能够从生物样品捕获靶核酸序列；图2a和2b分别示出了图1a所示的根据本发明的两个实施方案的步骤s100的流程图；图3a和图3b分别示出了根据本发明的一些实施方案的用于转录获得靶向靶核酸序列的正链的第一rna分子和靶向负链的第二rna分子的第一dna载体和第二dna载体的结构图；图3c和图3d分别示出了根据本发明一些其他实施方案的第一dna载体和第二dna载体的结构图；图4a和图4b分别示出了根据本发明的两个实施方案的制备分别靶向一个靶核酸序列的正链和负链的一对rna探针组的过程；图5a和5b分别示出了根据本发明的两个实施方案的方法的步骤s200的流程图；图6a是根据一些应用了封闭寡核苷酸的实施方案的rna探针与靶核酸序列的杂交过程的示意图；图6b示出了靶向由正链和负链组成的双链靶核酸序列，以及具有发卡结构的成对物段的单链靶核酸序列，用于使用本文公开的方法捕获和富集；图7a和7b示出了从为基于ngs的测序测定而产生的dna文库富集靶序列的过程；图8a-8d示出了基于该方法的dna双链捕获的性能评估。(图8a)对于源自不同量(500ng、20ng、1ng、100pg、20pg和10pg)的输入基因组dna的六个ngsdna文库的每一个，计算了298个癌症相关基因的富集效率。通过实时pcr测定定量了六个文库中所有298个基因的双链dna捕获和单链dna捕获的回收率，实时pcr测定使用不同的方法(靶向双dna链或靶向单dna)检测捕获前后，文库中每个基因的丰度。(图8b)构建了具有由5个基因的扩增子区域组成的插入序列的质粒，所述5个基因的gc含量覆盖了宽范围(27.3％至74.1％)。(图8c)图3e所示质粒的连续稀释液的实时pcr分析。加入1、10、100、1,000和10,000飞摩尔的质粒作为检测模板。绘制从每个质粒量获得的每个基因的ct值，并显示趋势线。(图8d)在琼脂糖凝胶上分析了原始基因组dnangs文库，以及由靶向靶序列区域的单个dna链或两条dna链的rna探针捕获的文库分子；图9a和9b示出了基于rna探针的dna双链捕获wes(全外显子组测序)研究的snv调用趋势和统计；图10a-10c显示了读数统计。(图10a)起始读数、经匹配读数和过滤后保留读数的百分比的柱状图。从三个技术重复获得结果。每一柱均显示读数的数量，单位为100万次读数。(图10b)三次重复中的经过滤的读数的亚组的堆积柱状图。(图10c)覆盖效率与读数数量的关系。显示了具有500万至5000万读数的覆盖深度≥10x、≥20x、≥50x和≥100x的靶标碱基的百分比；图11a和11b示出了读数深度的密度图，以证明对于使用提取自正常组织的dna的基于rna探针的dna双链捕获方法的ngswes研究(图11a)；(图11b)使用提取自正常组织的dna的ngs全基因组测序(不富集全外显子组)的gc含量与归一化平均读数深度之间的关系；图12示出了在由添加有顺序稀释的肿瘤dna样品的正常dna产生的文库中检测超稀有snv；图13a-13n显示了298个基因的组的实时pcr参数；图14示出了从基于rna探针的dna双链捕获wes测序得到的数据产量；以及图15a-15e示出了通过基于rna探针的dna双链捕获ngs的突变和超稀有突变检测的结果。具体实施方式在诸如ngs的测序技术中，从经稀释样品中富集核酸或从包含复杂核酸池的样品中捕获特定核酸序列通常是关键步骤，但在许多情况下能是具有挑战性的任务。所需序列的富集能使测定可行，否则该测定将落入检测限以下，并能改善遗传或基因组测定的性能。本
发明内容提供了一种用于由生物样品富集核酸序列的方法，该方法基本上利用靶向要富集在样品中的靶序列的成对物段的两条反向平行链的rna探针。图1a示出了根据本发明的一些实施方案的由生物样品富集至少一个靶核酸序列的方法的流程图。如图1a所述，该方法包括如s100-s400所述的步骤：s100：制备至少一对rna探针组，每对rna探针组包括第一rna探针组和第二rna探针组，其被配置为分别靶向至少一个靶核酸序列的每一个中的成对物段的两条反向平行链，其中，第一rna探针组和第二rna探针组的任一组中的每个rna探针用固定部分标记。具体地，每一对rna探针组包括彼此对应的第一rna探针组和第二rna探针组，并且每一个包括一个或更多个rna探针。第一rna探针组中的一个或更多个rna探针和第二rna探针组中的一个或更多个rna探针被配置为分别靶向生物样品中至少一个靶核酸序列的一个的成对物段(即双链的段)的两个反向平行链。第一rna探针组和第二rna探针组中的任一组中的每个rna探针都用固定部分标记或包含固定部分，被配置为使得能够通过固体载体进行固定，这将在下面详细描述。在本文中，对生物样品的来源，至少一个靶核酸序列的类型，或至少一个靶核酸序列的每一个中的成对物段的类型没有限制。生物样品可以是组织样品，通过dna或rna纯化方案从中获得至少一个靶核酸序列。生物样品可以是获自血浆的无细胞dna样品，其在样品中包含至少一个靶核酸序列。所述生物样品可以源自经处理的样品，并且包含例如专利申请pct/us2018/016778中公开的条形码化dna文库，其中至少一个靶核酸序列中的每一个在一端或两端上包含条形码化衔接子。其他可能性也是可能的。生物样品中的至少一个靶核酸序列能包括一个或更多个dna分子，一个或更多个rna分子，一个或更多个dna-rna杂合分子或它们的任何组合。至少一个靶核酸序列的每一个中的成对物段可以由双链dna分子的两条分开的dna链，双链rna分子的两条分开的rna链或dna-rna杂合分子的一条dna链和一条rna链形成。成对物段也可以是在一条单dna链内或一条单rna链内形成的链内发卡或类似物。在任何上述情况下，成对物段基本上包括来自一条单链(即，链内双链体)或两条独立链(即，链间双链体)的两个链片段，每个具有使得能够在其间杂交的序列(例如具有彼此基本互补的序列)并且彼此反向平行延伸，从而形成双链(即双链体)结构。不论靶核酸序列的类型(dna或rna)或其中的成对物段的类型(链间或链内)，第一rna探针组和第二rna探针组能分别配置为靶向生物样品中至少一个靶核酸序列的每一个的成对物段的两条反向平行链，其共同形成对应于至少一个靶核酸序列中的每一个的一对rna探针组。本文中，在整个公开内容中，并且除非另有说明，否则生物样品中至少一个靶核酸序列的每一个的成对物段的两条反向平行链被称为至少一个靶核酸序列的每一个的正链和负链。换句话说，第一rna探针组中的至少一个rna探针和第二rna探针组中的至少一个rna探针分别被配置为靶向至少一个靶核酸序列中的一个的正链和负链，或者可替代地负链和正链。通过至少一对rna探针组(其中每对中的第一rna探针组和第二rna探针组分别靶向每个靶核酸序列中成对物段的两个反向平行链)，能由生物样品捕获或富集至少一个靶核酸序列。典型的实例是，每个靶核酸序列能是双链dna分子，其具有反向平行延伸以形成双链体的正链和负链。通过至少一对rna探针组(其中每对中的第一rna探针组和第二rna探针组分别靶向每个靶核酸序列中的两条反向平行链(即，正链和负链))，能由生物样品捕获或富集每个靶dna分子的每条链(包括正链和负链)。这与常规方法形成鲜明对比，在常规方法中，仅捕获了每一个靶核酸序列的一条链，因为仅利用了仅靶向每一个靶核酸序列的一条链的rna探针或一个rna探针组。更具体地说，在常规方法中，有效捕获通常是分别来自靶核酸序列和探针的两个互补序列之间的一级反应。然而，在本发明中，有效捕获是具有成对物段的靶核酸分子(例如双链体双链dna分子)与一对rna探针(即第一rna探针和第二rna探针)中的每一个之间的二级反应，一对rna探针中的每一个分别靶向成对物段的两条反向平行链，其中靶核酸分子的成对物段中的一条链与一对rna探针中的一个的杂交可以帮助暴露成对物段的另一条链，从而促进一对rna探针中的另一个与其杂交。因此，可以实现更高的捕获效率，并且已经在下面详细描述的实验中观察到了这种效果。本文中，固体载体能包括磁珠、微流体通道、过滤器、树脂珠、纳米球、塑料表面、微量滴定板、玻璃表面、载玻片、膜、微流体通道、芯片或基质中的至少一种，其用对应于固定部分的偶联伴侣标记、偶联，或者附着。固体载体可以是设备的一部分，诸如芯片、柱、管或通道(诸如微流体芯片中的微流体通道)。标记于每一个rna探针的固定部分能包括生物素部分，并且对应地，固体载体能包括磁珠、过滤器、树脂珠、纳米球、塑料表面、微量滴定板、玻璃表面、载玻片、膜、微流体通道、芯片或基质中的至少一种，并且可以用链霉亲和素、亲和素或抗生物素抗体中的至少一种标记固体载体。这样，标记或带有生物素部分的rna探针能与生物素偶联伴侣(诸如链霉亲和素，亲和素或抗生物素抗体)偶联的固体载体形成牢固的非共价结合，其促进通过rna探针的杂交捕获靶核酸序列。固定部分-偶联伴侣对的其他实例可以包括但不限于碳水化合物-凝集素对、抗原-抗体对和带负电基团-带正电基团的静态相互作用对。除了上述实施方案之外，其中每一个rna探针通过固定部分和偶联伴侣对之间的非共价结合与固体载体结合，每一个rna探针和固体载体之间的牢固偶联可以是通过共价连接(或交联)的。这样，固定部分和偶联伴侣可以分别是交联对中的一个和另一个。交联对的实例包括nhs酯-伯胺对、巯基反应性化学基团对(例如半胱氨酸或其他巯基(诸如马来酰亚胺、卤代乙酰基和吡啶基二硫化物))、氧化的糖-酰肼对，可光活化的硝基苯基叠氮化物的uv引发带有双键的加成反应，引起c-h和n-h位点的插入或随后的扩环以与亲核试剂(例如伯胺)或碳二亚胺活化的羧基反应成氨基(伯胺)等。注意rna探针能在合成后偶联到固体载体上，或者能直接合成到固体载体上。能采用任何可能使得rna探针与固体载体连接的方法。本文中没有限制。本文中，注意至少一对rna探针组中的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组可以被配置为分别靶向至少一个靶核酸序列中的一个中的成对物段的相同的部分或不同的部分。根据一些实施方案，在对应的一对rna探针组中的第一rna探针组和第二rna探针组被配置为靶向一个靶核酸序列的成对物段的相同部分，并且这样，第一rna探针组中的rna探针和第二rna探针组中的rna探针具有基本互补的序列。这样，在某些实施方案中，其中第一rna探针组和第二rna探针组之间的rna探针可能由于彼此之间的不需要的杂交而在单次杂交中潜在地彼此相互作用或相互干扰，诸如在将rna探针标记在珠子或基质上的情况下优选以顺序方式使第一rna探针组和第二rna探针组接触含有靶核酸序列的生物样品。这可以通过使包含靶核酸序列的生物样品与分别带有第一rna探针组和第二rna探针组中的一组和另一组的磁珠顺序地接触来实现，这将在下面详细描述。这也能通过使生物样品依次流过柱的两个不同层(10a和20a)来实现，该柱包括分别与第一rna探针组和第二rna探针组偶联的基质，如图1d所示。然而，注意在一些rna探针分别偶联到固体载体(该固体载体由于例如在固体载体表面上的位置分隔而没有或几乎没有相互作用)上的其他实施方案中，诸如来自第一rna探针组的rna探针和来自第二rna探针组的rna探针分别偶联到微流体通道的不同区域(图1e)或芯片的不同区域(图1f)上，或来自第一rna探针组的每个rna探针与来自第二个rna探针组的每个rna探针的距离相对较大地混合排列在微流体通道(图1g)或芯片(图1h)的同一区域上(从而基本上防止了它们之间的相互作用)的情况下，不需要在生物样品与第一rna探针组和第二rna探针组之间进行顺序接触，并且可以将生物样品应用于同时接触第一rna探针组和第二rna探针。然而，根据某些实际需要，仍然使得生物样品能够通过顺序地流过微流体通道或芯片的两个不同区域来接触第一rna探针组和第二rna探针组中的rna探针，如图1e和1f所示，两个不同区域分别对应于第一rna探针组和第二rna探针组。进一步注意，通过连续布置第一rna探针组和第二rna探针组，(如图1i所示)，通过将生物样品进行再循环(如图1j所示)，或通过这两种方法的组合，柱或微流体通道的使用进一步为生物样品与rna探针的重复接触提供了便利。下面将提供通过至少一对rna探针组从生物样品捕获靶核酸序列的方法的这些以上不同实施方案中的每一个的细节。这样，上述图1d-1j分别示出了几个不同的实施方案，其中每对rna探针组被布置在设备(微流体通道或芯片)的内表面上以使得能够由生物样品捕获靶核酸序列。注意，这些实施方案仅是例示，并且也能有其他设备。根据一些其它的实施方案，对应的一对的rna探针组中的第一rna探针组和第二rna探针组被配置成分别靶向一个靶核酸序列的成对物段的不同部分。换句话说，在对应的一对rna探针组中的第一rna探针组和第二rna探针组分别被配置为靶向一个靶核酸序列的第一链中的第一部分和第二链中的第二部分，其中，第一链和第二链是成对物段的两条反向平行链，并且第一部分和第二部分是一个靶核酸序列的成对物段的两个不同部分。这样，第一rna探针组中的rna探针和第二rna探针组中的rna探针基本上没有互补序列。这样，无论采用何种类型的固体载体与rna探针偶联，均能将含有靶核酸序列的生物样品同时应用于第一rna探针组和第二rna探针组。为了在步骤s100中制备至少一对rna探针组，每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组中的任一组都可以通过直接化学合成的方式或通过转录的方式，或通过这些方法的各种组合来制备，并可以在合成/转录过程中或之后用固定部分标记。下面将详细描述不同的实施方案。根据一些实施方案，对应于至少一对rna探针组中的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组中的任一组中的每个rna探针能通过化学反应直接合成(即，直接化学合成的方式)。根据不同情况，可以在合成过程中或合成过程后将固定部分标记到每个rna探针上，或者可以从固体载体直接合成每个rna探针，该固体载体通过固定部分与每个rna探针的一末端共价连接。根据一些其他实施方案，第一rna探针组和第二rna探针组中的人一组中的每个rna探针可以通过在其对应的dna载体对上的转录反应(即转录的方式)分别并各自获得，并且在转录过程中或转录过程之后，可以将固定部分标记到每一个rna探针上。关于转录过程，一对dna载体中的每一个能包括dna模板和启动子(即转录启动子)。dna模板能包括转录产生的对应于一个靶核酸序列的成对物段的两条反向平行链中的任一个的rna分子的序列。启动子被配置为被rna聚合酶识别，从而使得转录反应能够发生，并且能在dna载体中靶dna序列的上游、下游或之内。与直接化学合成的方式相比，这种基于转录的获得rna探针的方法相对更具成本效益，并且使得能够生产相对大量的rna探针。在前述实施方案中，至少一对rna探针组中的每一对中的至少一个rna探针是通过转录制备的，步骤s100能包括：s110：制备了多个dna载体，其包括至少一对dna载体，每一对包括第一dna载体和第二dna载体，其被配置为分别使得第一rna分子和第二rna分子能够单独转录，所述第一rna分子和第二rna分子能够分别靶向至少一个靶核酸序列中的每一个的成对物段的两条反向平行链。根据图3a和3b所示的一些实施方案，至少一对dna载体中的每一对中的第一dna载体001a和第二dna载体001b能分别包括在第一转录启动子200a的下游第一dna模板100a和在第二转录启动子200b的下游的第二dna模板100b。第一dna模板100a和第二dna模板100b中的每一个基本上是双链dna片段(在两个图中用虚线框表示)，被配置为使得能够使用其一条链作为模板在转录反应中转录启动子的作用进行rna分子转录。具体地，第一dna载体001a在对应于一个靶核酸序列的正链(如“+”号所示)的双链第一dna模板100a的一条链的5’末端(即上游)包含第一转录启动子200a，并且因此，其被配置为使得与作为转录模板的一个靶核酸序列的负链(如“-”号所示)互补的第一rna分子能够转录。这样，由第一dna载体001a产生的rna分子能特异性地靶向(即杂交或结合或退火)一个靶核酸序列的负链。第二dna载体001b在对应于一个靶核酸序列的负链(如“-”号所示)的双链第一dna模板100a的一条链的5’末端(即上游)包含第一转录启动子200b，并且因此，其被配置为使得与作为转录模板的一个靶核酸序列的正链(如“+”号所示)互补的第二rna分子能够转录。这样，由第二dna载体001b产生的rna分子能特异性地靶向(即杂交或结合或退火)一个靶核酸序列的正链。这样，在每个对应的dna载体对中，第一dna载体001a和第二dna载体001b分别使得特异性靶向靶核酸序列的负链的第一rna分子和特异性靶向靶核酸序列的正链的第二rna分子能够转录。在如上所述的至少一对dna载体(即第一dna载体和第二dna载体)的每一个中，第一启动子200a和第二启动子200b能基本相同或不同，并且不同的dna载体对能具有相同或不同的启动子。这些启动子能包括t3启动子、t7启动子、sp6启动子或物种特异性或组织特异性启动子。本文中，与样品中的每个靶核酸序列对应的第一dna载体和第二dna载体中的每一个中的双链dna片段能包含基因组dna片段、基因编码序列(cds)或现有的构建体(诸如可商购的基因表达构建体)中此类序列，或者可以源自rna序列(诸如mrna序列)的逆转录，或者能包括人工合成或组装的片段。应注意，如图3a和图3b所示的上述实施方案，其中每对dna载体中的第一dna载体001a和第二dna载体001b基本上都是双链dna载体，并且第一dna模板100a和第二dna模板100b的每一个以双链形式存在，并位于转录启动子的下游，其仅作为示例，并不对本发明的范围构成限制。其它实施方案也是可能的。例如，根据图3c和3d所示的一些其他实施方案，第一dna载体001a’和第二dna载体001b’中的每一个可以是单链dna载体(诸如噬菌粒或质粒，或含有从rna序列逆转录反应产生的cdna分子的载体)。第一dna载体001a’在第一dna模板100a’的3’末端包括第一启动子200a’，第一dna模板100a’对应于一个靶核酸序列的成对物段的正链(如“+”号所示)。第二dna载体001b’在第二dna模板100b’的3’末端包括第二启动子200b’，第二dna模板100b’对应于一个靶核酸序列的成对物段的负链(如“-”号所示)。因此，第一dna载体001a’和第二dna载体001b’的转录能分别产生靶向一个靶核酸序列的成对物段的正链和负链的rna分子。根据本发明的又一些其他实施方案，每对dna载体中的第一dna载体和第二dna载体可以是不同类型。例如，第一dna载体能是双链dna载体，而第二dna载体能是单链dna载体，并且其进一步被配置为使得第一dna载体和第二dna载体的转录能分别产生靶向一个靶核酸序列的成对物段的两条反向平行链(例如，正链/负链或负链/正链)的rna分子。在dna载体的上述任何实施方案中，转录启动子被置于靶dna序列的上游。取决于具体情况，转录启动子的相对位置不限于靶dna序列的上游，并且也能在靶dna序列的内部或下游。这样，对每对dna载体中的第一dna载体和第二dna载体的性质和类型没有限制，只要对第一dna载体和第二dna载体的分别的转录反应能够获得分别靶向每个靶核酸序列的成对物段的两条反向平行链的第一rna分子和第二rna分子。在子步骤s110之后，有该方法的步骤100的多个实施方案，其中至少一对rna探针组中的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组是通过对多个dna载体中的每一个中的第一dna载体和第二dna载体进行转录反应而获得的，以及第一rna探针组和第二rna探针组中的任一组中的每个探针都用固定部分标记或带有固定部分。根据如图2a所示的一些优选实施方案，固定部分在转录过程中被标记。这样，在子步骤s110之后，该方法的步骤s100进一步包括：s120：对每个dna载体分别进行转录反应，以产生多个对应于每个dna载体的rna分子，并用固定部分标记。本文中，转录反应可以是常规的体外转录反应，并且涉及rna聚合酶和四种核苷三磷酸(atp、utp、gtp、ctp，统称为ntp)。rna聚合酶能识别dna模板(即，分别对应于每个靶核酸序列的两条反向平行链的第一dna模板或第二dna模板)的转录启动子(即，第一dna转录启动子或第二dna转录启动子)，从而使得具有靶向/互补每个核酸序列的正链/负链的序列的rna分子(即第一rna分子和第二rna分子)能够转录。rna聚合酶能是触发dna依赖的rna聚合的任何酶，并且能是例如t7rna聚合酶。能使用rna纯化方案从反应中纯化rna分子，并且可以通过应用可降解dna分子的酶(诸如dnase)消除反应中的dna分子。如果要捕获的靶标核酸序列包括dna分子，则需要从rna分子中完全去除此类酶，但是如果靶标核酸序列是对dnase诱导的损伤不敏感的核酸(诸如rna分子)，则可以跳过此去除步骤。从dna分子去除dna分子或分离rna分子的其他方法也是可能的。例如，将dna载体预先固定在固体载体上，该固体载体能在转录反应完成后不去除转录的rna的情况下容易地从反应中去除。通过应用偶联对之间的相互作用，能直接从系统中提取rna分子，诸如使用链霉亲和素珠提取生物素化的rna分子。转录反应也能是体内转录反应，并且可以在生物体中(诸如细菌(例如大肠杆菌)、真菌(例如酵母)、哺乳动物细胞系等)合成。rna分子能是根据常规rna提取方案提取，并可以留在系统中以对其靶标核酸序列进行实时标记或捕获。本文中，子步骤s120能直接产生多个rna分子，每个rna分子都用固定部分标记。具体地，由于固定部分和固体载体之间的稳定偶联，在步骤s300中(请参阅下文)标记在每个rna分子上的固定部分(进一步标记在源自rna分子的rna探针上)能促进将至少一个靶核酸序列固定(或捕获)到固体载体上。稳定偶联能通过牢固和稳定的非共价结合，或通过固定部分和偶联到固体载体上的对应应偶联伴侣之间的共价连接(即，交联)来介导。取决于不同类型的固体载体，以及每个固定标记的rna探针和与偶联伴侣偶联的固体载体之间不同类型的偶联，能有不同的实施方案。例如，在一些优选的实施方案中，固定部分是生物素部分，并且偶联伴侣可以是链霉亲和素、亲和素或抗生物素抗体，其附着于或偶联于诸如磁珠的固体载体上，如图7a和图7b所示。在另一个实例中，每个rna探针通过共价连接偶联到微流体通道或芯片的内表面，如图1e-1h所示。这样，通过由rna分子衍生获得的每个rna探针上的每个固定部分与偶联到固体载体上的其对应的偶合伴侣之间的稳定偶联，至少一个rna探针可以被固体载体固定化，进而促进靶核酸序列的后续富集、分离和纯化。注意，为了为其他应用(例如，可视化)引入便利，除了固定部分之外，每个rna探针能进一步用其他功能部分标记。实例包括染料、荧光基团，或者化学基团等。在优选的一些具体实施方案中，子步骤s120中的转录反应能包括添加包括经生物素标记的utp(即，本文中的生物素部分在至少一个功能部分中作为固定部分)和非-生物素标记的utp的混合物，其中，经生物素标记的utp的相对摩尔百分数为全部utp的～2％-100％。换句话说，在反应中添加的所有utp中，经生物素标记的utp可占约2％至约100％之间的摩尔百分比(即，所有添加的utp都是经生物素标记的utp)。这样，在转录后，多个长度约为200nt的rna分子中的每一个能在其一些或全部u残基中用生物素标记。s130：合并多个rna分子以获得至少两个rna库，每个rna库包含至少一个rna分子，其被配置为使得分别靶向一个靶核酸序列的成对物段的两条反向平行链的对应的rna分子对不在同一rna库中。在子步骤s120中转录后，能将多个标记的rna分子合并到至少两个rna库中(或称为rna文库)，每个rna库包含至少一个rna分子。配置成对应的rna分子对(即分别靶向一个靶核酸序列的成对物段的两条反向平行链的第一rna分子和第二rna分子)不在同一rna库中，从而在随后的杂交和富集靶核酸序列的步骤中避免了干扰。在一个具体的实施方案中，将多个rna分子合并到两个rna库(第一rna库和第二rna库)中，并且第一rna库和第二rna库分别包括rna分子，所述rna分子各自特异性靶向一个但不均靶向每个靶核酸序列的正链和负链。注意，能基于不同的需要修改子步骤s130。例如，当合并时，多个rna分子中的每一个能具有相同的比例，或能具有不同的比例，以确保高效捕获/富集生物样品中至少一个靶核酸序列的不同序列片段。例如，在某些特定靶核酸序列难以捕获的情况下(这可以基于先前的知识，或者可以通过应用所有步骤s100-s400的初步实验来知道，并鉴定出一些捕获不理想的靶核酸序列)，在子步骤s130中，一对rna探针组的丰度或靶向对应于这些特定靶核酸序列的一条特定链的rna探针的丰度能增加(例如增加～10倍或更高，或增加～1.5倍；在此没有限制)，从而提高了捕获效率。进一步注意，除了子步骤s130中的上述优化(即，比例的调整)之外，能选择一个靶序列中的不同片段用于生成rna探针，以便如果从一个特定靶片段产生的rna探针无法提供预期的捕获效率而优化捕获。s140：分别对至少两个rna库的每一个进行片段化反应从而获得至少一对rna探针组。为了提高后续步骤s200和s300的效率，可以将每个rna库中相对较长的rna分子优选片段化为相对较短的～100-150nt片段，这可以通过例如酶促反应或超声处理完成。核酸的酶促反应或超声处理的条件是本领域众所周知的，并且能适当且方便地使用。片段化后，至少两个rna探针库的每一个中的至少一个rna探针的长度可以为至少2nt，优选100-150nt。本文中注意，逆转子步骤s130和s140的顺序是可能的。例如，在获得用至少一个功能部分标记的多个rna分子的子步骤s120之后，可以在合并(即s130)之前将多个rna分子片段化(即s140)，从而获得至少一对rna探针组。除了如上所述的实施方案之外，根据本发明的一些其他实施方案，能可替代地转录多个rna分子而无需标记，并且此后可以标记至少一个功能部分。图2示出了步骤s100的一个实施方案。如图所示，在子步骤s110之后，步骤100进一步包括：s120’：对每个dna载体分别进行转录反应以获得与其对应的多个rna分子。本文中，子步骤s120’与前述子步骤s120基本相同，除了没有经功能部分标记的ntp(例如经生物素标记的utp)添加到转录反应中。s130’：合并多个rna分子以获得至少两个rna库，每个rna库包含至少一个rna分子，其被配置为使得分别靶向一个靶核酸序列的成对物段的两条反向平行链的对应的rna分子对不在同一rna分子库中。本文中，子步骤s130’与前述子步骤s130基本相同，因此在此省略技术细节。s140’：对至少两个rna库的每一个进行片段化反应。本文中，子步骤s140’与前述子步骤s140基本相同，因此在此省略技术细节。s150’：对至少两个rna库的每一个进行标记反应从而获得至少一对rna探针组。本文中，通过s150’，能将固定部分标记在至少两个rna库中的任何一个中的每个rna探针上。根据一些优选的实施方案，所述固定部分是生物素部分，并且能在该子步骤的每个rna探针的5’末端和/或3’末端和/或链内核酸残基上进行标记。注意，还能将其它功能部分标记在至少两个rna库中的任何一个中的每个rna探针上。上面已经提供了技术细节，在此跳过。本文中注意，逆转子步骤s130’和s150’的顺序是可能的。例如，在获得多个rna分子的子步骤s120’之后，可以在合并(即s130)之前将多个rna分子片段化(即s140’)和标记(即s150’)，从而获得至少一对rna探针组。或者，在子步骤s120’之后，能在片段化(即s140’)和合并(即s130)之前将多个rna分子标记(即s150’)，从而获得至少一对rna探针组。这里没有限制。在下文中，提供了两个具体的实施方案以分别示出制备一对rna探针组(即第一rna探针组和第二rna探针组)的两种不同方法，一对rna探针组分别靶向一个靶核酸序列的成对物段的两条反向平行链(即正链和负链)。在如图4a所示的一个实施方案中，在相同的转录和标记过程中制备一对rna探针组并进行生物素标记。具体地，如图3a和3b所示，分别在第一dna载体001a和第二dna载体001b上进行两个转录反应，从而分别产生多个第一rna分子300a和多个第二rna分子300b，其分别配置为靶向要富集或捕获的一个靶核酸序列的负链和正链。同时，多个第一rna分子300a和多个第二rna分子300a’也分别用一个或更多个生物素部分标记(在图4a中显示为与每个rna探针连接的实心点)。这能通过向转录反应提供包含生物素化utp(即经生物素标记的utp)和常规utp(即非生物素标记的utp)的utp的混合物来完成，其中，经生物素标记的utp能具有utp总量的～2％-100％的相对摩尔百分比。在一个具体的实例中，可以将经生物素标记的utp和常规utp的比例为1/3的混合物(即，经生物素标记的utp的相对摩尔百分比为utp总量的25％)添加到转录反应中。这样，可以发现整个rna序列中约1/4的u残基被生物素部分标记。然后，在转录和标记过程之后，将多个第一rna分子300a和多个第二rna分子300a’分别片段化为第一rna探针组500a和第二rna探针组500b，其长度能优选为～100-150nt。在如图4b所示的另一个实施方案中，在转录过程之后，将一对rna探针组用生物素标记。具体地，如图3a和3b所示，分别在第一dna载体001a、第二dna载体001b上进行两个转录反应，从而分别产生多个第一rna分子300a’和多个第二rna分子300b’，其分别配置为靶向要富集或要捕获的一个靶核酸序列的负链和正链。转录后，将多个第一rna分子300a’和第二rna分子300b’分别片段化为第一rna探针组400a’和第二rna探针组400b’，然后分别用生物素部分标记(显示为与每个rna探针的一端相连的实心点)，从而获得经生物素标记的第一rna探针组500a’和第二rna探针组500b’。本文中，在每个rna探针的5’末端标记生物素部分仅是为了说明目的，也能在3’末端或其链内片段。根据一些具体实施方案，在每个连接反应中，能将生物素标记的核苷酸的5’磷酸末端连接到至少一对rna探针组中的每一对中每个rna探针的3’羟基末端，并且能通过rna连接酶来催化。rna连接酶能包括t4rna连接酶或circligaserna连接酶的至少一种。根据一些其他实施方案，能通过在这里跳过描述的本领域已知的技术，以rna加合物(或化学加成物)的形式，在rna探针的链内片段中标记固定部分。这样，在上述子步骤s110-s140(图2a所示)或子步骤s110-s150’(图2b所示)之后，生成至少两个rna探针库，每个包括至少一个经固定部分标记的rna探针。至少两个rna探针库一起基本上包括至少一对rna探针组，每对包括分别靶向至少一个靶核酸序列中一个成对物段的两条反向平行链的第一标记rna探针组和第二标记rna探针组。在步骤s100中制备了至少一对rna探针组之后，能在使用至少一对rna探针组作为诱饵捕获和富集至少一个靶核酸序列之前，将至少一对rna探针组与靶核酸序列接触以进行杂交。s200：使至少一对rna探针组中的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组与至少一个靶核酸序列接触，以使得至少一对rna中的每个rna探针与每个靶核酸序列的对应链能够杂交。取决于对应于一对rna探针组的第一rna探针组和第二rna探针组是否彼此干扰(诸如具有互补序列)，从而当混合在一起时能够形成不需要的双链体结构，能以不同的方式进行s200。根据一些实施方案，与一对rna探针组对应的第一rna探针组和第二rna探针组不具有基本上互补的序列(诸如在一个上述实施方案中，对应于一对rna探针组的第一rna探针组和第二rna探针组靶向靶核酸序列的成对物段的两个不同部分)，或与不容易彼此相互干扰的偶联固体载体(诸如在上述一个实施方案中，将对应于一对rna探针组的第一rna探针组和第二rna探针组偶联至微流控芯片上微流控通道的不同区域)，步骤s200能包括：s200a：在单次杂交反应中，使第一rna探针组和第二rna探针组均与至少一个靶核酸序列接触。根据一些其他实施方案，每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组具有基本互补的序列，并因此能在与靶核酸序列的单次杂交反应中彼此干扰，这样，能采用这种方法的不同实施方案。根据一些实施方案，每对中的第一rna探针组和第二rna探针组能被配置为以顺序的方式与至少一个靶核酸序列杂交。在此，“顺序的方式”是指使每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组能够一个接一个地与生物体中的至少一个靶核酸序列接触并由此杂交的方式。对特定顺序没有限制：例如，首先将第一rna探针组添加到杂交反应中，然后再添加第二rna探针组，或者将第二rna探针组首先添加到杂交反应中，然后再添加第一rna探针组。具体地，根据一些实施方案，其中将每对rna探针组中的第一rna探针组和第二rna探针组标记在磁珠上，步骤s200包括如图5a所示的以下子步骤：s210：在第一杂交反应中，使至少一对rna探针组中的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组中的一组与至少一个靶核酸序列接触；以及s220：在第二杂交反应中，使至少一对rna探针组中的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组中的另一组与至少一个靶核酸序列接触。或者，在两个分别的杂交反应中，每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组能被配置为与至少一个靶核酸序列杂交，其然后能在另一个杂交反应中结合。对于顺序方法而言，这基本上是一种特殊情况，并且具体地，如图5b所示，步骤s200包括以下子步骤：s210’：分别在第三杂交反应和第四杂交反应中，使至少一对rna探针组中的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组与至少一个靶核酸序列接触；以及s220’：将第三杂交反应和第四杂交反应结合以使杂交在第五杂交反应中能够进行。在本文中应注意，“第一”、“第二”、“第三”、“第四”和“第五”旨在指代不同的杂交反应，并且不指示或不暗示反应中的实际顺序。进一步注意，任何上述杂交反应(即，第一、第二、第三、第四或第五杂交反应)能在基本上使得每个rna探针与每个靶核酸序列的对应链能够有效杂交的温度下发生。例如，在一些实施方案中，每个rna探针的长度为～100-150nt，并且杂交反应的温度可以在～40-90℃的范围内，优选在～62-70℃的范围内，并且更优选在～67.5℃。这样的杂交温度能够使得高效率和平衡的特异性地捕获和富集靶核酸序列(见下文)。然而，注意，这些实施方案仅用作说明性示例，并且不限制本发明的范围。取决于特定需要，也可以应用其他杂交条件，例如不同长度、不同丰度、杂交温度的rna探针等。此外，取决于不同的配置，每个杂交反应的孵育时间能变化。根据一些实施方案，其中杂交反应发生在携带生物素部分的rna探针与样品中的靶核酸序列之间，孵育时间能是6-24小时，并且优选12小时，以确保每种rna探针与其对应的靶核酸的有效杂交。根据一些其他的实施方案，其中在偶联到内表面微流体通道上的rna探针与样品中的靶核酸序列之间发生杂交反应，孵育时间可以是几秒到几小时，这取决于反应的温度和压力。这里没有限制。通过如上述实施方案，在杂交反应中在每对中依次添加两个rna探针组(即，第一rna探针组和第二rna探针组)，则如果同时添加时它们之间探针-探针杂交的不希望形成能有效减少。另外，已经证明如上所述的顺序方法在捕获靶核酸序列方面更有效。如下文所述的实验所证明的，与使用一条靶向靶dna序列的rna探针的方法相比，使用靶向相同靶dna序列的两条链的一对互补rna探针捕获目标dna序列能使捕获效率提高3倍以上，如将在下面详细描述的图8a所示。请注意，在如图5a和5b中所示的上述两种方法中，每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组一旦被使得能够与包含至少一个靶核酸序列的生物样品接触，则没有从反应中去除。其它实施方案也是可能的。例如，在每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组中的每一组已经与包含至少一个靶核酸序列的生物样品接触之后，第一rna探针组和第二rna探针组中的每一组能够与生物样品分离，从而使得第一rna探针组和第二rna探针组每一组中的rna探针能够捕获至少一个靶核酸序列的一部分，并且能使生物样品与每一对中的第一个rna探针组和第二个rna探针组中的每一组能够接触。注意，这些实施方案实际上使得包含至少一个靶核酸序列的生物样品能够与对应的每对rna探针组中的第一rna探针组和第二rna探针组重复接触。这样，由生物样品捕获至少一个靶核酸序列可以在多轮顺序接触之后具有相对较高的效率。这样，步骤s200能包括：s211：使至少一个靶核酸序列与至少一对rna探针对的每一对中的第一rna探针组和第二rna探针组中的一组和另一组依次接触；以及可选s212：重复s211至少更多一次。在一个具体的实施方案中，每个对应对中的第一rna探针组和第二rna探针组分别标记在磁珠上，并且这样，步骤s200具体包括：s211a：使第一rna探针组和第二rna探针组中的一组与包含至少一个靶核酸序列的生物样品接触；s211b：由生物样品去除第一rna探针组和第二rna探针组中的一组。s211c：使第一rna探针组和第二rna探针组中的另一组与生物样品接触；以及s211d：由生物样品去除第一rna探针组和第二rna探针组中的另一组。这些子步骤s211a-s211d能仅执行一次，或者可选地能重复至少一次以上(即，s212)。在另一个具体的实施方案中，每个对应对中的第一rna探针组和第二rna探针组分别偶联到固体载体(例如基质或表面)上，其分别布置在设备的两个不同区域，诸如微流控芯片的柱或微流控通道。在图1d所示的一个实例中，能将与第一rna探针组偶联的基质和与第二rna探针组偶联的基质布置在柱的两个不同层(10a和10b)上。在图1e或1f中所示的另一个实例中，每个对应对中的第一rna探针组和第二rna探针组可以沿着流动方向分别固定在微流体通道或芯片的两个不同区域上。设备(即柱或微流体通道)能进一步被配置成使得生物样品能够顺序地流过该设备的两个不同区域，从而使得包含至少一个靶核酸序列的生物样品能够与每对中的第一rna探针组和第二rna探针组顺序地接触,其进一步支持重复接触/分离，从而提高捕获效率。这样，步骤s200能包括：s211a’：使包含至少一个靶核酸序列的生物样品能够顺序地流过设备的两个不同区域，从而使得其能够与第一rna探针组和第二rna探针中的一组和另一组依次接触；以及可选s212’：重复s211a’至少更多一次。注意，在具有使用柱或微流体通道的s211a’和s212’的实施方案中，有可能通过沿流动方向在柱或微流体通道上串联布置多于一对的第一rna探针组和第二rna探针组(如图1f所示)，通过布置样品以再循环(即如图1g所示，通过将样品布置为在流出后再次流入柱子和微流体通道一个回合以上)，或者也可以通过以上两种方法的组合来实现重复步骤(即，s212’)。根据本发明的一些实施方案，生物样品中的一个或更多个靶核酸序列能各自存在于多核苷酸中，该多核苷酸还包含至少一个不希望被捕获的序列(此后称为“非靶序列”)。例如，在如图6a所示的一个具体实施方案中，至少一个靶核酸序列在dna文库中，并且每个靶核酸序列的侧翼为一对衔接子序列(诸如长度为～70bp的pe测序衔接子)，其基本上是非靶序列。至少一个非靶序列(例如一个或两个衔接子序列)的存在可能潜在地干扰rna探针对至少一个靶核酸序列的富集或捕获。这样，为了有效消除至少一个非靶序列的干扰，根据本发明的一些实施方案，在步骤s200之前，该方法进一步包括：s199：使至少一个封闭寡核苷酸与所述至少一个靶核酸序列接触，使得所述至少一个封闭寡核苷酸分别与所述至少一个非靶序列的每一个的至少一条链杂交，从而封闭。在一个实例中，每个靶核酸序列是侧翼为一对衔接子序列(即如图6a所示的第一衔接子序列600a和第二衔接子序列600b)的双链dna序列。这样，能在子步骤s201中利用封闭寡核苷酸组(其包括特异性靶向第一衔接子序列600a的一条链的第一封闭寡核苷酸和特异性靶向第二衔接子序列600b的一条链的第二封闭寡核苷酸)，以促进对应的rna探针与每个靶核酸序列杂交，而不受非靶序列(即侧翼衔接子序列)的干扰。本文中，应注意封闭寡核苷酸组能有多种布置。例如，封闭寡核苷酸组能由两个封闭寡核苷酸组成，并且能具有(611和621)、(611和622)、(612和621)或(612和622)的一对封闭寡核苷酸，只要如图6a所示，两个封闭寡核苷酸分别靶向两个衔接子序列600a和600b。或者，封闭寡核苷酸组能由三个封闭寡核苷酸组成，具有(611、612和621)、(611、612和622)、(611、621和621)或(612、621和622)的组合。或者，封闭寡核苷酸组能由四个封闭寡核苷酸(611、612、621和622)组成，其基本上形成两对封闭寡核苷酸611/612和621/622，如图6a所示每对分别对应于第一衔接子序列600a的两条链和第二衔接子序列600b的两条链。注意，为了避免在靶向两个衔接子序列(600a或600b)的任何一个中的两个互补链的两个封闭寡核苷酸之间不必要的退火、杂交或结合，能以顺序的方式添加两个寡核苷酸进行杂交和封闭，或者以分离和组合的方式添加两个寡核苷酸，就像如图5a或5b所示在至少一对rna探针组的每一对中分别添加第一rna探针组和第二rna探针组一样。至少一个封闭寡核苷酸的多个实施方案是可能的。例如，在s199中使用的至少一个封闭寡核苷酸中的每一个能是长度至少为2nt的单链dna寡核苷酸或单链rna寡核苷酸，并且可以由本领域技术人员基于已知的常规技术获得。根据一些实施方案，所述至少一个封闭寡核苷酸可以包括一个或更多个封闭寡核苷酸组，其被配置为使得每个封闭寡核苷酸组包括一个或更多个寡核苷酸，所述寡核苷酸特异性地靶向靶核酸序列中的非靶序列的至少一个的每一个的两条反向平行链之一。在至少一个封闭寡核苷酸的一个示例性实例中，其能被配置为使得两个封闭寡核苷酸(或两个封闭寡核苷酸组)分别靶向靶核酸序列中一个或两个衔接子序列的每一个的成对物段的两个不同部分(即第一链中的第一部分和第二链中的第二部分，其中第一链和第二链是靶核酸序列中一个或两个衔接子序列中的每一个的成对物段中的两个反向平行链，并且第一部分和第二部分是靶核酸序列的成对物段的两个不同部分)。这种布置使得在封闭反应中能够同时添加至少一个封闭寡核苷酸而没有时间上的分离，并带来了便利。在另一个实例中，两个封闭寡核苷酸(或两个封闭寡核苷酸组)分别靶向靶核酸序列中一个或两个衔接子序列的每一个的成对物段的同一部分，并因此，两个封闭寡核苷酸(或寡核苷酸组)，需要使得以顺序方式或分开然后组合的方式与生物样品中的至少一个靶序列能够接触。图6a示出了作为示例性实例的一个具体实施方案。为了使封闭寡核苷酸组分别与两个衔接子序列对的每一个中的对应链杂交并从而封闭，封闭杂交反应能在与上述杂交反应基本相同的温度下发生，上述杂交反应分别需要使第一rna探针组500a和第二rna探针组500b与每个靶核酸序列的每个对应链杂交。这样，根据一些实施方案，封闭杂交反应可以在～40-90℃的范围内，优选为～62-70℃，并且更优选为～67.5℃。这样，通过应用对应的封闭寡核苷酸组611、612、621和/或622来封闭第一衔接子序列600a的两条链中的每条链和第二衔接子序列600b的两条链中的每条链，衔接子序列在样品中dna文库中的至少一个靶核酸序列侧翼(如图6a所示)，能使第一衔接子序列600a和第二衔接子序列600b的每条链的潜在干扰最小。根据一些其他实施方案，每个双链靶核酸序列旁边仅一个衔接子序列，因此，能使用一个封闭寡核苷酸(其靶向衔接子序列的两条链之一)或两个封闭寡核苷酸的组(分别靶向衔接子序列的两条链)。根据又一些其他实施方案，每个靶核酸序列在生物样品中是单链的，并且侧翼有两个衔接子序列，并这样，能使用分别靶向两个衔接子序列的两个封闭寡核苷酸的组。取决于实际情况，有其它的可能性以及具体设计。这里没有限制。注意，如上所述的一个或更多个衔接子序列仅用作说明含有靶核酸序列的多核苷酸序列中的至少一个非靶序列的实例，并且不限制本发明的范围。s300：将至少一个靶核酸序列固定在固体载体上。本文中，如上所述，步骤s300能通过已经在至少一个rna探针的每一个上标记的至少一个功能部分中的固定部分来执行。具体地，能通过每个rna探针中的固定部分与固定在固体载体表面上的偶联伴侣之间的稳定结合(即非共价结合)来进行s300。在一些固定部分是生物素部分的具体实施方案中，偶联伴侣能是链霉亲和素、亲和素或抗生物素抗体，其附着于或偶联于诸如磁珠的固体载体上。固定部分-偶联伴侣对的其他实例可以包括但不限于碳水化合物-凝集素对、抗原-抗体对和带负电基团-带正电基团的静态相互作用对。或者，能通过固定部分与附着在固体载体表面上的偶联伴侣之间的交联(即共价连接)来进行s300。在一些具体的实施方案中，固定部分能是第一偶联伴侣，其可以与第二偶联伴侣形成交联，从而使得将捕获的序列能够进一步固定。这样，第一偶联伴侣和第二偶联伴侣分别选自nhs酯-伯胺对、巯基反应性化学基团对(例如半胱氨酸或其他巯基(诸如马来酰亚胺、卤代乙酰基和吡啶基二硫化物))、氧化的糖-酰肼对，可光活化的硝基苯基叠氮化物的uv引发带有双键的加成反应，引起ch和nh位点的插入或随后的扩环以与亲核试剂(例如伯胺)或碳二亚胺活化的羧基反应成氨基(伯胺)等中的一种交联对的一个和另一个。这里没有限制。通过该方法的该步骤，通过经标记的rna探针由生物样品分离、富集或捕获靶核酸分子。能使用的固体载体可以是对于特定目的和情况方便的任何固体载体。s400：将至少一个靶核酸序列从固体载体上洗脱。在步骤s300中通过至少一个固定部分标记的rna探针将至少一个靶核酸序列固定到固体载体上之后，富集或捕获多个经固定的靶核酸序列，然后可以在步骤s400中从固体载体洗脱以促进后续处理和分析，诸如pcr扩增、测序测定(诸如下一代测序和其他测序测定)、基于pcr的检测、微阵列测定、将基因片段构建为克隆、转染和转导，以及所有其它基于核酸的应用。这里没有限制。根据该方法的一些实施方案，步骤s400能在洗脱过程后包括洗涤过程。在洗涤过程中，可以洗涤由固体载体提取的杂交分子以去除非特异性核酸结合剂，包括由于非特异性相互作用而与探针结合或与固体载体结合或与任何其他部分结合的核酸。具体地，洗涤过程能通过具有0.1％sds的盐水柠檬酸钠(ssc)缓冲液进行。在洗脱过程中，能通过热诱导链解离或通过核酸变性试剂(诸如0.1m氢氧化钠)洗脱与rna探针杂交的核酸序列。通过洗脱将探针与靶核酸分子分离后，可以使用中和缓冲液(诸如tris-hclph7.5)处理洗脱反应中的靶核酸分子部分，以进一步中和由最初使用的变性缓冲液引发的效应。根据该方法的一些实施方案，不是在通过步骤s100产生的rna探针与至少一个靶核酸序列(即步骤s200)杂交之后将至少一个靶核酸序列固定在固体载体上(即步骤s300)，首先可以将步骤s100生成的rna探针固定在固体载体上(并因此成为固体载体固定的rna探针或偶联固体载体的rna探针)，然后使其能与靶核酸序列接触而捕获。这样，该方法能包括如图1b所示的以下步骤：s100’：制备至少一对rna探针组，每对rna探针组包括第一rna探针组和第二rna探针组，其被配置为分别靶向至少一个靶核酸序列的每一个中的成对物段的两条反向平行链，其中，第一rna探针组和第二rna探针组的任一组中的每个rna探针用固定部分标记。s200’：将一对rna探针组的每一组偶联到固体载体上；s300’：使偶联固体载体的第一rna探针组和偶联固体载体的第二rna探针组中的一组和另一组与至少一个靶核酸序列接触，以使得至少一对rna探针组中的每个rna探针能够与每个靶核酸序列的对应链杂交；以及s400’：将至少一个靶核酸序列从固体载体上洗脱。本文中，如上所述的方法的实施方案中的步骤s100’和s400’与图1a所示的方法的前述实施方案中的步骤s100和s400基本相同。固体载体可以是磁珠、非磁珠、树脂基质、过滤器、膜，或上面已经提到的不同类型。具体地，以与上述实施方案类似的方式，其中仅在rna探针与靶核酸序列杂交后将rna探针固定在固体载体上，能使一对固体载体固定的rna探针组(即，偶联固体载体的第一rna探针组和偶联固体载体的第二rna探针组)顺序地与至少一个靶核酸接触(即一个接一个)，或者在两个杂交反应中与至少一个靶核酸分开接触，并然后将两个杂交反应结合起来。这样，根据基本上是顺序方式的第一实施方案，s300’包括：s310：在第六杂交反应中，使偶联固体载体的第一rna探针组和偶联固体载体的第二rna探针组的一组与至少一个靶核酸序列接触；以及s320：在第七杂交反应中，使偶联固体载体的第一rna探针组中和偶联固体载体的第二rna探针组的另一组与至少一个靶核酸序列接触。根据第二实施方案，s300’包括：s310’：在第八杂交反应和第九杂交反应中，使每对偶联固体载体的rna探针组中的偶联固体载体的第一rna探针组和偶联固体载体的第二rna探针组单独地与至少一个靶核酸序列接触；以及s320’：将第八杂交反应和第九杂交反应结合，从而使得第十杂交反应能够进行。注意，取决于固体载体的特定性质，偶联在固体载体上的一对rna探针组可能在具有互补序列的rna探针之间具有很少或可接受的相互作用水平。这样，根据第三实施方案，能使得在每个对应对中的偶联固体载体的第一rna探针组和偶联固体载体的第二rna探针组在单次杂交反应中能够与至少一个靶核酸接触，而不会暂时分开。例如，如果使用珠子，则可以在单次反应中组合每个对应对中与珠子偶联的第一和第二rna探针组，以同时捕获靶核酸序列的成对物段的不同链。或者，玻璃表面能用于将每个对应对中的第一和第二rna探针组偶联在其上，并且能使得在单次反应中能够同时捕获靶核酸序列的成对物段的不同链。进一步应注意，根据第四实施方案，每个对应对中的第一rna探针组和第二rna探针组可以偶联在固体载体的不同区域，诸如在微流控芯片上的微流体通道的不同部分，其使得包含至少一个靶核酸序列的样品能够顺序流过微流体通道的不同片段，这些片段对应于一对偶联固体载体的rna探针组，从而可以顺序地捕获靶核酸序列的成对物段的两条不同的链。这样的配置使得偶联至固体载体上的rna探针能够重复使用。根据该方法的一些实施方案，不是在制备至少一对rna探针组之后，将至少一对rna探针组中的每一对偶联在固体载体上(即，如在图1b中所示上述方法中的步骤s100'和s200')，而是至少一对rna探针对中的每一对中的rna探针能直接制备在固体载体上。这样，该方法能包括如图1c所示的以下步骤：s100”：直接在固体载体上制备至少一对rna探针组，每对包括第一rna探针组和第二rna探针组，分别配置为分别靶向至少一个靶核酸序列中的每一个的成对物段的两条反向平行链；s200”：使偶联固体载体的第一rna探针组和偶联固体载体的第二rna探针组中的一组和另一组与至少一个靶核酸序列接触，以使得至少一对rna探针组中的每个rna探针能够与每个靶核酸序列的对应链杂交；以及s300”：将至少一个靶核酸序列从固体载体上洗脱。本文中，如上所述的方法的实施方案中的步骤s200”和s300”与图1b所示的方法的前述实施方案中的步骤s300’和s400’基本相同。固体载体可以是磁珠、非磁珠、树脂基质、过滤器、膜，或上面已经提到的不同类型。本文中，步骤s100”能通过直接化学合成或通过在固体载体上直接转录来实现。在固体载体上直接转录的情况下，能将rna聚合酶附着到固体载体上。如上述各种实施方案所示，该方法具有以下有利特征：第一，分别靶向每个靶核酸序列的成对物段的两个反向平行链(即，正链和负链)的一对rna探针都用于富集或捕获每个靶核酸的两条链，与仅有一条仅靶向每个靶核酸序列的两条链中的一条的一组rna探针的常规方法相比，其具有更高的富集效率。第二，如上所述的核酸序列捕获方法能基本上捕获两条反向平行链，它们通常属于每个靶核酸序列的同一分子并具有互补序列，并因此能在对序列准确性的要求较高的某些应用(诸如单核苷酸变体(snv)调用)中带来额外的优势。在检测样品中的snv的示例性应用中，仅在靶dna序列(分别被分别靶向两条互补链的两条对应的rna探针对捕获)的两条互补链的两条上观察到的snv是真正的snv，而仅在目标dna序列的两条互补链中的一条而非两条上都观察到的snv可能代表pcr引入的假阳性信号。这样，本文公开的核酸序列捕获方法使得能够用于防错应用。第三，可以通过转录制备每个rna探针，这使得能够以成本有效且方便的方式获得大量rna探针。由于探针/靶标比例高得多，这使得靶标核酸序列能够以明显更高的效率富集/捕获。另外，这进一步使得能够对每个rna探针进行定量，从而使得对每个rna探针进行方便的调整，以提高捕获某些难以捕获的特定靶核酸序列的效率，例如，通过使用高10倍的用于捕获的rna探针数量。第四，上述有利特征一起能具有额外的优点，使得第一rna探针与每个靶核酸序列的对应链的杂交能帮助暴露每个靶核酸序列的另一互补链，从而能在动力学上有利于随后另一个rna探针与每个靶核酸序列的互补链的杂交，从而良好捕获在生物样品中每个靶核酸序列的两条链中的每一条。由于上述优点，预计本文公开的方法具有以下各种应用：第一，其使得能够捕获和分析序列变体和/或拷贝数变体，包括但不限于点突变、缺失、扩增、杂合性丧失、重排，和/或重复。这些遗传变体可能与人类疾病、特定表型等相关。分析包括测序、杂交测定、连接测定等。由于方法的超灵敏性，本文公开的方法使得能够捕获和分析稀有变体，尤其是超稀有变体/突变，和拷贝数变体，并且能用于捕获和富集来自线粒体、叶绿体、质体、细菌或病毒病原体、环境dna(edna)等的核酸，并且也能用于捕获和富集用于群体遗传学研究、snp分型和深层系统发育、rad(限制性位点相关dna测序)或gbs(测序基因分型)基因座富集的核酸。本文中没有限制。第二，其使得能够富集并分子克隆混入dna样品中的特定靶核酸序列，诸如古老的dna和来自博物馆标本中的核酸材料，这些材料在自然环境中保存了多年通常dna质量较差，并且通常会有其他生物(尤其是微生物)的严重污染，或者由于样品处理不当而污染了现代人类dna。第三，该方法能广泛应用于捕获测试样品中的各种核酸序列，其能包括由正链和负链组成的双链核酸序列(如图6b左图所示)，也能包括具有成对物段的单链核酸序列，该序列基本上形成环或发卡(如右图6b右图所示)，并且该核酸序列能包括dna、rna或dna-rna杂合分子。注意，即使在任何靶核酸序列不形成双链体结构的情况下(即，靶核酸序列仅具有单链片段)，诸如通过逆转录合成cdna但mrna模板由于rnase诱导的消化而降解的情况，只要第一rna探针组或第二rna探针组中的任一组都能靶向靶核酸序列的单链片段，上述方法仍能用于捕获靶核酸序列。第四，本文公开的方法，如果与专利申请pct/us2018/016778中公开的用于构建条形码化核酸文库的方法和试剂盒结合使用(即如果通过本文公开的试剂盒和方法用于在条形码化dna文库中富集和捕获靶核酸序列)能进行超灵敏的防错分析，以检测和表征生物样品中的靶核酸序列。在下文中，提供了几个说明性实例以说明本文公开的方法的几种应用。图7a和7b示出了根据本发明的一些实施方式的核酸序列富集方法的图。如图7a和7b所示，ngsdna库中的双链dna分子被解离，所有分子之间共享的衔接子、索引和通用引物序列通过封闭寡核苷酸杂交，靶dna序列进一步被rna探针捕获，rna探针与由反向平行双链组成的dna分子互补。至少一个互补的rna探针分别捕获来自同一dna分子的+链和-链。将经捕获的dna序列固定在固体载体(即链霉亲和素磁珠)上后，从原始文库中提取靶序列，并在一系列洗涤和洗脱步骤后能将被捕获的靶dna分子从探针上洗脱下来。扩增后，该文库可用于直接ngs测序或其他测定。可以使用任何测试序列变体或序列拷贝数变体的方法，包括但不限于点突变、缺失、扩增、杂合性丧失、重排、重复。可以通过测序，通过杂交测定，通过连接测定等来检测序列变体。某些突变的确定位置允许聚焦测定仅限于外显子、结构域或密码子。但是，在突变位置未知的情况下，也可以使用非靶向测定。如果定义了相关序列变体的位置，则可以使用专注于所鉴定位置的特异性测定。对测试样品执行的任何测定都涉及转化，例如化学或物理变化或作用。分析和确定不仅仅通过人体的感知或认知过程来进行。用于rna探针合成的探针和/或引物和/或模板可以包含野生型或序列变体，包括但不限于点突变、缺失侧翼序列、重排位置。这些能用于各种不同的测定中，这对于特定情况将是方便的。测定的选择可以基于成本、设施、设备、电力供应、速度、可重复性、与其他测定的兼容性、样品收集的侵入性、样品制备等。可以记录或传达任何检测结果，作为积极的举动或步骤。测定结果、诊断、鉴定或预后的通信可以是例如，在两个人之间的口头形式，在纸上或数字媒体上的书面形式，录音形式，传达给医疗图表或记录，以传达给第二位医疗专业人员或患者。结果和/或结论和/或基于结果的建议可以是自然语言，也可以是机器或其他代码。通常，此类记录以机密方式保存，以保护患者或项目的私人信息。可以将rna探针、引物、对照样品和试剂的集合组装到用于该方法的试剂盒中。试剂可以与说明一起包装，或与从中获得说明的地址或电话号码的说明一起包装。试剂盒中可包含电子存储介质，无论是用于指导目的还是用于结果记录，或用作控制测定和数据收集的手段。可以从同一患者身上明显没有疾病的组织获得对照样品。或者，可以从健康个体或明显健康个体的群体中获得对照样品。对照样品可以与测试样品来自相同类型的组织或不同类型的组织。可以将对照样品与rna探针、引物和试剂一起提供在用于该方法的试剂盒中，其中对照样品可以是标准参考样品，目的是验证试剂盒的性能和由用户执行的操作。下文描述的数据记录了使用靶向靶dna分子两条链的rna探针从全外显子组测序研究中鉴定超稀有突变的结果。毫无疑问，只有在测序系统的错误率显著低于所鉴定的snv的频率时，才能可靠地检测snv。因此，ngs管道的流水线错误率对其检测超稀有snv的性能至关重要。结合基于rna探针的两条dna链捕获和单链文库构建，创建了一种改进的ngs方法，其基线错误率为2.25x10-10。这样的高精度流水线取决于通过靶向两个dna链的rna探针捕获的大量dna文库靶分子。图8a-8d显示从顺序稀释的样品中重新检测到减少量的变体。从1:10000稀释组没有重新检测到变体。重测序的覆盖范围约为5000x。对于任何靶序列，通过成对的rna探针对捕获的效率显著高于通过单组rna探针捕获的效率。图15a、15b、15c、15d和15e显示了通过基于rna探针的dna双链捕获ngs检测到的序列变体，显示了通过sanger测序的验证结果和通过超突变等位基因分数对超稀有突变重新检测结果进行排序。然后，通过重新检测从正常dna创建的文库中的38个经过sanger测序验证的序列变异体的成功率，评估了该方法对被dna分子的两条链靶向的rna探针捕获的靶分子的超稀有突变检测性能，样品中添加了连续稀释的肿瘤dna。该文库是通过基于条形码化的单链分子的方法构建的，而人类基因组全外显子区域的靶点富集是通过基于rna探针的dna双链捕获来进行的。如预期的那样，随着稀释倍数的增加，检测到的变体越来越少(图12)，并且当将肿瘤dna样品稀释1000倍(稀释的样品含有0.1ng肿瘤dna和100ng正常dna)时，38个经过验证的变体只有21个变体可以被检测到(图15a-e)。在1：1000稀释的样品中的这21个snv的等位基因分数范围为0.03％至0.005％，平均为0.013％(图15a-e)。在1:10000的稀释样品中未检测到任何序列变异，这可能是由于所获得的测序深度有限所致。对于每个样品，靶向测序的平均深度为5000x，从理论上讲，这只能使我们能够看到snv降至频率为1/5000(0.02％)。为了以更低的频率观察超稀有的snv，需要大于5000x的覆盖范围。设计仅靶向少数基因的捕获探针也很有帮助。通过针对较小靶基因组的两条链的rna探针捕获的少量不同核酸序列(而不是全人类基因组外显子组)，可以富集更多拷贝的靶核酸，并且该方法可以实现具有改善的超稀有snv调用的准确性的测序更大的深度。该方法的基线错误率极低，使得在全外显子组水平上高精度地能够进行超稀有snv调用，而ngs测序的深度成为此类应用的唯一限制因素。据报道，基于rna探针的dna双链捕获方法是一种改进的方法，可用于ngs目的富集dna分子，特别是靶向ngs。人类基因组wes研究已经证明了这种改进的性能。除wes之外，基于rna探针的dna双链捕获的另一个非常重要的应用将是基因组的靶向重测序。靶向重测序是最流行的ngs应用之一，并且其使人们能够将一小群基因靶序列测序到极高的深度，通常覆盖范围是数千倍。并且这种测序深度可以以极大的灵敏度促进超稀有突变的检测。在基于rna探针的dna双链捕获流水线中，尝试捕获所有人类基因的全外显子组，其中在标准ngs平台上实现了98％的覆盖率和200倍以上的深度更重要的是，该方法在全外显子组范围内的稀有突变检测的检测限低至0.03％，通过靶向两条dna链的rna探针大大提高了目标分子的捕获效率，使得其成为可能。对于更小群的靶基因，基于rna探针的dna双链捕获ngs的深度和覆盖范围可以进一步增加，并且超稀有突变检测的性能可以随后提高几个数量级。除了以高灵敏度和准确性鉴定超稀有snv外，基于rna双链捕获方法也可以用于基因拷贝数变体(cnv)分析。条形码化单链文库构建将唯一的条形码链接到每个单链dna分子。这样的条形码信息不仅可以用于标记分子并创建超级读数以减少pcr错误，还可以用作dna片段的位置标记。将基于rna探针的dna双链捕获、ngs测序，以及超级读数匹配回人类基因组后，可以将每个超级读数上的条形码分配给匹配超级读数序列的位置。因此，可以通过唯一的条形码重建人类基因组。拷贝数信息可以通过亚基因组位点上条形码的多样性来表示。基于rna探针的dna双链捕获所提供的所有基因组区域均具有同等效率的高效捕获反应，是成功调用cnv的关键。除cnv分析外，还能通过基于rna探针的dna双链富集分析在癌症基因组中经常观察到的大型结构变体。并且可以将靶向捕获探针设计为特异性富集流行基因组断裂点侧翼的亚基因组区域。可以基于rna探针的dna双链捕获的高效率，构建用于转运和大的插入缺失识别的高度敏感的流水线。除了在基础研究中的应用外，基于rna探针的dna双链捕获在临床ngs领域具有巨大潜力。已经证明了该方法可以用很少的dna物质(≤20pg)高效构建ngsdna库。同时可以高置信度检测超稀有突变。这样的功能对于基于ngs的临床诊断至关重要，在这些诊断中样品通常有限且高度异质。一个典型的实例是ffpe样品的ngs测序。数十年来，ffpe一直是标准的样品制备方法。历史存档的ffpe样品对于生物医学研究中的回顾性研究是非常有价值的资源。然而，由于样品制备过程中的化学修饰以及长期保存后对组织块或载玻片的长期损坏，对ffpe样品进行ngs研究一直是一项艰巨的任务。dna质量差和人为改变序列是基于ffpe的ngs研究的两个主要问题。基于rna探针的dna双链捕获为基于ffpe的wes研究提供了巨大的益处。据报道，在较低的覆盖水平(约20倍)下，ffs与新鲜冷冻样品之间的wes数据不一致，但是，当覆盖范围更高时，这种差异可以减小(kerick，isauetal.2011)。并且最近，allen等人报道了ffpe和新鲜冷冻组织样品之间的体细胞突变，在充分测序的位置中相互重叠90％(vanallen,wagleetal.2014)。在allen的研究中，如数据所示，采用了基于rna探针的dna单链捕获方法，该方法的捕获效率远低于基于rna探针的dna双链捕获方法。通过这种方法提高捕获效率，使用ffpe样品进行wes研究将提供与使用新鲜冷冻组织进行wes研究相当的数据质量。该方法在生物医学和临床应用中具有发现新型的引起低频疾病的变体的巨大潜力，并且可以为患者确定更具活性的治疗靶标。该方法可通过揭示迄今为止最完整的患者基因组概况(包括高频、低频和特别是超低频突变)来实现前所未有的个性化精准医学水平。该方法还可以用于其他临床应用中，例如从体液样品中进行循环dna测序，此时只能使用有限量的dna材料。在临床ngs应用中，从数量非常有限的高度异质样品中(因此其侵入性低或无侵入性)构建的ngs文库中高效率捕获靶dna分子至关重要；高效富集靶标序列，从而以有限的成本和更高的诊断灵敏度达到了很高的测序深度；并尽可能完全消除人为测序错误，以实现最佳诊断特异性。事实证明，使用两组rna探针以同时捕获dna反向平行分子的两条链的方法可以满足众多ngs应用中的巨大潜力。实施例1材料和方法肿瘤和正常组织样品在天津医科大学的机构审查委员会(irb)批准后，根据中国天津医科大学肿瘤研究所和医院的指导方针和法规，从亚洲种族的胰腺癌患者中获得了配对的肿瘤和正常组织样品，并完全符合hipaa准则。该患者已获得进行此项研究的知情同意。肿瘤组织样品的估计肿瘤含量为43.4％。文库制备：使用dneasyblood&tissuekit(qiagen)提取患者正常和肿瘤新鲜冷冻组织的基因组dna，并使用diagenode'sbioruptor以使用0.65ml微管进行30秒开启/关闭90秒的7个循环程序将其剪切成150bp的片段。条形码化单链文库的制备始于dna双链体的完全解离以形成单链dna，并使用唯一的数字条形码分别标记每条dna单链的3’末端。条形码化单链衔接子已经在国际申请pct/us2018/016778中被公开，其全部内容并入本文。将预去磷酸化的片段化dna样品与条形码化的第一衔接子(最终浓度0.15um)、20％peg-8000、100ucircligaseii混合，并在60℃孵育1小时。将连接产物固定至链霉亲和素偶联的dynabeads(thermofisherscientific)上后，每个条形码化的单链dna分子都要经过单独的单循环pcr反应，形成互补链。使与单链衔接子互补的dna引物退火，并使用bst3.0聚合酶在50℃下延伸30分钟。在25℃下使用t4dna聚合酶进行平末端修复15分钟。然后使用t4dna连接酶在16℃下孵育1小时将双链衔接子连接至dna双链体的5’末端。通过在95℃下孵育1分钟从珠子上洗脱文库。进行高保真pcr扩增以扩增dna序列以及唯一的条形码。衔接子序列设计为与illumina测序平台兼容。rna探针合成为了获得与靶标亚基因组区域(特别是外显子组区域)的两条链互补的rna探针，基于hg19参考人类基因组序列，通过序列合成和分子克隆，克隆了每个人类基因的全外显子组序列。简而言之，将含有-50bp和+50bp内含子序列的32524个ccdsid中的外显子序列克隆到pcdna6.2载体中。对于超大型人类基因，例如dmd、ptprd、cntnap2等，它们的相关靶序列被分离并亚克隆到多个载体中。用于产生rna探针的总dna序列覆盖72.6mb基因组区域，其中包括-50bp和+50bp侧翼内含子序列的所有外显子组，以及每个基因的5’和3’utr。构建每个靶序列的两个克隆，其中在“+”克隆的正链的5’末端和“-”克隆的负链的5’末端插入一个t7启动子(图4b和图7a和7b)。按照将相同dna序列的两个克隆分成两个系统的规则，针对任何给定数目的基因建立两个克隆库，通过体外转录，其中一个系统(图4b和图7a和7b，左图，“+”克隆)产生了靶向dna靶正链的rna探针，以及另一个系统(图4b和图7a和7b，右图，“-”克隆)产生了靶向dna靶负链的rna探针。在每个转录系统中以1mm、1mm、1mm、0.7mm和0.3mm的浓度添加atp、ctp、gtp、utp和生物素-16/11-utp。将rna产物用covariss220聚焦超声仪(covaris)进一步剪切成100-150nt的片段。经片段化的rna探针可用于基于rna探针的dna双链捕获应用。每个靶dna序列的两个rna探针文库是分别创建的，在进行实际捕获程序之前切勿混合。在这项研究中，针对所有人类基因和与癌症相关的298个基因的组，创建了靶向全外显子组序列的正负链(包括-50bp和+50bp侧翼内含子序列和5’/3’utr)的rna探针。基于rna探针的dna双链捕获基于rna探针的dna双链捕获在文库构建或标准ngs文库构建之后进行以捕获人类基因全外显子组。在基于rna探针的dna双链捕获中，靶区域的两条dna链均由一对互补rna探针捕获，其中每个dna链均由其互补rna探针分别靶向。制备了杂交混合物，该混合物包含500ngdna文库、2μgrna探针(如前所述的1μg来自“+”克隆转录物和1μg来自“-”克隆转录物)，包括-50bp和+50bp侧翼内含子序列的靶向hg19人类外显子，以及5’和3’utr)、7μl人cot-1dna(thermofisherscientific)、3μlherring精子dna溶液(thermofisherscientific)、10μl封闭寡核苷酸(每个1nmol/μl)，其序列如下：封闭寡核苷酸1：5’-aagagcgtcgtgtagggaaagagtgtagatctcggtggtcgccgtatcatt-3’反向dt(seqidno.913，最后一个t用反向dt标记)封闭寡核苷酸2：5’-cctcagcaagagcacacgtctgaactccagtcac-nnnnnnn-atctcgtatgccgtcttctgcttg-3’反向dt(seqidno.914，其中n能是a、t、c和g中的任何一个，最后一个g用反向dt标记)将杂交混合物在95℃加热5分钟，然后保持在67.5℃。加入25μl预热(67.5℃)2.8x杂交缓冲液(14xsspe、14xdenhardt's、14mmedta、0.28％sds)。将混合物缓慢吸移8至10次。将杂交混合物在67.5℃下用加热的盖子孵育24小时。杂交后，通过添加200μl结合缓冲液(1mnacl、10mmtris-hcl，ph7.5和1mmedta)将50μldynalmyone链霉亲和素c1磁珠(thermofisherscientific)洗涤3次，然后重悬于200μl结合缓冲液中。将杂交混合物轻轻地添加到珠溶液中，并随后在室温下在热混合器上以850rpm孵育30分钟。为了洗涤磁珠，在dynal磁选机上从磁珠上去除上清液，并将磁珠重悬于500μl洗涤缓冲液a(1xssc/0.1％sds)中，并在室温下孵育15分钟。然后在65℃孵育10分钟后，将珠子清洗3次，每次用500μl预热的清洗缓冲液b(0.1xssc和0.1％sds)清洗。为了洗脱经捕获的dna，将珠子在室温下重悬于50μl0.1mnaoh中10分钟。磁分离后，将上清液转移至新的1.5ml微量离心管中，并与50μl中和缓冲液(1mtris-hcl，ph7.5)混合。用qiagenminelute柱纯化dna，并在17μl70℃eb缓冲液中洗脱，以获得15μl经捕获的dna文库。使用illuminape引物1和2通过phusion热启动聚合酶(newenglandbiolabs)扩增经捕获的dna文库。使用的pcr程序是：98℃30秒；6～10个循环(取决于捕获量)：98℃10秒，65℃30秒，72℃30秒；以及最后在72℃孵育5分钟。使用genejetpcr纯化试剂盒(thermofisherscientific)纯化pcr产物。实时pcr测定图13a至图13n示出了针对每种实时pcr测定列出的298个癌症相关基因靶标、引物对、扩增子序列、扩增子gc％和扩增效率常数。使用abiprism7500序列检测系统(appliedbiosystems)进行用sybrgreen检测的实时pcr测定。简而言之，反应条件由最终体积为20μl的500ng基因组dna或dna文库产物、0.2μm引物和sybrgreen实时pcr预混液(thermofisherscientific)组成。每个循环由分别在95℃下变性15秒、在58.5℃下退火5秒和在72℃下延伸20秒组成。使用引物3((untergasser,cutcutacheetal.2012)设计基因特异性引物，其序列在图8中提供。在三个独立的实验中一式三份进行反应。通过使用包含扩增子序列的“+”克隆构建体的连续稀释液，建立每个基因的引物对的标准扩增曲线。建立了298个靶标扩增子的扩增效率，并在图8中列出。通过将基因特异性扩增效率(ae)提高到不同样品之间的δct值的幂，可以计算出不同样品之间的基因丰度比。例如，可以通过实时pcr测定通过以下公式计算样品a与样品b中基因丰度的比率(r)：r(a/b)＝aeδct，其中δct＝ct(样品b)–ct(样品a)全外显子组测序图14显示了起始的匹配读数代表包含12nt条形码并被匹配到参考基因组的原始读数。唯一读取家族代表urf的数量。每个urf都有唯一的条形码，并且其序列是通过pcr扩增合并来自同一dna分子的读数序列而获得的。通过请求urf中超过95％的读数的序列均一性来去除pcr错误。超级读数复合体代表两条链来自两个超级读数的dna双链体的数量。全外显子组测序是根据制造商的手册在illuminahiseq2500平台上进行的。计算了从随机选择的500万至5000万次读数中的目标读数总数。修剪和条形码化的超级读数分组后，按照sn19的参照基因组的gatk文档推荐的默认模式，使用gatk(3.6版)调用snv(mckenna,hannaetal.2010)。简而言之，对于每个样品(肿瘤或正常dna)，通过用bwa(版本0.7.10)匹配到参考基因组来对测序结果进行预处理，并用picard(版本2.0.1)标记重复样品。进行碱基重新校准以产生准备用于snv分析的读数。对于单独处理的t/n对读数，进行插入缺失重新排列以生成成对处理的t/n对读数。haplotypecaller用于原始snv调用。通过mutect(版本1)将变体调用的输出直接用于snv检测(cibμlskis,lawrenceetal.2013)。通过“突变和超稀有突变检测”部分中介绍的4步方法过滤突变。phred得分<30.0的低质量变体被放弃。来自带有不同条形码的互补读数的配对snv被鉴定为真实突变，并需要通过sanger测序进一步验证。基于rna探针的dna双链捕获ngs研究的每个数据分析步骤之后的数据产量显示在图14中。图15a-e提供了鉴定的snv和sanger测序验证结果。突变和超稀有突变检测通过基于rna探针的dna双链捕获获得的唯一读数的数量显著增加，使我们能够通过以下4步程序应用严格的过滤器。步骤1)代表原始条形码化单链dna分子的pcr复制的相同条形码的组读数，并将其称为唯一读数家族(urf)；步骤2)通过在读数中请求>95％的序列同一性来组合从步骤1)获得的每个urf中的读数；步骤3)为每个urf提取唯一的dna序列和条形码序列，并将其称为“超级读数”；步骤4)对于步骤3)中鉴定的所有超级读数，找到它们的配对互补超级读数，并仅对来自配对超级读数的具有匹配互补序列的得分序列变体进行评分。为了在样品中容纳受损的dna分子，互补的超级读数的长度可能不相同。为了评估基于rna探针的dna双链捕获在检测低频(超稀有)突变中的性能，将100ng肿瘤dna样品依次稀释10、100、1000和10000倍，并分别掺入相同量(100ng)从上述癌症患者的配对正常组织中提取的基因组dna。这种设计可以模拟癌症发生的早期阶段，并且代表使用ngs进行早期癌症诊断的主要障碍，其是样品中肿瘤特异性突变的等位基因分数非常低。建立用于超稀有突变鉴定的高精度参考外显子组为了高度准确地评估条形码化单链文库和基于rna探针的dna双链捕获流水线的基线突变频率，平行构建了六份标准ngsdna文库，每份均使用100ng正常dna输入。通过请求如果在6个独立数据集中的s≥5个中观察到相同的snv，使用这6个外显子组数据集的副本为该特定患者重建了我们自己的参考外显子组数据库，能将snv认为种系变体，并更新了该参考外显子组序列数据库。对于标准ngs流水线，错误率是1％，在固定位置看到5次完全相同的随机错误的机会是(1/3*1％)5＝4.12x10-13。这个数字意味着，如果使用这种方法对整个人类基因组进行一次测序，则可能只有一个人为错误，因为3x1012人类基因组碱基x(4.12x10-13)＝1.24。但是，仅人类外显子被富集和测序，其仅占人类基因组的1.5％，因此在整个人类外显子组中看到单个人工错误的机会仅为1.86％(＝1.5％x1.24)。对应地建立了患者的经更新的高精度正常外显子组参考数据库。实施例2基于rna探针的dna双链捕获实现了高富集效率通过基于rna探针同时捕获来自同一dna分子的两条链，开发了一种富集靶向亚基因组序列的方法。为了评估捕获效果，针对这项研究中采用的298个基因的组的外显子区域创建了rna探针。在基于rna探针的富集之前和之后，进行实时pcr测定以检测和定量该基因组在ngs文库中的亚基因组区域。捕获后未进行文库的再扩增，以确保从基于rna探针的富集获得的dna分子量代表每个基因的捕获产量。图8a显示对于来自不同量(500ng、20ng、1ng、100pg、20pg和10pg)的输入基因组dna的六个dna文库的每一个，计算了298个癌症相关基因的富集效率。通过实时pcr检测单链捕获或双链捕获前后库中每个基因的丰度，定量六个文库中所有298个基因通过rna探针的的dna单链和双链捕获dna的回收率；图8b表示将由5个gc含量覆盖范围广(27.3％至74.1％)的基因的扩增子区域构成的插入序列克隆到pcdna载体中；图8c显示了质粒的连续稀释液的实时pcr分析。加入1、10、100、1000和10000飞摩尔的质粒作为测定模板。绘制从不同质粒量观察到的每个基因的ct值，并显示趋势线。实时pcr测定未观察到明显的gc依赖性扩增偏差；图8d显示了在琼脂糖凝胶上分析了全基因组文库以及由基于rna的dna单链和双链所捕获的全外显子组文库。再次采用由顺序稀释的dna输入创建的同一组六个文库。这样的结果表明，对于所有六个文库，每个基因的捕获率是一致的(图8a)。这些发现表明，每个基因的基于rna探针的dna双链捕获效率不依赖于初始基因。但是，不同基因的捕获率确实有很大差异(10.4％至49.8％)。进一步的研究表明，不同基因的基于rna探针的捕获率与其扩增子的gc含量存在松散的相关性(图8a)。显示了扩增子gc含量与其基于rna探针的捕获效率之间的非常弱的相关性(平均r2＝0.12)(图8a)。文库的构建、基于rna探针的捕获或实时pcr分析都可能是与gc含量相关的富集偏差的原因。先前的结果表明，gc的含量不会显著影响文库的构建。接下来，研究了实时pcr，以检查其潜在的gc含量偏差。选择了5种基因(pten、palb2、esr1、csf1r和nsd1)，其扩增子序列中具有不同的gc％，分别为27.3％、39.3％、50.5％、62％和74.1％(图13a-13n)。克隆了一个质粒(pcdna6.2载体)，该质粒包含一个dna插入片段，该插入片段由五个基因的100bp侧翼序列隔开的扩增子区域组成(图8b)，并依次稀释以模拟捕获后可变数量的基因片段。将所有5个基因片段克隆到同一质粒中，以确保每个稀释样品中不同基因之间的丰度相等。通过检测一系列稀释的质粒样品中的五个基因中的每个基因，进行实时pcr以检测质粒的拷贝数。如图8c所示，使用这些引物对所有五个基因进行实时pcr扩增均未观察到明显的与gc含量相关的偏差。设计用于实时pcr测定的298对引物，其tm值均落在57℃至61℃的狭窄范围内。tm和具有相似长度(约150bp)的短扩增子序列的这种限制有助于确保所有基因的实时pcr测定的一致性(图13a-13n)。因此，创建与gc含量相关的捕获率偏差的唯一可能步骤应该是基于rna探针的捕获本身。据报道，基于杂交的亚基因组捕获的富集偏差归因于gc含量。进行了整个外显子组捕获ngs研究，以进一步评估gc含量对靶亚基因组区域基于rna探针的捕获效率的影响。重要的是要注意，在这种基于rna探针的捕获中，互补的rna探针用于捕获靶区域的两条dna链，并尝试评估如果仅使用一组rna探针仅捕获一条目标dna链和使用两组rna探针同时捕获目标dna的两条链之间的捕获效率是否存在差异。这两种捕获方法是与两个等份的dna文库(500ng)并行执行的，其中每个文库都是由相同的20ng基因组dna创建的。在琼脂糖凝胶上分析了全基因组文库的捕获的产量，其由靶向dna分子的两条链的rna探针或仅靶向dna靶分子的单条链的rna探针捕获(图8d)。进行了298个基因的组的实时pcr以评估所有基因的rna探针单链捕获和双链捕获的捕获率(图8a)。本文公开的靶核酸序列捕获方法(即基于双链靶向rna探针的捕获方法)的平均捕获率在不同文库中的所有基因中为29.2％，远高于从常规基于单链靶向rna探针的捕获方法观察到的比例(平均约8.5％)。这些结果证明，与通过rna探针单独捕获dna单链相比，通过互补rna探针通过同时与dna双链体分子的两条链杂交来捕获靶dna序列实现了超过3倍的捕获效率提高。实施例3全外显子组测序图10a示出了起始读数、经匹配读数和过滤后保留读数的百分比的柱状图。从三个技术重复获得结果。每柱均显示读数的数量，单位为100万次读数。图10b示出了三次重复中的经过滤的读数的亚组的堆叠柱状图。图10c示出了覆盖效率与读数数量的关系。显示了具有500万至5,000万读数的覆盖深度≥10x、≥20x、≥50x和≥100x的靶标碱基的百分比。为了评估基于rna探针的dna双链捕获在ngs中的性能，使用该方法进行wes测定，并将数据与通过用标准外显子富集程序的标准ngs文库制备而获得的数据进行比较。所有文库均使用来自癌症患者正常组织的100ng基因组dna构建，并对每个样品进行3次技术重复。所有ngs运行均在相同的illuminahiseq2500平台上进行，并且具有相同的运行技术规格。如图10a所示，从基于rna探针的dna双链捕获的wes中平均获得了1.88亿个读数，其中98.3％与人类基因组一致，并且总读数计数比标准测序流水线的读数计数显著增加(1.6倍)。该文库的读数数量较高，大概是由于超灵敏的单链dna文库构建，以及更高效的可捕获两条dna链的基于rna探针富集设计(包括从较小的单链断裂损伤到双链的重大损伤的dna分子)。在相同的软件流水线上以相同的设置分析了所有ngs数据。过滤原始读数，以去除重复项、多个匹配、不正确的配对，和脱靶读数。过滤后平均保留75.4％的读数(图10a)。对于已去除的读数，有71.8％是脱靶读数，其被匹配到人类基因组但在靶标区域之外。pcr复制物占21.6％；以及剩下的读数被定位到基因组的多个位点或根本不定位(图10b)。在该实验中，在三个技术重复的所有规格测量中均未观察到统计学上的显著差异，这表明文库构建和基于rna探针的dna双链捕获流水线在技术上是高度可重复的(图10a和10b)。接下来，评估了基于rna探针的dna双链捕获文库中覆盖效率和测序深度之间的相关性。从500万到5000万的500万读数增量中随机选择经过滤的读数。使用随机选择的500至5000万个读数绘制覆盖至少10x、20x、50x和100x的深度的保留的靶上读数的分数(图10c)。2000万个读数可以覆盖近90％的目标碱基，深度不小于10倍。读数达5000万，至少以20倍覆盖了90％以上的目标碱基。覆盖的效率不仅取决于文库构建的效率，还取决于最初引入流水线中的经剪切分子的长度。对于当前的研究，经剪切的dna分子的平均长度为150bp。这些298个基因的组的实时pcr结果表明，文库构建方法的富集效率不受gc含量的显著影响(图8)。创建密度图以显示正常组织dna的基于rna探针的dna双链捕获的wes研究(图11a)和正常组织dna的dna库wgs研究(不富集全外显子组，图11b)中gc含量与归一化平均读取深度的比较。为了评估gc含量对wes结果的影响，针对gc含量绘制了标准化的平均读数深度。在wes实验中，gc含量与读数深度之间存在相关性(图11a)，并且在wgs研究中，这种偏差得以减少(图11b)。在该方法中，gc50％/gc20％的平均读取深度比为＝1.55，大大低于许多研究报告的2.0的比值，这表明该方法具有较低的gc偏差。实施例4snv的检测图9a示出以增加的读数计数阈值检测到的snv的总数。随着读数计数的增加，灵敏度会提高，但读数超过8000万后很快就会达到稳定状态。图9b显示了通过三种方法测得的正常组织dna的平均snv频率：标准ngs方法，其中直接修剪了条形码；没有匹配两条dna链的变体的基于条形码化的单链文库ngs的基于超级读数的方法(没有4步程序的最后一步)，以及基于条形码化的单链文库的ngs与两条链上的snv匹配的超级读数方法(执行4步程序中的所有步骤)。所有三种方法均使用基于rna探针的dna双链捕获wes进行。外显子组测序的最重要目标之一是鉴定引起疾病或具有临床意义的序列变体。为了评估文库构建和基于rna探针的dna双链捕获的序列变体鉴定性能的灵敏度和特异性，使用100ng基因组dna进行了wes研究，该dna来自同一癌症患者的一对正常和肿瘤组织样品。在这项研究中，相同的snv调用流水线用于所有数据分析。简而言之，对通过文库构建和基于rna探针的dna双链捕获方法创建的正常dna文库进行测序，并使用标准数据分析流水线对数据进行分析，在该数据流水线中直接修剪单链条形码，并以3000万读数计数从正常的dna样品的外显子序列中检测到78721个snv(错误频率2.6x10-3，图9a)。从正常组织dna的3000万读数中检测到的snv总数显著高于其他平台上报道的数量(clark,chenetal.2011)。接下来，进行进一步调查以检查使用标准的ngs数据分析工作流程鉴定出的snv是否存在任何偏差。转换率(ts/tv)比例通常用于评估新snp调用的特异性。基wes的标区域的ts/tv比经计算为2.766，高于wgs数据的已报道的2.0-2.1的ts/tv比例。在ccds外显子区域中确定的ts/tv比为3.225，其ts/tv比例落在对于已报道的外显子变体的3.0～3.3的范围内。全外显子组测序中基于rna探针的dna双链捕获具有比已报道的wgs研究更高的ts/tv比的原因是引物测序的靶区域富含外显子，并且内含子中仅包含utr和短侧翼序列。然后检查了通过基于nda的突变调用所富集的突变的准确性。按照“材料和方法”中介绍的4步数据分析程序，在步骤3)之后生成了超级读数。通过去除大多数pcr相关的错误，步骤1～3帮助将突变频率从2.6×10-3降低超过2个数量级，降至2.5×10-5(图9b)。该结果表明pcr相关的人工突变显著降低了ngs测序的准确性。为了使用ngs检测稀有突变，甚至是超稀有突变，必须对pcr错误进行校正。如第4步中所述，然后尝试通过使用互补dna链提供的冗余序列信息来进一步减少突变调用的人为错误，这些互补dna链最初来自同一dna双链体分子。这些结果表明，这种方法导致1.6x10-6的单碱基突变频率(图9b)。对于dna序列中的任何单个碱基，在配对位置上具有完全相同的人为错误的可能性为1/3x(2.5x10-5)2＝2.08x10-10，相当于每4.8x109个核苷酸一次人为错误。这是流水线的理论错误率。每个步骤后的dna序列数据总量和剩余数据量可在图14中找到，其中数据量的逐步下降与突变调用严格性的增加相关。为了确定针对临床相关突变的文库构建和基于rna探针的dna双链捕获的变体检测的准确性，以及并行地分析了从正常组织和肿瘤组织对产生的wes数据。对于所有评估的杂合外显子位置，将结果通过这样的4步程序进行过滤。经过滤结果表明，基于rna探针的dna双链捕获的wes研究鉴定了97种序列变体，这些变体是在肿瘤组织dna样品中唯一检测到的，具有s≥100x的覆盖率。对40个中度至高丰度(>5％)变体进行sanger测序验证，并确认38个(图15a-15e)。两个等位基因分数均较低且超出sanger测序检测极限的两个变体均未通过验证。由于sanger测序的灵敏度有限(tsiatis,norris-kirbyetal.2010)，因此57个序列变体(突变等位基因分数<5％)根本没有经过sanger测序验证。实施例5基于rna探针的dna双链捕获方案rna探针的产生通过基于hg19参考人类基因组序列的序列合成和分子克隆每个人类基因的全外显子组序列。简而言之，将含有-50bp和+50bp内含子序列的32,524个ccdsid中的外显子序列克隆到pcdna6.2载体中。用于产生rna探针的总dna序列覆盖72.6mb基因组区域，其中包括-50bp和+50bp侧翼内含子序列的所有外显子组，以及每个基因的5’和3’utr。构建每个靶序列的两个克隆，其中在“+”克隆的正链的5’末端和“-”克隆的负链的5’末端插入一个t7启动子(图4b和图7a和7b)。按照将相同dna序列的两个克隆分成两个系统的规则，针对任何给定数目的基因建立两个克隆库，通过体外转录，其中一个系统(图4b和图7a和7b，左图，“+”克隆)产生了靶向dna靶正链的rna探针，以及另一个系统(图4b和图7a和7b，右图，“-”克隆)产生了靶向dna靶负链的rna探针。ampliscribetmt7flashtm生物素rna转录试剂盒用于rna探针的产生和扩增如下制备混合物充分混合并在30℃孵育4小时。添加1μldnasei。在37℃孵育15分钟。使用2xrnaampure珠子纯化rna探针。洗脱至80μl。现在应该有150μg探针。超声处理rna产物以生成100-150ntrna片段作为探针开始之前至少45分钟打开bioruptor和水浴(设定为3℃)。将最多1μgrna(用1xte缓冲液调节至57μl)放入bioruptor微管中。按照以下设置剪切靶至100-150nt大小范围：设置值强度h开:关30：30循环35将探针与dna文库杂交在室温下将以下成分混合为dna文库+封闭混合物：4.3μldna文库(150ng/μl)3μl人cot-1dna(lifetechnologies15279-101)3μl鲑鱼精子(lifetechnologies15632-011)0.7μl定制的封闭寡核苷酸混合物(1000μm)，序列如下所示：封闭寡核苷酸1(如seqidno.913所示)封闭寡核苷酸2(如seqidno.914所示)通过吸移液体充分混合。将dna-文库+封闭混合物转移到384孔pcr板中。用microamp透明粘合膜(abi的目录号4306311)密封该板来紧密密封。短暂离心板，以收集孔底部的液体。运行以下热循环程序(用105℃加热的盖)：在95℃孵育5分钟；67.5℃永久将dna-文库+封闭混合物放入热循环仪后，立即准备杂交缓冲液。在室温下混合以下成分以制备杂交缓冲液：在67.5℃的热循环仪中使用384孔板，将24.5μl杂交缓冲液转移到板的新孔中，用粘合膜密封板。在准备rna-探针文库的同时，将杂交缓冲液在67.5℃下孵育至少5分钟(可能更长)。将杂交缓冲液放入热循环仪后，立即制备rna探针。在冰上混合以下成分以制备rna探针：在67.5℃的热循环仪中使用384孔板，将7μlrna探针转移到板的新孔中，用粘合膜密封板。用加热的盖子在75.5℃下将rna探针孵育2分钟。打开盖子，将板保持在75.5℃。取13μl预热的杂交缓冲液，并将其添加到rna探针中。将10μldna-探针+封闭混合物转移至rna探针。缓慢地上下吹打吸移液体以充分混合。杂交混合物应为～30μl。用双面粘合膜密封孔。用105℃加热的盖子下将杂交混合物在67.5℃下孵育12～48小时。提取杂交的rna-dna分子用200μl结合缓冲液(1mnacl、10mmtris-hcl，ph7.5和1mmedta)洗涤50μldynalmyone链霉亲和素c1磁珠(thermofisherscientific)在1.5ml微量离心管中洗涤3次并重悬于200μl结合缓冲液中。将整个杂交混合物直接从热循环仪中添加到珠子溶液中，然后将试管倒置以混合几次。将杂交混合物/珠子溶液旋转360度，在室温下放置15分钟。结合后，在dynal磁选机上将珠子与溶液分离，并除去上清液。洗涤程序在500μl洗涤缓冲液i(1×ssc/0.1％sds)中于室温下洗涤磁珠15分钟。将珠子在67.5℃的加热块上摇晃洗涤15分钟，在500μl67.5℃预热的洗涤缓冲液ii(0.1×ssc/0.1％sds)中洗涤3次。在室温下将珠子在50μl0.1mnaoh中混合10分钟。将上清液转移到新管中。加入50μl中和缓冲液(1mtris-hcl，ph7.5)。将经中和的dna脱盐并通过ampure微珠以1:1(微珠:样品)的比例浓缩，并在20μl1xte缓冲液中洗脱。捕获后扩增pcr混合物包含：(每个反应)经捕获的dna20μl水65μldmso2.5μl5xphusion缓冲液10μl10mmdntp1μl索引pe引物ii0.25μlpe引物ii0.25μl热启动phusion1μl充分混合扩增条件：每个样品在两个孔中进行pcr，每个孔50μl。然后，使用比例为1:1(珠子:样品)的ampure珠子纯化经扩增的pcr产物，并在30μl1xte缓冲液中洗脱。使用qubit定量产量。通常将会获得～20ng/μl。参考文献benjamini,y.andt.p.speed(2012)."summarizingandcorrectingthegccontentbiasinhigh-throμghputsequencing."nucleicacidsres40(10):e72.clark,m.j.,etal.(2011)."performancecomparisonofexomednasequencingtechnologies."natbiotechnol29(10):908-914.mckenna,a.,etal.(2010)."thegenomeanalysistoolkit:amapreduceframeworkforanalyzingnext-generationdnasequencingdata."genomeres20(9):1297-1303.meienberg,j.,etal.(2015)."newinsightsintotheperformanceofhumanwhole-exomecaptureplatforms."nucleicacidsres43(11):e76.tsiatis,a.c.,etal.(2010)."comparisonofsangersequencing,pyrosequencing,andmeltingcurveanalysisforthedetectionofkrasmutations:diagnosticandclinicalimplications."jmoldiagn12(4):425-432.untergasser,a.,etal.(2012)."primer3--newcapabilitiesandinterfaces."nucleicacidsres40(15):e115.vanallen,e.m.,etal.(2014)."whole-exomesequencingandclinicalinterpretationofformalin-fixed,paraffin-embeddedtumorsamplestoguideprecisioncancermedicine."natmed20(6):682-688.序列表<110>myomicsdx,inc王磬张明<120>用于核酸靶向富集的方法和试剂盒<130>pct05278001b<150>us62/482,189<151>2017-04-06<150>pct/us2018/016778<151>2018-02-04<160>914<170>patentinversion3.5<210>1<211>23<212>dna<213>智人<400>1gctcatttttgttaatggtggct23<210>2<211>27<212>dna<213>智人<400>2gaacaatgaataaaccattttgtctca27<210>3<211>20<212>dna<213>智人<400>3atcatgctgacgcttctcct20<210>4<211>27<212>dna<213>智人<400>4tgcagatttttaaaaagtctcttttcc27<210>5<211>27<212>dna<213>智人<400>5agttaataaggacatggtttctgttct27<210>6<211>26<212>dna<213>智人<400>6aggaaactagagttcattttcctttt26<210>7<211>21<212>dna<213>智人<400>7tcgcaagtctgaatcacaact21<210>8<211>27<212>dna<213>智人<400>8tgtgcattgagagtttttatactagtg27<210>9<211>21<212>dna<213>智人<400>9ccaggttagctggtaagagga21<210>10<211>27<212>dna<213>智人<400>10aagcttttcaggataatttctgttttt27<210>11<211>22<212>dna<213>智人<400>11aggatgatactggttgacacaa22<210>12<211>25<212>dna<213>智人<400>12tcagcttttccttaaagtcacttca25<210>13<211>27<212>dna<213>智人<400>13caccatatattaacttctgacatttgc27<210>14<211>25<212>dna<213>智人<400>14gctacaaaagagctcaacaattttt25<210>15<211>25<212>dna<213>智人<400>15gtga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